曹 楠,郭美錦,肖慈英

(華東理工大學(xué)生物工程學(xué)院,上海 200237)

龜裂鏈霉菌中選擇性σ因子lsigB在大腸桿菌中的異源表達(dá)及功能驗證

曹 楠,郭美錦*,肖慈英

(華東理工大學(xué)生物工程學(xué)院,上海 200237)

本文擴(kuò)增了龜裂鏈霉菌中選擇性調(diào)控因子的編碼基因lsigB,并在大腸桿菌中進(jìn)行異源表達(dá)。通過SDS-PAGE以及Western blotting方法鑒定LsigB蛋白后,在多種環(huán)境壓力下培養(yǎng)重組大腸桿菌。實驗結(jié)果表明,LsigB的表達(dá)使宿主菌對高溫、滲透壓、強(qiáng)氧化還原、乙醇以及多種抗生素脅迫的耐受性顯著提高。所以LsigB蛋白是一類能夠?qū)Νh(huán)境壓力產(chǎn)生應(yīng)答作用的調(diào)控因子,調(diào)控了菌體脅迫培養(yǎng)時的應(yīng)激反應(yīng)。同時本研究為深入研究LsigB蛋白在龜裂鏈霉菌中的抗逆性功能奠定基礎(chǔ)。

龜裂鏈霉菌,sigma因子,大腸桿菌

生長于土壤中的細(xì)菌常常處于不同的生長環(huán)境以及環(huán)境壓力下,經(jīng)過長期進(jìn)化,形成了一套完整的代謝調(diào)控機(jī)制,通過一系列嚴(yán)密有序的蛋白調(diào)控系統(tǒng)來應(yīng)對環(huán)境壓力的挑戰(zhàn),其中RNA聚合酶(RNAP)的一類亞基——sigma因子與RNA聚合酶核心酶的作用決定了胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄的開始[1-3]。最早發(fā)現(xiàn)的σB來自枯草芽孢桿菌,已有大量的文獻(xiàn)報道了其調(diào)控的壓力響應(yīng)相關(guān)的操縱子,從而調(diào)節(jié)了菌體對高溫、酸性環(huán)境、乙醇、高鹽、氧化脅迫等環(huán)境壓力的抗性[4-8]。大量的研究發(fā)現(xiàn)sigma因子能夠影響鏈霉菌屬對各種環(huán)境壓力的響應(yīng),調(diào)控其次級代謝產(chǎn)物的合成。天藍(lán)色鏈霉菌中sigT的缺失能加速菌體分化、提高抗生素產(chǎn)量,調(diào)節(jié)缺乏氮源時放線紫紅素的合成[9-10]；抗生鏈霉菌中sigE與放線菌素的合成相關(guān)[11]。在灰色鏈霉菌、委內(nèi)瑞拉鏈霉菌以及阿維鏈霉菌等中均存在此類報道[12-14]。

龜裂鏈霉菌(Streptomycesrimosus)作為土霉素的主要生產(chǎn)菌株[15]而受到廣泛關(guān)注,同時它也是番茄紅素的生產(chǎn)菌株[16],而番茄紅素是一種具有一定前景的新型功能性天然色素,同時具有抗癌抑癌的功效[17],對于預(yù)防各種成人病[18]、增強(qiáng)人體免疫系統(tǒng)以及延緩衰老[19]等都具有重要意義。所以,研究龜裂鏈霉菌中的sigma因子對于人類的健康及食用色素都具有一定意義。

本課題組已經(jīng)和英國Strathclyde大學(xué)Hunter教授課題組共同完成了模式菌S.rimousM4018基因組的測序,將其中一個可能與壓力應(yīng)激相關(guān)的σ因子的編碼基因命名為lsigB。本研究通過lsigB基因在大腸桿菌中的克隆表達(dá),鑒定其抗環(huán)境脅迫的功能,為后期深入研究LsigB蛋白在龜裂鏈霉菌中的調(diào)控機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌株和質(zhì)粒EscherichiacoliDH5α、EscherichiacoliBL21(DE3)和表達(dá)載體pET-28a(+) 實驗室保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基(g/L):氯化鈉10,蛋白胨10,酵母粉5,pH7.0。固體培養(yǎng)基中加入2%瓊脂,抗性培養(yǎng)基加入硫酸卡那霉素(50μg/mL)?？股?利發(fā)霉素(Rif)、硫酸阿普拉霉素(Apr)、硫酸鏈霉素(Str)、紅霉素(Ery)均為25μg/mL。

1.1.3 緩沖液 TBST(g/L):三羥甲基氨基甲烷(Tris)2.42,氯化鈉8,吐溫-20 10mL,pH7.5。轉(zhuǎn)膜緩沖液(g/L):甘氨酸 2.9,Tris 5.8,SDS 0.37,甲醇 200mL。封閉緩沖液(g/100mL TBST緩沖液):脫脂奶粉5。

1.1.5 實驗儀器 可見分光光度計721 上海第三分析儀器廠;pH計PHB-9901 AION儀器公司；雙垂直板電泳槽DYCZ-24D 北京六一儀器廠；冷凍離心機(jī)UNIVERSAL32R HetachI儀器公司；分析天平FA2004 上海天平儀器廠；PCR儀TGRADIENT Biometra儀器公司；凝膠成像系統(tǒng)TI 1 Biometra儀器公司；恒溫培養(yǎng)箱DHP-9082 上海華連醫(yī)療器械有限公司；恒溫水浴鍋DK-8D 上海華連醫(yī)療器械有限公司；低溫水浴鍋DC-0506 上海德洋意邦有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 基因組提取與基因片段的PCR擴(kuò)增 采用酚氯仿法提取S.rimosusM4018全基因組,并根據(jù)GenBank中公布的其LsigB序列設(shè)計一組引物。同時在NCBI上blast其氨基酸序列,查找與其相似程度較高的枯草芽孢桿菌、天藍(lán)色鏈霉菌、灰色鏈霉菌、阿維鏈霉菌sigma序列后進(jìn)行比對。

上游引物:5′-GGGAATTCCATATGTCCGTAGAA CTGGGCAGCTCGAAGGTG-3′(NdeI)

下游引物:5′-CCCAAGCTTTCAGTCGGAGATC AGCCCTTCGCGG-3′(HindⅢ)

以基因組為模板,采用上述引物擴(kuò)增lsigB基因時,擴(kuò)增條件為:預(yù)變性95℃,3min,然后按94℃ 30s；61℃ 30s；72℃ 1min循環(huán)35次；最后72℃延伸8min。將PCR擴(kuò)增出的基因片段連接到pMD19-T-Simple Vcetor上,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,用含Amp的平板進(jìn)行篩選,經(jīng)PCR檢測和測序鑒定陽性克隆得到質(zhì)粒pMD19T-lsigB。

我們要深入了解中國的傳統(tǒng)文化，不僅要對現(xiàn)有形象和門類進(jìn)行歸納，還要把思想理念和實物結(jié)合起來。比如2010年上海世博會的吉祥物海寶，它的造型是以中國漢字“人”為原型的，漢字是世界上最古老的文字之一，也是中國漢民族幾千年文化的瑰寶。漢字可以引起我們美妙而大膽的聯(lián)想，海寶“人”的造型還結(jié)合了中國傳統(tǒng)文化中“以人為本”的思想，包涵了“上善若水，海納百川”的理念。這兩個方面的融合，容易引起人們的共鳴，也具有更深遠(yuǎn)的影響，引發(fā)人們對中國文化的思考，更利于中國文化在世界上的傳播。

1.2.2 表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化NdeⅠ-HindⅢ雙酶切質(zhì)粒pMD19T-lsigB得到的lsigB片段與同樣雙酶切的載體pET28a(+)連接,得到重組質(zhì)粒pEB。將此重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,用含卡那霉素的平板進(jìn)行篩選,經(jīng)PCR檢測和測序鑒定陽性克隆。將陽性重組質(zhì)粒通過熱激法轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)中,用含卡那霉素的平板篩選,經(jīng)PCR檢測鑒定陽性克隆,得到重組菌株BL21(DE3)-pETB。

1.2.3 重組蛋白質(zhì)的表達(dá)及鑒定 分別將轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒pEB和轉(zhuǎn)入空白質(zhì)粒的大腸桿菌菌株轉(zhuǎn)接入4mL LB液體培養(yǎng)基(含終質(zhì)量濃度50μg/mL Kana)中培養(yǎng)。按接種量2%(體積分?jǐn)?shù))接種到含100mL LB(含50μg/mL Kana)搖瓶,37℃,230r/min條件下培養(yǎng)至OD600為0.3時,加入IPTG至終質(zhì)量濃度為100μg/mL,28℃,230r/min過夜誘導(dǎo),8000r/min,10min,4℃低溫離心收集菌體。

將凍存的細(xì)胞重懸于0.1mol/L PBS(pH=8)中,采用Sonics超聲波破碎儀對樣品進(jìn)行超聲破碎(破碎5s,間隔2.5s),離心后得上清。

聚丙烯酰胺凝膠電泳,采用12%的分離膠及5%的積層膠而后在垂直電泳槽中以上樣,以100V電泳至蛋白進(jìn)入分離膠后,以120V電泳,經(jīng)染色半小時后脫色,觀察特異性目的條帶。

Western blotting鑒定LsigB蛋白時,首先通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白樣品。電泳結(jié)束后,將凝膠修理至合適的大小,放入膜轉(zhuǎn)移緩沖液中浸泡。裁剪大小合適的0.4μm的PVDF膜濾,并于甲醇中浸泡30s,然后搭建轉(zhuǎn)膜裝置,在300mA恒流下冰浴電轉(zhuǎn)50min。經(jīng)脫脂奶粉封閉、洗滌后,加入一抗孵育1h,PBS洗滌三次,再加入二抗孵育孵育1h,PBS洗滌三次,最后進(jìn)行顯影。

1.2.4 LsigB的抗逆性功能分析 生長曲線的繪制:將保種重組菌的E.coliBL21(DE3)/pEB與對照菌株E.coliBL21(DE3)/pET28a接種于LB(含50μg/mL kan)培養(yǎng)基,37℃,220r/min培養(yǎng)12h,按1%的接種量培養(yǎng)于100mL LB液體培養(yǎng)基,每小時取樣,測定發(fā)酵液的與OD600nm處的吸光度,此波長下濁度可以衡量細(xì)菌細(xì)胞密度。

重組菌株E.coliBL21(DE3)/pEB對多種環(huán)境脅迫培養(yǎng):將保種重組菌的E.coliBL21(DE3)/pEB及對照菌株接種于LB培養(yǎng)基,37℃,220r/min培養(yǎng)12h。將菌體全部離心作為種子,將種子重懸于新鮮LB培養(yǎng)基培養(yǎng),使其初始OD600nm為0.3,接種后加入IPTG使其終濃度為1mmol/L,放置于不同溫度的搖床,或者在培養(yǎng)基中添加NaCl、H2O2、乙醇或者抗生素后培養(yǎng),每隔1h取樣,測其生長曲線。

2 結(jié)果與討論

2.1 LsigB蛋白序列的同源性分析及功能預(yù)測

圖1 LsigB保守區(qū)域分析Fig.1 Analysis of the conserved domains of LsigB

圖2 LsigB蛋白與其他σB蛋白的同源性比對Fig.2 Anlignment of amino acid sequence of LsigB with other sigBs

根據(jù)GenBank報道的lsigB基因組列分析,該基因是龜裂鏈霉菌中的一個潛在的σ因子,利用NCBI的BLAST程序中的蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析可以得出LsigB有三個屬于σ70家族的保守結(jié)構(gòu)域:σ2,σ3,σ4(見圖1),這表明LsigB屬于σ70家族的第三類選擇性σ因子[19]。同時將LsigB的氨基酸序列與來自枯草芽孢桿菌,天藍(lán)色鏈霉菌,阿維鏈霉菌,以及灰色鏈霉菌中的σB因子比對,結(jié)果(圖2)表明,該LsigB因子可能是一個σB類似蛋白,在環(huán)境壓力下具有應(yīng)激功能。

2.2lsigB基因的擴(kuò)增與質(zhì)粒構(gòu)建

lsigB基因序列全長為837bp,開放閱讀框內(nèi)編碼278個氨基酸,理論分子量約為30700u。以提取的M4018基因組為模板擴(kuò)增lsigB基因,經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,所得PCR產(chǎn)物與預(yù)期相符,如見圖3。連接pMD19-T載體后送公司測序驗證。

圖3 lsigB PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳分析 Fig.3 Agarose gel electrophoresis analysis of the PCR product注：M-2000bp DNA Marker;1-lsigB PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

用NdeⅠ-HindⅢ雙酶切經(jīng)測序驗證正確的質(zhì)粒pMD19T-lsigB,同時雙酶切處理表達(dá)載體pET-28a(+),將二者用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接,構(gòu)建了重組表達(dá)載體pEB。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后提取質(zhì)粒,雙酶切驗證(如圖4所示)后,獲得正確的重組表達(dá)載體pEB。

圖4 重組質(zhì)粒的驗證Fig.4 Identification of recombinant plasmid注：M 15000bp DNA Marker;1-NdeⅠ-Hind Ⅲ雙酶切重組質(zhì)粒 pET28a-lsigB;2-NdeⅠ-Hind Ⅲ雙酶切質(zhì)粒pET28a。

2.3lsigB大腸桿菌BL21(DE3)重組菌的表達(dá)及SDS-PAGE、Western blotting分析

將重組表達(dá)載體pEB轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3),獲得重組菌BL21(DE3)/pEB。重組菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后用于SDS—PAGE電泳分析,結(jié)果表明,重組菌株與含有pET28a空載體的對照菌株相比,有一條分子量大小約為31ku的特征條帶(如圖5),與LsigB蛋白的預(yù)計大小相符。利用western blotting進(jìn)一步驗證(圖5),只在30ku附近有特征條帶,表明龜裂鏈霉菌LsigB蛋白在大腸桿菌BL21(DE3)成功表達(dá)。

圖5 重組菌株表達(dá)產(chǎn)物的 SDS-PAGE電泳及Western Blotting分析Fig.5 SDS-PAGE and Western Blotting analysis of expression products注：(A)SDS-PAGE電泳分析；M-蛋白質(zhì)分子量Marker；1-大腸桿菌BL21(DE3)/pET28a(+)所表達(dá)的蛋白；2-未誘導(dǎo)的大腸桿菌BL21(DE3)/pEB所表達(dá)的蛋白；3-誘導(dǎo)的大腸桿菌BL21(DE3)/pEB所表達(dá)的蛋白。(B)Western blotting分析. M-預(yù)染蛋白質(zhì)分子量Marker；1誘導(dǎo)的大腸桿菌BL21(DE3)/pEB所表達(dá)的蛋白。

2.4 LsigB功能的鑒定

2.4.1 大腸桿菌BL21(DE3)生長曲線的繪制 經(jīng)培養(yǎng)可見對照菌株與重組大腸桿菌的生長曲線趨勢基本一致,這表明lsigB基因的轉(zhuǎn)入沒有影響大腸桿菌BL21(DE3)的生長,因此可以說明在LsigB蛋白不表達(dá)的情況下,重組菌BL21(DE3)/pEB的生長沒有受到顯著影響。

圖6 無IPTG誘導(dǎo)條件下重組菌 BL21(DE3)/pEB的生長曲線Fig.6 The growth curve of BL21(DE3)/pEB without IPTG inducing

2.4.2 大腸桿菌BL21(DE3)在ITPG誘導(dǎo)下生長曲線的繪制 重懸菌體接種新鮮的LB培養(yǎng)基中后加入終濃度為1mmol/L IPTG誘導(dǎo),測其生長曲線(如圖7),此時可見E.coli/pEB此時最高OD能夠達(dá)到3.0,而E.coli/pET28a此時最高OD為1.58。本組實驗結(jié)果可作為環(huán)境脅迫中重組菌耐受性培養(yǎng)的對照實驗。

圖7 IPTG誘導(dǎo)條件下重組菌 BL21(DE3)-pEB的生長曲線Fig.7 The growth curve of BL21(DE3)-pEB with IPTG inducing

圖8 菌株對高溫脅迫耐受性分析Fig.8 The growth curve of BL21(DE3)/pEB and BL21(DE3)/pET28a at different temperature注：A 45℃,B 50℃。

2.4.3 重組菌株BL21(DE3)/pEB對溫度耐受性培養(yǎng) 大腸桿菌的生長溫度范圍為7～49.5℃,最適生長溫度為37℃。加入IPTG誘導(dǎo)后測其生長曲線(如圖8)。實驗結(jié)果表明,LsigB的表達(dá)顯著提高了大腸桿菌對溫度壓力的耐受性,尤其改善了重組大腸桿菌在其極限生長溫度50℃的生長情況。

2.4.4 重組菌株BL21(DE3)/pEB對滲透壓耐受性分析 鹽類對細(xì)菌的抑制作用主要與滲透壓有關(guān)。調(diào)節(jié)新鮮的LB培養(yǎng)基中NaCl的濃度分別至0.3、0.5、0.7mol/L,此時培養(yǎng)基的滲透壓分別為664、1142、1467mOsm/kg,而正常的LB培養(yǎng)基的滲透壓為433,此時觀察重組菌與對照菌的生長情況。結(jié)果表明(圖9)LsigB蛋白的表達(dá)有利于大腸桿菌在滲透壓壓力條件下的生長。

圖9 菌株對滲透壓耐受性分析Fig.9 The growth curve of BL21(DE3)/pEB and BL21(DE3)/pET28a under different osmotic pressure

2.4.5 重組菌株BL21(DE3)/pEB對氧化脅迫耐受性分析 采用H2O2作為氧化脅迫因子,以其生長情況表征菌株的抗氧化脅迫能力。分別新鮮的LB培養(yǎng)基中加入,8mmol/L的H2O2。結(jié)果如圖10所示,所以LsigB的表達(dá)能夠顯著提高大腸桿菌對氧化脅迫的耐受性。

圖10 菌株對氧化脅迫耐受性分析Fig.10 The growth curve of BL21(DE3)-pEB and BL21(DE3)-pET28a under different redox pressure

2.4.6 重組菌株BL21(DE3)-pEB對乙醇耐受性分析 大腸桿菌生長的乙醇極限濃度約為6.5%(v/v)。由大腸桿菌BL21(DE3)在ITPG誘導(dǎo)下生長曲線與本實驗的結(jié)果(圖11)比較可見,LsigB蛋白的表達(dá)并未能提高大腸桿菌對乙醇的耐受極限,但在乙醇濃度較低(2.5%)的情況下,大腸桿菌的生長情況得到明顯改善。

圖11 菌株對乙醇耐受性分析Fig.11 The growth curve of BL21(DE3)-pEB and BL21(DE3)-pET28a under different concentration of ethanol

2.4.7 重組菌株BL21(DE3)-pEB對各抗生素耐受性分析 抗生素的殺菌作用和細(xì)菌的抗藥性是自然界長期進(jìn)化的結(jié)果,許多研究結(jié)果表明,σB在微生物抗生素抗性方面起到了重要作用。作為一個σB家族的調(diào)控因子,lsigB可能同樣在一定程度上調(diào)節(jié)重組大腸桿菌的抗生素抗性。實驗結(jié)果顯示(圖12),LsigB的表達(dá)顯著提高了重組菌對紅霉素的抗性,同時,也使得重組菌對利發(fā)霉素、硫酸阿布拉霉素、硫酸鏈霉素的抗性有所提升。

圖12 菌株對抗生素耐受性分析Fig.12 The growth curve of BL21(DE3)-pEB and BL21(DE3)-pET28a under different kinds of antibiotics

3 結(jié)論

研究環(huán)境響應(yīng)因子對于研究原核以及真核生物在環(huán)境壓力下的應(yīng)激反應(yīng)具有重要意義,同時由于該類因子對于微生物次級代謝的影響,使其成為研究各種動植物病原菌致病性、微生物次級代謝產(chǎn)物的關(guān)鍵。本文以龜裂鏈霉菌基因組DNA為模板,在大腸桿菌BL21(DE3)中成功表達(dá)了抗環(huán)境脅迫因子lsigB,表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE、Western blotting分析鑒定為LsigB蛋白。

通過對重組大腸桿菌的多種環(huán)境脅迫培養(yǎng),可以發(fā)現(xiàn)lsigB基因明顯提高了大腸桿菌對高溫的耐受能力,使其在極限溫度50℃下仍然能夠存活。同時,該基因增強(qiáng)了高滲耐受性,在加入了氯化鈉,滲透壓達(dá)到1142mOsm/kg培養(yǎng)條件下,重組菌表現(xiàn)出了較強(qiáng)的適應(yīng)性。當(dāng)培養(yǎng)環(huán)境中的雙氧水濃度為8mmol/L時,重組菌的生長情況體現(xiàn)了LsigB的抗氧化脅迫作用。LsigB蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)也使重組菌對乙醇及多種抗生素壓力產(chǎn)生了更強(qiáng)的抗性,并使得重組菌對利福平霉素、硫酸阿布拉霉素、硫酸鏈霉素的抗性有所提升。這些lsigB的功能性研究為進(jìn)一步研究該基因在龜裂鏈霉菌中的功能提供了依據(jù)。此外由于His標(biāo)簽的添加,能夠方便的分離純化LsigB,為更好的研究其結(jié)構(gòu)、酶學(xué)性質(zhì)、相關(guān)的DNA結(jié)合位點以及生物學(xué)特性等奠定了基礎(chǔ)。

[1]W?sten M. Eubacterial sigma-factors[J]. FEMS microbiology reviews,1998,22(3):127-150.

[2]Gruber T M,Gross C A. Multiple sigma subunits and the partitioning of bacterial transcription space[J]. Annual Reviews in Microbiology,2003,57(1):441-466.

[3]白卉,閆華,侯征,等. 細(xì)菌 RNA 聚合酶亞單位研究進(jìn)展[J]. 生理科學(xué)進(jìn)展,2011,42(1):47-51.

[4]Hecker M,V?lker U. Non-specific,general and multiple stress resistance of growth-restrictedBacillussubtiliscells by the expression of the σBregulon[J]. Molecular Microbiology,1998,29(5):1129-1136.

[5]Antelmann H,Engelmann S,Schmid R,etal. General and oxidative stress responses inBacillussubtilis:cloning,expression,and mutation of the alkyl hydroperoxide reductase operon[J]. Journal of Bacteriology,1996,178(22):6571-6578.

[6]Antelmann H,Engelmann S,Schmid R,etal. Expression of a stress-and starvation-induceddps/pexB-homologous gene is controlled by the alternative sigma factor sigma B inBacillussubtilis[J]. Journal of Bacteriology,1997,179(23):7251-7256.

[7]Hecker M,Pané-Farré J,Uwe V. SigB-dependent general stress response in Bacillus subtilis and related gram-positive bacteria[J]. Annu Rev Microbiol,2007,61:215-236.

[8]Engelmann S,Lindner C,Hecker M. Cloning,nucleotide sequence,and regulation of katE encoding a sigma B-dependent catalase inBacillussubtilis[J]. Journal of Bacteriology,1995,177(19):5598-5605.

[9]Mao X M,Zhou Z,Cheng L Y,etal. Involvement of SigT and RstA in the differentiation ofStreptomycescoelicolor[J]. FEBS Letters,2009,583(19):3145-3150.

[10]Feng W H,Mao X M,Liu Z H,etal. The ECF sigma factor SigT regulates actinorhodin production in response to nitrogen stress inStreptomycescoelicolor[J]. Applied Microbiology and Biotechnology,2011,92(5):1009-1021.

[11]Jones G H,Paget M S B,Chamberlin L,etal. Sigma-E is required for the production of the antibiotic actinomycin inStreptomycesantibioticus[J]. Molecular Microbiology,1997,23(1):169-178.

[12]Hiroshi Otani,Akiyoshi Higo,Hideaki Nanamiya,etal. An alternative sigma factor governs the principal sigma factor inStreptomycesgriseus[J]. Molecular Microbiology,2013,87(6):1223-1236.

[13]Bibb M J,Domonkos á,Chandra G,etal. Expression of the chaplin and rodlin hydrophobic sheath proteins inStreptomycesvenezuelaeis controlled by σBldN and a cognate anti-sigma factor,RsbN[J]. Molecular Microbiology,2012,84(6):1033-1049.

[14]Jiang L,Liu Y,Wang P,etal. Inactivation of the extracytoplasmic function sigma factor Sig6 stimulates avermectin production inStreptomycesavermitilis[J]. Biotechnology Letters,2011,33(10):1955-1961.

[15]Malpartida F,Hopwood D A. Molecular cloning of the whole biosynthetic pathway of a Streptomyces antibiotic and its expression in a heterologous host[J]. 1984.

[16]王敏,楊慧,高俊蓮,等. 高產(chǎn)番茄紅素鏈霉菌選育及搖瓶發(fā)酵研究[J]. 中國生物工程雜志,2009(12):64-68.

[17]Silberstein T,Silberstein E,Saphier O.Lycopene and tomatoes--their effect on prevention of prostatic cancer[J]. Harefuah,2013,152(8):461-3,499.

[18]Ilic D. Lycopene for the Prevention and Treatment of Prostate Disease[M]//Prostate Cancer Prevention. Springer Berlin Heidelberg,2014:109-114.

[19]Gloria N F,Soares N,Brand C,etal. Lycopene and Beta-carotene Induce Cell-Cycle Arrest and Apoptosis in Human Breast Cancer Cell Lines[J]. Anticancer research,2014,34(3):1377-1386.

Expression and functional analysis of an alternative sigma factor,

lsigBofStreptomycesrimousinE.coliCAO Nan ,GUO Mei-jin*,XIAO Ci-ying

(College of Biotechnology,East China University of Science and Technology,Shanghai 200237,China)

In this research,the genelsigBencoding regulatory factors fromStreptomycesrimosuswas heterologous expressed inE.coli. After the identification of LsigB protein by SDS-PAGE and Western blotting,recombinantE.coliwas cultured under a variety of environment stress. The results showed that the expression of LsigB significantly enhanced the stress resistance of recombinant strains to heat,ehanol,oxygen and salt stress,together with antibiotic pressure. Therefore,the main function of LsigB respoding to environmental stress was demonstrated. Meanwhile,the study was to lay foundation for researching the resistance function of LsigB inStreptomycesrimosus.

Streptomycesrimous;sigma factor;Escherichiacoli

2014-04-08

曹楠(1988-),女,碩士研究生,研究方向:分子生物學(xué)。

*通訊作者:郭美錦(1971-),女,博士，教授,研究方向:微生物生理代謝分子調(diào)控、動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)與生物反應(yīng)器設(shè)計、藻細(xì)胞光培養(yǎng)生理與過程優(yōu)化等。

TS201.3

A

1002-0306(2015)03-0142-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.03.021