黃瑞娜 吳鏗 游瓊 李騰 李上海 郭潤(rùn)民 閆海

柚皮苷通過(guò)調(diào)控GSK-3β表達(dá)對(duì)糖尿病心肌病大鼠模型的心肌保護(hù)作用研究

黃瑞娜 吳鏗 游瓊 李騰 李上海 郭潤(rùn)民 閆海

目的 明確柚皮苷是否通過(guò)調(diào)控糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)通路對(duì)抗糖尿病心肌病心肌損傷。方法 將60只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、糖尿病心肌病組(DCM組)、柚皮苷組、 TDZD-8(GSK-3β抑制劑)組, 各15例。各組經(jīng)處理后, 檢測(cè)血糖, 超聲心動(dòng)圖檢測(cè)左心室功能參數(shù), 免疫組織化學(xué)檢測(cè)心肌組織GSK-3β表達(dá)。結(jié)果 實(shí)驗(yàn)第12周, 與柚皮苷組、TDZD-8組比較, DCM組血糖升高, 左心室舒張期末內(nèi)徑(LVDD)、左心室收縮期末內(nèi)徑(LVDS)增大, 左心室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)下降, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 柚皮苷在有效調(diào)節(jié)糖代謝的同時(shí), 下調(diào)GSK-3β表達(dá)而心功能惡化。

糖尿病心肌病；柚皮苷；糖原合成酶激酶3β；心功能

目前有研究顯示, 抑制GSK-3β通路, 可有效改善大鼠糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy, DCM)的癥狀［1］。近年來(lái)已有研究證實(shí)柚皮苷可有效防治糖尿病心肌?。?］。本實(shí)驗(yàn)以鏈脲霉素誘導(dǎo)的 DCM 大鼠模型為對(duì)象, 研究柚皮苷是否通過(guò)調(diào)控GSK-3β通路保護(hù)DCM心肌細(xì)胞。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級(jí)Wister 大鼠, 雄性, 體重150～180 g (合格證號(hào)SCXK 粵2006-0015), 由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.2 主要藥物與試劑 Naringin粉沫(廣東省梅雁藍(lán)藻公司, 純度98%)；鏈脲佐菌素(美國(guó)SIGMA公司)；血糖試紙(強(qiáng)生“中國(guó)”醫(yī)療器材有限公司)；兔GSK-3βBeta多克隆抗體(上海恒斐生物科技有限公司)；TDZD-8(GSK-3β抑制劑) (上海甄準(zhǔn)生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 分組與處理 將60只Wister大鼠隨機(jī)分為以下四組：對(duì)照組、DCM組、柚皮苷組、TDZD-8組, 各15只。對(duì)照組予普通飼料喂養(yǎng), 其余均高糖高脂飼養(yǎng)6周, 在第6周時(shí),對(duì)照組同時(shí)采用檸檬酸緩沖液腹腔注射, 一次性腹腔注射鏈脲佐菌素(ST.60 mg/kg, 臨用前用0.1 mol/L枸櫞酸緩沖液溶解, pH =4.2)腹腔注射；注射72 h后, 如連續(xù)2次空腹血糖>11.1 mmol/L 視為糖尿病模型成功。隨后6周, 柚皮苷組每天予柚皮苷100 mg/(kg·次)灌胃1次, TDZD-8組每天靜脈注射1次TDZD-81 mg/(kg·次), 對(duì)照組及DCM組每天予生理鹽水灌胃1次。對(duì)照組繼續(xù)予普通飼料喂養(yǎng), 其余均繼續(xù)高糖高脂飼養(yǎng)6周, 此時(shí)DCM模型成功。

1.2.2 左心室功能參數(shù)檢測(cè) 使用GE Vividi便攜式心臟彩超(探頭頻率為12 MHz)分別于動(dòng)物造模前及實(shí)驗(yàn)第12周分別行超聲心動(dòng)圖檢查, 測(cè)量LVED、LVES、LVPWT及LVEF。每組數(shù)據(jù)均取連續(xù)3個(gè)心動(dòng)周期的平均值。

1.2.3 心肌組織GSK-3β 免疫組織化學(xué)檢測(cè)石蠟切片經(jīng)兔GSK-3βBeta多克隆抗體, DAB 顯色后, 采用Moti.6.0 數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)測(cè)定陽(yáng)性光密度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示, 采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率(%)表示, 采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)各組大鼠空腹血糖的變化 一次性腹膜腔內(nèi)注射小劑量鏈脲佐菌素72 h后, 柚皮苷組及TDZD-8組及DCM組血糖明顯升高, 血糖>11.1 mmol/L, 可認(rèn)為糖尿病模型造模成功。實(shí)驗(yàn)第12周, 柚皮苷組及TDZD-8組血糖降低,與DCM組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.2 超聲心動(dòng)圖檢測(cè)結(jié)果 DCM組12周時(shí)LVDD、LVDS增大, LVEF下降, 與動(dòng)物造模前及對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 提示糖尿病心肌病模型制備成功。柚皮苷組及TDZD-8組LVDD、LVDS、LVEF等與動(dòng)物造模前及對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05), 與DCM組12周時(shí)結(jié)果比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表1 各組空腹血糖比較±s, mmol/L)

表1 各組空腹血糖比較±s, mmol/L)

注： 與對(duì)照組比較,aP<0.05；與DCM組比較,bP<0.05

組別例數(shù)0周STZ i.p.后72 h12周對(duì)照組154.93±0.865.29±0.655.21±0.71 DCM組155.03±0.7315.44±1.88a18.64±4.85a柚皮苷組154.81±0.8814.64±1.45a12.17±2.77abTDZD-8組155.08±0.7016.05±1.99a12.81±2.93ab

表2 各組超聲心動(dòng)圖比較(n=15,±s, mm)

表2 各組超聲心動(dòng)圖比較(n=15,±s, mm)

注：與對(duì)照組比較,aP<0.05,bP>0.05；與DCM組比較,cP<0.05

項(xiàng)目時(shí)間對(duì)照組DCM組柚皮苷組TDZD-8組LVPWT0周2.33±0.242.13±0.332.28±0.212.19±0.2312周2.21±0.212.43±0.252.17±0.172.21±0.23 LVDD0.5.33±1.215.21±1.245.18±1.535.29±1.2312周5.30±1.1.6.88±1.69a.5.21±1.12bc.5.26±1.22bcLVDS0周3.33±1.223.41±1.343.29±1.283.39±1.1312周3.21±1.194.86±1.39a3.27±1.37bc3.32±1.28bcLVEF0周 0.70±0.170.73±0.130.69±0.210.71±0.1512周0.70±0.19 0.47±0.23a0.67±0.27bc0.68±0.21bc

2.3 心肌細(xì)胞GSK-3β的表達(dá) 采用CMIAS系列 Motic. Med6.0數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖象分析系統(tǒng)測(cè)量表示GSK-3β表達(dá)水平的陽(yáng)性目標(biāo)面光密度值, 柚皮苷組及TDZD-8組GSK-3β表達(dá)明顯低于DCM組, 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；DCM組高于對(duì)照組(P<0.05)。由此表明, 柚皮苷及GSK-3β抑制劑能夠抑制GSK-3β表達(dá)。各組PKC的陽(yáng)性目標(biāo)面密度值的比較見(jiàn)表3。

表3 各組PKC的陽(yáng)性目標(biāo)面密度值的比較( χ-±s)

3 討論

糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase3β, GSK-3β)是真核細(xì)胞內(nèi)一種多功能絲氨酸、蘇氨酸蛋白激酶, 參與糖原合成酶、電壓依賴(lài)性陰離子通道等50多種底物的活化［3］, 并參與調(diào)控糖代謝、 脂代謝、 細(xì)胞增殖和死亡等過(guò)程［4］。本研究中, DCM組較TDZD-8組血糖升高, 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 心臟功能惡化。在大鼠DCM模型, 抑制GSK-3β通路, 可改善糖脂代謝和胰島素作用減輕糖脂毒性；從而改善DCM的癥狀［1,2］。所以, 有效調(diào)控GSK-3β的表達(dá)對(duì)糖尿病心肌病的心肌保護(hù)具有重大意義。

近年來(lái)研究證實(shí)糖尿病心肌病經(jīng)柚皮苷干預(yù)后心肌肥厚、心肌損傷、心力衰竭減輕, 同時(shí)柚皮苷作用效應(yīng)具有劑量依賴(lài)性［2,5］。本研究顯示柚皮苷及GSK-3β抑制劑在有效調(diào)節(jié)糖代謝的同時(shí), 可改善心功能惡化, 而且兩者間效應(yīng)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。另外柚皮苷組及TDZD-8組GSK-3β表達(dá)較DCM組明顯下降, 但兩者間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。因此作者認(rèn)為柚皮苷通過(guò)有效調(diào)控GSK-3β表達(dá)而起到糖尿病心肌病心肌保護(hù)作用。

［1］ Yu W, Wu J, Cai F, etal. Curcumin alleviates diabetic cardiomyopathy in experimental diabetic rats. Plos One,2012.7(12):1411.

［2］ 游瓊, 吳鏗, 涂焰明, 等. 柚皮苷調(diào)控心肌核因子NF-κB 炎癥信號(hào)通路對(duì)糖尿病心肌病大鼠防治作用 . 中國(guó)免疫學(xué)雜志,2013,29(2):121-124.

［3］ Martel C, Allouche M, Esposti DD, etal. Glycogen synthase kinase3-mediated voltage-dependent anion channel phosphorylation controls outer mitochondrial membrane permeability during lipid accumulation. Hepatology,2013.57(1):93-102.

［4］ Takahashi-Yanaga F. Activator or inhibitor? GSK-3 as a new drug target. Biochemical pharmacology,2013.86(2):191-199.

［5］ 吳鏗, 黃瑞娜, 游瓊, 等. 柚皮苷對(duì)糖尿病心肌病大鼠心肌的保護(hù)作用. 國(guó)際心血管病雜志,2012,39(5):302-305.

Research of protective effect by naringin for myocardium in diabetic cardiomyopathy rats by regulating expression of GSK-3β

HUANG Rui-na, WU Keng, YOU Qiong, etal.
Department of Cardiovascular Medicine, Affiliated Hospital of Guangdong Meidcal College, Zhanjian.524001, China

Objective To explore the approach of naringin in prevention of myocardial damage in diabetic cardiomyopathy by regulating expression of Glycogen synthase kinase3β (GSK-3β). Methods A total o.60 rats were randomly divided into control group, diabetic cardiomyopathy group (DCM group), naringin group, and TDZD-8 (GSK-3β inhibitor) group, and each group contained15 cases. Detections were made on blood glucose, left ventricular function parameters by ultrasonic cardiogram, GSK-3β expression in myocardial tissue by immunohistochemical method. Results In the12 weeks of experiment, DCM group had increased blood glucose, left ventricular diastolic diameter (LVDD), left ventricular diameter systolic (LVDS), and decreased left ventricular ejection fraction (LVEF) then the naringin group and TDZD-8 group. Their differences hadstatistical significance (P<0.05). Conclusion Naringin can effective regulate glycometabolism, along with reduce expression of GSK-3β for reduced cardiac function.

Diabetic cardiomyopathy; Naringin; Glycogen synthase kinase3β; Cardiac function

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2015.11.181

2015-03-20］

524001 廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科

吳鏗