劉變利

(西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院，陜西西安710004)

宮頸癌發(fā)病率僅次于乳腺癌，是女性常見的惡性腫瘤之一。浸潤與轉(zhuǎn)移是宮頸癌難以根治的主要原因，而淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是其主要轉(zhuǎn)移途徑，在很大程度上決定宮頸癌的預(yù)后效果[1]。淋巴管密度(lymphatic vessel density，LVD)是評估腫瘤組織中淋巴管生成的重要指標(biāo)，對預(yù)測評估淋巴管轉(zhuǎn)移風(fēng)險及預(yù)后有重要作用[2]。D2－40單克隆抗體可以與淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生反應(yīng)，能夠特異性標(biāo)記淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞而排除血管內(nèi)皮[3]，在淋巴管生成情況的檢測中發(fā)揮著重要的指示作用。高遷移率族蛋白B1(high mobility group protein box－1，HMGB1)為一種轉(zhuǎn)錄因子，在多種腫瘤組織中高表達(dá)，參與腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移、新生血管生成、淋巴管生成等生理活動，阻斷HMGB1信號通路可以抑制小鼠移植瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移[4]。本研究用免疫組化法用D2－40標(biāo)記LVD，利用Western blot法檢測HMGB1表達(dá)情況，探討宮頸癌組織中LVD與HMGB1表達(dá)的關(guān)系，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 臨床資料

1.1 一般資料 選取2008—2010年于我院就診的接受手術(shù)切除的宮頸癌患者86例，術(shù)前均未接受其他腫瘤治療手段，腫瘤分期及病理類型明確，為原發(fā)性癌癥，且其他器官無嚴(yán)重病變;患者知情同意，臨床資料完善。排除術(shù)前接受過藥物、放化療等治療者，合并其他腫瘤疾病者，臨床資料不完整者。年齡25～72(40.13±7.58)歲;FIGO 分期:TNMⅠ +Ⅱ期41例，Ⅲ+Ⅳ期45例;高中分化39例，低分化47例。患者診斷均經(jīng)病理科2位以上專家確認(rèn)，手術(shù)取樣每個樣本取2份，每份樣品包括正常組織和癌組織，一份用于免疫組化檢測，一份用于Western blot檢測。

1.2.2 －40檢測 所取新鮮組織經(jīng)4%多聚甲醛固定12～24 h，用乙醇進(jìn)行梯度脫水后用二甲苯進(jìn)行透明處理，透明后用石蠟進(jìn)行包埋。包埋的蠟塊切成5 μm厚度的組織切片，用10 mmol/L檸檬酸溶液進(jìn)行抗原修復(fù)，3%H2O2消除內(nèi)源性過氧化物酶。一抗采用鼠抗人單克隆抗體D2－40(北京中杉金橋生物)，陰性一抗用抗體稀釋液代替。所用試劑盒及蘇木素購自福建邁新，免疫組化及DAB染色按照試劑盒說明書進(jìn)行，蘇木素染核經(jīng)二甲苯透明后用中性樹脂進(jìn)行封片。

1.3 HMGB1表達(dá)檢測 取新鮮組織，用PBS洗掉多余的血液，用ELB裂解液裂解，破碎，12000 r/min 4℃離心20～30 min后，測定蛋白濃度。加入 loading buffer煮沸，經(jīng) SDSPAGE電泳，電轉(zhuǎn)，牛奶封閉，孵育一抗和二抗，過程中用TBST洗膜，ECL顯影，對Western顯色條帶進(jìn)行定量分析。

1.4 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

1.4.1 D2－40陽性標(biāo)準(zhǔn) 細(xì)胞漿染色呈棕黃色或褐色。在光學(xué)顯微鏡下淋巴管呈閉塞或擴(kuò)張的條索狀，管壁覆蓋單層上皮細(xì)胞，周圍無清晰的平滑肌細(xì)胞和基底膜，管內(nèi)無紅細(xì)胞。

1.4.2 D2－40標(biāo)記淋巴管計數(shù)[5]首先在低倍視野內(nèi)(100×)找到癌組織部位高密度的淋巴管區(qū)域，再在400×的顯微鏡下對淋巴管數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計，計數(shù)過程中單個著色內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞團(tuán)視為一個淋巴管，每個樣本選取5個視野，計算后取平均值即為該樣本的淋巴管個數(shù)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 用SPSS 18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，采用t檢驗(yàn)，LVD與HMGB1表達(dá)相關(guān)性用Pearson線性相關(guān)分析進(jìn)行，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 D2－40標(biāo)記的LVD表現(xiàn) 宮頸癌組織中淋巴管壁薄形態(tài)不規(guī)則，管腔增大，其內(nèi)無紅細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞及血管內(nèi)皮無著色，淋巴管主要位于周邊區(qū)間質(zhì)中，較正常組織增多，癌組織中心無新生淋巴管，見圖1。正常宮頸組織中淋巴管形態(tài)規(guī)則，管壁薄，血管內(nèi)皮無著色，見圖2。

圖1 D2－40標(biāo)記的LVD在宮頸癌組織中的形態(tài)(SP 10×20)

圖2 D2－40標(biāo)記的LVD在正常宮頸組織中的形態(tài)(SP 10×20)

2.2 宮頸癌組織與正常組織中LVD水平比較 正常組織中LVD水平為4.66 ±1.77，癌組織中LVD水平為8.36 ±2.65，癌組織中LVD水平明顯高于正常組織(P＜0.05);Ⅲ+Ⅳ期患者癌組織中LVD水平為10.35±3.73，Ⅰ+Ⅱ期患者癌組織中LVD水平為6.67±3.34;同時Ⅲ+Ⅳ期患者癌組織中LVD水平明顯高于Ⅰ+Ⅱ期患者(P＜0.05)。

2.3 宮頸癌組織與正常組織中HMGB1表達(dá)情況 正常組織中HMGB1表達(dá)水平為1.05±0.19，癌組織中HMGB1表達(dá)水平為1.45±0.26，癌組織中HMGB1表達(dá)水平明顯高于正常組織(P＜0.05);Ⅲ+Ⅳ期患者癌組織中HMGB1表達(dá)水平為2.42±0.53，Ⅰ+Ⅱ期患者癌組織中HMGB1表達(dá)水平為1.71±0.31，同時Ⅲ +Ⅳ期患者癌組織中 HMGB1表達(dá)水平明顯高于Ⅰ+Ⅱ期患者(P＜0.05)。Western顯色條帶定量分析情況見圖3。

圖3 HMGB1蛋白表達(dá)情況

2.4 宮頸癌組織中LVD與HMGB1相關(guān)性分析 Pearson相關(guān)分析顯示，宮頸癌組織中LVD與HMGB1表達(dá)水平呈顯著正相關(guān)(r=0.97，P＜0.05)。見圖4。

圖4 宮頸癌組織中LVD與HMGB1相關(guān)性

3 討論

淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是造成晚期宮頸癌治療及預(yù)后效果差的主要因素，而實(shí)體瘤外圍的淋巴管道的增多則是淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)[6]。張江宇等[7]研究表明，腫瘤細(xì)胞的浸潤會分泌一些淋巴因子來促進(jìn)周圍淋巴管的增生，從而促進(jìn)腫瘤的生長和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。D2－40是一種單克隆抗體，它可以特異性的標(biāo)記淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞而將淋巴管與血管區(qū)分開來。本研究結(jié)果表明，宮頸癌組織中LVD水平顯著高于正常組織，可能與腫瘤細(xì)胞的浸潤、轉(zhuǎn)移等相關(guān);Ⅲ+Ⅳ期患者癌組織中的LVD水平顯著高于Ⅰ+Ⅱ期患者，提示LVD水平隨FIGO分期的發(fā)展而增高，且由于Ⅲ+Ⅳ期患者癌細(xì)胞浸潤、侵襲活動較Ⅰ+Ⅱ期患者的更為頻繁，故其會分泌更多促淋巴管生長的因子而促進(jìn)淋巴管的生長，滿足腫瘤細(xì)胞的侵襲及遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移活動。

HMGB1是一種細(xì)胞因子，參與缺血性疾病、炎癥反應(yīng)、腫瘤生長和發(fā)展等多種病理生理活動。李妍等[8]的研究表明，在宮頸癌細(xì)胞中HMGB1的表達(dá)水平較高，且LVD隨HMGB1表達(dá)的增加而升高，HMGB1與LVD表達(dá)呈正相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，宮頸癌組織中HMGB1表達(dá)水平顯著高于正常組織，并且Ⅲ+Ⅳ期患者腫瘤組織中的HMBG1表達(dá)水平也顯著高于Ⅰ+Ⅱ期患者，與吳英娟[9]研究結(jié)果相似。此外，邱媛媛[10]在Hela細(xì)胞中也證實(shí)干擾HMGB1可以影響腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移活動。結(jié)合 Tafani等[11]和孫小云等[12]的研究結(jié)果，推測HMGB1在宮頸癌組織中高表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。Pearson相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，LVD與HMGB1呈顯著正相關(guān)，因此可以明確LVD與HMGB1在腫瘤的發(fā)生過程中是通過相互協(xié)同的作用共同促進(jìn)腫瘤的發(fā)展。

綜上所述，宮頸癌組織中LVD與HMGB1的表達(dá)呈顯著正相關(guān)關(guān)系，與腫瘤的發(fā)展密切相關(guān)，二者可能通過相互作用，共同促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移等活動。但二者是通過哪種機(jī)制相互協(xié)同促進(jìn)宮頸癌的浸潤、侵襲及轉(zhuǎn)移還需要進(jìn)一步的研究。

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