朱登峰 姜波健 費(fèi)哲為 朱松明 陳峰

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·論 著·(臨床研究)

Twist介導(dǎo)的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)因子在胃癌組織中的表達(dá)

朱登峰 姜波健 費(fèi)哲為 朱松明 陳峰

目的 檢測Twist、E-cadherin及N-cadherin在胃癌中的表達(dá)和臨床意義，探討Twist介導(dǎo)的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)在胃癌發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移中的作用。方法 采用免疫組織化學(xué)技術(shù)分別檢測Twist、E-cadherin及N-cadherin在108例胃癌原發(fā)灶及相應(yīng)的癌旁組織中的表達(dá)，統(tǒng)計(jì)分析Twist、E-cadherin及N-cadherin在胃癌原發(fā)灶表達(dá)強(qiáng)度的相關(guān)性及與胃癌病人臨床病理特征之間的關(guān)系。結(jié)果 ①Twist和N-cadherin在胃癌中的表達(dá)率分別顯著高于相應(yīng)癌旁組織(53.7%比38.0%，P=0.020；55.6%比33.3%，P=0.001)；E-cadherin在胃癌中的表達(dá)率顯著低于相應(yīng)的癌旁組織(41.7%比71.3%，P<0.001)。② 胃癌原發(fā)灶中Twist、E-cadherin及N-cadherin的表達(dá)高低分別與T分期(P<0.001；P=0.005；P<0.001)、TNM分期(P=0.005;P=0.029;P=0.016)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.005;P=0.001；P=0.002)有關(guān)。③在胃癌原發(fā)灶中，Twist的表達(dá)與N-cadherin的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.365，P<0.001)；Twist的表達(dá)與E-cadherin的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.232,P=0.016)。④ Logistic回歸分析提示Twist(P<0.001)和N-cadherin(P<0.001)陽性表達(dá)分別是T分期的獨(dú)立危險(xiǎn)因素；E-cadherin陰性表達(dá)是淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P=0.001)。Cox風(fēng)險(xiǎn)回歸多因素生存分析顯示，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.029)及Twist陽性表達(dá)(P=0.005)是影響胃腺癌病人術(shù)后生存的獨(dú)立因素。結(jié)論 在胃癌組織中，Twist表達(dá)和N-cadherin表達(dá)上調(diào)，E-cadherin表達(dá)下調(diào)，Twist介導(dǎo)的EMT可能與胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)。

胃癌；上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化；Twist；E-cadherin；N-cadherin

胃癌是世界范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率位居第5位[1]，死亡率居第3位[2]。在我國，胃癌新發(fā)病例約48.57人/10000人/年，死亡約35.60人/10000人/年[3]。腫瘤的復(fù)發(fā)、侵襲轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致胃癌死亡的主要原因，但其發(fā)生、發(fā)展及浸潤轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制尚不完全清楚。近年來國內(nèi)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition，EMT)與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。轉(zhuǎn)錄因子Twist作為EMT的關(guān)鍵調(diào)控因子，在EMT發(fā)生過程中扮演重要角色[4]。EMT最重要的變化是上皮細(xì)胞形態(tài)的改變和極性的喪失，轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)胞間黏附力低，而遷移能力、侵襲能力及轉(zhuǎn)移能力強(qiáng)的間質(zhì)細(xì)胞的特性，從而成為腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)。本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色方法檢測人胃癌原發(fā)病灶中和癌旁組織中Twist、E-cadherin及N-cadherin的表達(dá)，進(jìn)而探討Twist介導(dǎo)的EMT與胃癌臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系。

資料與方法

一、病例資料和組織樣本來源

經(jīng)倫理委員審批后同意，選取上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院崇明分院2010年1月至2013年1月期間收治的108例經(jīng)病理檢驗(yàn)確診為胃腺癌的病人作為研究對(duì)象，男性73例，女性35例；年齡36～83歲，中位年齡58歲；均行D2胃癌根治術(shù)(R0)。新鮮標(biāo)本取自切除的胃癌原發(fā)灶或配對(duì)的距原發(fā)灶邊緣5 cm以上并獲得病理學(xué)檢查證實(shí)的正常胃黏膜組織。術(shù)中嚴(yán)格遵守?zé)o瘤原則，避免擠壓。所有病人術(shù)前均未行放療或化療。所有入組病例均經(jīng)病人或其家屬知情同意。生存隨訪截止時(shí)間為2015年4月，均采用電話或門診隨訪，隨訪率為85%。

二、方法

1.主要試劑 小鼠抗人Twist單克隆抗體購自美國Abcam公司、兔抗人E-cadherin單克隆抗體和兔抗人N-cadherin單克隆抗體購自美國CST公司。SABC免疫組織化學(xué)試劑盒和DAB酶底物顯色試劑盒購自武漢博士德公司。PBS緩沖液(pH7.4)、二甲苯、枸櫞酸鹽抗原修復(fù)液、多濃度梯度酒精、過氧化氫等試劑均為上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院崇明分院病理科提供。

2.免疫組織化學(xué)染色 Twist、E-cadherin及N-cadherin蛋白檢測：所有標(biāo)本經(jīng)甲醛溶液固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋，以4 μm為厚度，將石蠟包塊連續(xù)切片。采用SABC法行免疫組織化學(xué)染色，染色步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。所有切片二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水。0.3%過氧化氫溶液浸泡處理，蒸餾水沖洗后置入枸櫞酸鈉緩沖液中，采用微波加熱法抗原修復(fù)。隨后PBS沖洗3次，滴加5%牛血清白蛋白(BSA)封閉液，室溫30 min后，甩去多余液體，不沖洗。滴加一抗(稀釋濃度為Twist為1∶200，E-cadherin為1∶400，N-cadherin為1∶200)后，4℃孵育過夜。PBS沖洗后滴加生物素化二抗，室溫孵育30 min。PBS沖洗后，滴加鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物(SABC)，室溫孵育30 min，PBS沖洗后用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)染色。DAB顯色后，蒸餾水沖洗，蘇木素復(fù)染2 min，鹽酸酒精分化。最后脫水、烘干、封片和鏡檢。以PBS替代一抗作為陰性對(duì)照，以試劑公司提供的已知陽性切片為陽性對(duì)照。

3.免疫組織化學(xué)染色評(píng)分 切片經(jīng)兩名病理科醫(yī)生在未知臨床病例資料情況下顯微鏡閱片評(píng)分，并協(xié)商取得統(tǒng)一。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下：①染色強(qiáng)度判定：無陽性染色為0分；淺黃色染色為1分；介于淺黃色和深黃色之間染色為2分；深黃色或棕黃色染色為3分。②陽性細(xì)胞數(shù)比率判定：無細(xì)胞陽性著色為0分；1%～25%的細(xì)胞陽性著色為1分；26%～50%的細(xì)胞陽性著色為2分；51%～75%的細(xì)胞陽性著色為3分；大于75%的細(xì)胞陽性著色為4分。最終以染色的評(píng)分和染色細(xì)胞所占比率的評(píng)分乘積作為每張切片的最終染色評(píng)分。0～3分視為陰性，> 3分視為陽性。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS(17.0版)軟件行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。胃癌原發(fā)灶與癌旁組織中蛋白的表達(dá)差異性及胃癌原發(fā)灶中的蛋白表達(dá)與胃癌臨床病例特征間的關(guān)系采用Chi-square檢驗(yàn)。Logistic回歸分析用于多因素分析。兩種蛋白之間表達(dá)的相關(guān)性采用Spearman相關(guān)分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，Log-rank法用于生存單因素分析，Cox模型用于生存多因素分析。

結(jié) 果

一、胃癌組織和癌旁組織中Twist、E-cadherin及N-cadherin表達(dá)的比較

免疫組織化學(xué)染色顯示，Twist和N-cadherin在胃癌組織中均有廣泛表達(dá)，而E-cadherin在癌旁組織中廣泛表達(dá)(圖1)。108例胃癌組織標(biāo)本中Twist表達(dá)率為53.7%(58/108)，高于癌旁組織中的表達(dá)38.0%(41/108) (P=0.020)。E-cadherin在胃癌組織中的表達(dá)率為41.7%(45/108)，明顯低于癌旁組織中的表達(dá)71.3%(77/108) (P<0.001)。N-cadherin在胃癌組織中的表達(dá)率為55.6%(60/108)，高于癌旁組織中的表達(dá)33.3%(36/108) (P=0.001)(表1)。

二、胃癌組織中Twist、E-cadherin及N-cadherin表達(dá)與胃癌病人臨床病理特征間的關(guān)系

Twist和N-cadherin在T3+T4期(T分期)、Ⅲ+Ⅳ期(TNM分期)及N1+N2+N3期(N分期)胃癌中的表達(dá)明顯高于T1+T2期、Ⅰ+Ⅱ期及N0期胃癌中的表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。相反，E-cadherin在T3+T4期、Ⅲ+Ⅳ期及N1+N2+N3期胃癌中的表達(dá)明顯低于T1+T2期、Ⅰ+Ⅱ期及N0期胃癌中的表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。但是，Twist、E-cadherin及N-cadherin在胃癌組織中的表達(dá)與胃癌病人年齡、性別、腫瘤直徑、Lauren分型、血管浸潤和淋巴管浸潤等因素?zé)o關(guān)(P>0.05)(表2)。

胃癌組織中Twist、N-cadherin及E-cadherin表達(dá)的Logistic回歸分析提示，Twist和N-cadherin陽性表達(dá)是影響腫瘤浸潤(T分期)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(TwistP< 0.001, N-cadherinP<0.001)。E-cadherin陰性表達(dá)是淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P=0.001)。

三、胃癌組織中Twist、E-cadherin及N-cadherin表達(dá)的相關(guān)性

Spearman等級(jí)相關(guān)分析顯示，Twist與E-cadherin在胃癌組織中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.232，P=0.016)；Twist與N-cadherin在癌組織中的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.365，P<0.001)(表3)。

四、生存分析

Kaplan-Meier法生存分析顯示Twist和N-cadherin陽性組生存時(shí)間小于陰性組生存時(shí)間，而E-cadherin陽性組生存時(shí)間大于陰性組生存時(shí)間，經(jīng)Log-rank法檢驗(yàn)各組生存時(shí)間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(TwistP<0.001，N-cadherinP=0.002，E-cadherinP<0.001)(圖2)。

Cox風(fēng)險(xiǎn)回歸多因素生存分析顯示，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.029)及Twist陽性表達(dá)(P=0.005)是影響胃腺癌病人術(shù)后生存的獨(dú)立因素(表4)。

表1 胃癌組織(n=108)和癌旁組織(n=108)中Twist、E-cadherin及N-cadherin表達(dá)(Chi-square test) [例(%)]

表2 胃癌組織中Twist、E-cadherin和N-cadherin的表達(dá)與胃癌病人臨床病理特征間的關(guān)系(例)

表3 Twist、E-cadherin和N-cadherin在胃癌組織中表達(dá)強(qiáng)度的相關(guān)性(例)

討 論

胃癌嚴(yán)重危害人類健康，盡管胃癌的早期診斷、手術(shù)方式及新輔助化療取得了一定的進(jìn)展，但其5年生存率仍不足30%[5]。造成胃癌病人死亡的主要原因是轉(zhuǎn)移，大部分進(jìn)展期胃癌病人因發(fā)生轉(zhuǎn)移而失去根治性手術(shù)的機(jī)會(huì)，因此探究胃癌轉(zhuǎn)移的機(jī)制及尋找胃癌轉(zhuǎn)移的分子標(biāo)志物對(duì)于胃癌的診治顯得尤為重要。

近年來EMT已成為腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的研究熱點(diǎn)。EMT是指上皮細(xì)胞在形態(tài)上轉(zhuǎn)變?yōu)殚g質(zhì)細(xì)胞的表型，同時(shí)細(xì)胞黏附能力降低，運(yùn)動(dòng)遷移能力增強(qiáng)。EMT發(fā)生時(shí)，上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin及細(xì)胞角蛋白等表達(dá)降低，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物N-cadher-in及Vimentin等表達(dá)增高[6]。越來越多的研究證實(shí)，EMT有助于癌細(xì)胞的遷移、侵襲及擴(kuò)散，在上皮腫瘤的浸潤及轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[7-10]。E-cadherin是保持上皮細(xì)胞之間黏附的主要細(xì)胞間分子，可抑制細(xì)胞的遷移。E-cadherin的表達(dá)下調(diào)則降低了細(xì)胞之間的黏附力，導(dǎo)致細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)，成為細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移的前提[11-12]。此外，研究顯示E-cadherin在人類多種腫瘤中表達(dá)降低[13-14]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)E-cadherin在胃癌原發(fā)灶中的表達(dá)要低于癌旁組織中的表達(dá)，同時(shí)與胃癌的T分期、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。因此，胃癌組織中E-cadherin的低表達(dá)可能引起胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移。

注:A.胃癌組織中Twist呈陽性表達(dá);B.胃癌組織中E-cadherin呈陽性表達(dá);C.胃癌組織中N-cadherin呈陽性表達(dá);D.癌旁正常胃黏膜組織中Twist呈陰性表達(dá);E.癌旁正常胃黏膜組織中E-cadherin呈陽性表達(dá);F.癌旁正常胃黏膜組織中N-cadherin呈陰性表達(dá)圖1 胃癌原發(fā)灶及癌旁正常胃黏膜組織中Twist、E-cadherin及N-cadherin蛋白的表達(dá)(SABC法,×200)

注:A.Twist陽性表達(dá)與Twist陰性表達(dá)的比較;B.E-cadherin陽性表達(dá)與E-cadherin陰性表達(dá)的比較;C.N-cadherin陽性表達(dá)與N-cadher-in陰性表達(dá)的比較圖2 胃癌原發(fā)灶中Twist、E-cadherin及N-cadherin表達(dá)陽性組與陰性表達(dá)組胃腺癌病人生存曲線

表4 Cox回歸模型多因素生存分析結(jié)果

Twist是EMT過程中的關(guān)鍵調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子[15]。Twist與N-cadherin基因第一內(nèi)含子中的E-box原件結(jié)合，誘導(dǎo)N-cadherin轉(zhuǎn)錄[16]。在胃癌研究中，已有報(bào)道Twist過表達(dá)與N-cadherin表達(dá)升高相關(guān)[17]，Twist與胃癌的轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)及不良預(yù)后相關(guān)[18]。本研究結(jié)果表明，胃癌組織中Twist的表達(dá)明顯高于癌旁組織中的表達(dá)，提示Twist在胃癌的發(fā)生中起到一定的作用。同時(shí)，胃癌組織中N-cadherin表達(dá)高于癌旁組織，并且Twist高表達(dá)、N-cadherin高表達(dá)、E-cadherin的低表達(dá)與胃癌的T分期、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，因此我們推斷胃癌組織中Twist表達(dá)的升高可在轉(zhuǎn)錄水平抑制E-cadherin表達(dá)，誘導(dǎo)N-cadherin表達(dá)，促使EMT的發(fā)生，在胃癌的發(fā)生、發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。此外，Logistic回歸分析提示，胃腺癌原發(fā)灶中Twist陽性表達(dá)是T分期的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，Cox風(fēng)險(xiǎn)回歸多因素生存分析顯示，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及Twist陽性表達(dá)是影響胃腺癌病人術(shù)后生存的獨(dú)立因素。

綜上所述，Twsit在胃癌中高表達(dá)，其表達(dá)水平與胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，Twist可能通過EMT的分子機(jī)制參與胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移。因此，Twist可能是調(diào)控胃癌發(fā)生發(fā)展的一個(gè)重要樞紐，對(duì)Twist蛋白在癌組織中的表達(dá)檢測可能是預(yù)判腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的可行方法，并有望成為胃癌靶向治療的靶點(diǎn)，但是對(duì)Twist介導(dǎo)的EMT過程還有待于進(jìn)一步的研究。

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Expression of snail mediated EMT in gastric carcinoma

ZhuDengfeng*，JiangBojian，F(xiàn)eiZhewei，ZhuSongming，ChenFeng.

*DepartmentofGeneralSurgery，No.3People'sHospitalAffiliatedtoShanghaiJiaoTongUniversitySchoolofMedicine,Shanghai201999，China

JiangBojian,Email:Jiang_md@hotmail.com

Objective To observe the clinical significances and the expressions of Twist, E-cadherin and N-cadherin during Twist-mediated epithelial-mesenchymal transition (EMT) in gastric cancer tissues. Methods The expressions of Twist, E-cadherin and N-cadherin were detected by immunohistochemistry in primary cancer tissues and in normal mucosa tissues of 108 patients with gastric cancer. The correlation among expressions of Twist, E-cadherin and N-cadherin in gastric cancer tissues and the clinical pathologic characteristics were further analyzed. Results (1) The positive expression rates of Twist and N-cadherin in gastric cancer tissues were 53.7% and 55.6% respectively, which were higher than those in gastric normal mucosa tissues (38.0% and 33.3%) with significant differences (P=0.020;P=0.001); but lower positive expression rate of E-cadherin in gastric cancer tissues was found (41.7%) compared with those in gastric normal mucosa tissues (71.3%), significant difference could be seen between both groups (P<0.001); (2) The expressions of Twist, E-cadherin and N-cadherin in primary gastric cancer tissues was noted to present tendency correlating with the T stage (P<0.001;P=0.005;P<0.001), pTNM stage (P=0.005;P=0.029;P=0.016) and lymph node metastasis (P=0.005;P=0.001;P=0.002); (3) The expression of Twist was positively seen correlation with that of N-cadherin (r=0.365,P<0.001), and but with that of E-cadherin (r=-0.232,P=0.016) in primary gastric cancer tissues. (4) Logistic regression analysis revealed that T stage was an independent risk factor for positive expression of Twist (P<0.001) or N-cadherin (P<0.001), and that lymph node metastasis was the independent risk factor for negative expression of E-cadherin (P=0.001). Multivariate analysis with the COX regression models showed that expression of Twist (P=0.005) and lymph node metastasis (P=0.029) were significantly correlated with the poor prognosis. Conclusions The expressions of Twist and N-cadherin were up-regulated, whereas the expression of E-cadherin was down-regulated in primary gastric cancer tissues, suggesting Twist-mediated EMT may be involved in the invasion and metastasis of gastric cancer.

Gastric cancer; Epithelial-mesenchymal transition; Twist; E-cadherin; N-cadherin

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院科研基金(13XJ10028)

201999 上海，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第三人民醫(yī)院普外科(朱登峰、姜波健)；上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院(崇明分院)普外科(費(fèi)哲為、朱松明、陳峰)

姜波健，Email：Jiang_md@hotmail.com

R735.2

A

10.3969/j.issn.1003-5591.2015.04.020

2015-05-11)