劉建民,呂景芳,王華,劉靜,陳明揚,王靜芝

·動物實驗·

“雙固一通”電針法對老年陽虛證模型大鼠肝線粒體結(jié)構(gòu)及ATP酶活性的影響

劉建民1,呂景芳2,王華1,劉靜3,陳明揚4,王靜芝1

(1.湖北中醫(yī)藥大學,武漢430061;2.十堰市婦幼保健院,十堰 442000;3.孝感市中心醫(yī)院,孝感 432000;4. 武漢市中醫(yī)醫(yī)院,武漢 430010)

目的探討“雙固一通”電針法對老年陽虛證模型大鼠肝線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)及ATP酶活性的影響。方法選用5月齡SD雄性大鼠40只,隨機分為A組、B組、C組和D組,每組10只。A組為正常對照組,其余3組大鼠均皮下注射D-半乳糖40 d后再肌肉注射氫化可的松7 d制作老年陽虛證大鼠模型。C組采用“雙固一通”電針法,電針關元、足三里、百會穴;D組采用電針中極、陰陵泉、印堂穴治療。每星期治療6次,共治療4星期。治療后以游泳力竭時間判定各組大鼠抗疲勞能力,并采用透射電鏡觀察肝線粒體結(jié)構(gòu)、比色法檢測各組大鼠肝組織Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性。結(jié)果與A組比較,B組和D組大鼠平均游泳力竭時間明顯縮短(均P＜0.01),肝線粒體內(nèi)外膜模糊不清,嵴變形、斷裂或消失,肝線粒體出現(xiàn)腫脹等改變,Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性均下降(P＜0.01,P＜0.05)。C組比B組游泳力竭時間明顯延長(P＜0.01),肝線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)得到明顯改善,Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性均明顯提高(P＜0.01,P＜0.05);D組與B組比較,大鼠平均游泳力竭時間縮短(P＜0.05),肝粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)有脫顆粒,肝Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性降低(P＜0.05)。結(jié)論“雙固一通”電針法可改善老年陽虛證模型大鼠陽虛抗疲勞能力,改善肝線粒體超微結(jié)構(gòu),提高肝Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性,促進肝臟能量代謝。

針刺療法;電針;陽虛證;肝線粒體;ATP酶;“雙固一通”電針法;大鼠

陽虛是指機體陽氣虧虛及其溫煦、推動、興奮等功能減退而表現(xiàn)為虛寒內(nèi)生、精神萎靡、活動減少、代謝低下等功能抑制的病理狀態(tài)[1-2]。近年來,有學者通過對陽虛證的研究表明[3-4],陽虛證與機體能量代謝紊亂密不可分。筆者前期研究表明,“雙固一通”電針對老年陽虛證模型大鼠在免疫調(diào)控方面以及肝線粒體呼吸功能方面均有顯著改善效應[5-6]。本實驗探討“雙固一通”電針對老年陽虛證模型大鼠肝線粒體結(jié)構(gòu)及ATP酶活性的影響,現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

LKB-V型超薄切片機(瑞典BROMMA公司);日立H-600型透射電鏡(日本日立公司);721型分光光度計(上海第三分析儀器廠);KDC-160HR高速冷凍離心機(上?？拼?;DH 3600 AB電熱恒溫培養(yǎng)箱(天津泰斯特儀器有限公司);無菌針灸針(蘇州醫(yī)療用品廠有限公司);HANS LH202H型電針儀(北京華威有限公司)。

水合氯醛為國產(chǎn)分析純;ATP酶測試盒(生產(chǎn)批號20120428,南京建成生物工程研究所);考馬斯亮藍蛋白定量試劑盒(Aidlab,北京)。

1.2 實驗動物與分組

實驗動物為5月齡Sprague Dawley健康雄性大鼠,40只,清潔級,體重為200～230 g,購自武漢大學動物實驗中心[許可證號SCXK(鄂)2008-0004]。所有動物飼養(yǎng)于較為恒定的動物飼養(yǎng)室(溫度為18℃～25℃,濕度為45%～55%),動物可自由攝食和飲水。根據(jù)簡單隨機排序法隨機分為A組、B組、C組和D組,每組10只。

1.3 老年陽虛證模型制作

參考黃兆勝制作阿爾茨海默病腎陽虛模型[7]及課題前期實驗中老年陽虛證模型[5]制作,大鼠適應性喂養(yǎng)1星期后,開始造模,除D組外,其余各組大鼠均連續(xù)40 d按每鼠每日125 mg/kg D-半乳糖給予頸背部皮下注射,之后連續(xù)7 d再行后腿肌肉注射氫化可的松1.5 mg/100 g,D組每日皮下注射等量0.9%生理鹽水1次,連續(xù)47 d。造模成功后的大鼠出現(xiàn)拱背蜷曲、肢尾冷、擠臥一起,被毛蓬松、失去光澤,足趾浮腫,舌淡胖苔潤,神疲、少食、反應遲鈍、小便多等虛損狀。根據(jù)中醫(yī)陽虛證辨證參考標準[8],類似“陽虛”狀態(tài)。

1.4 處理方法

1.4.1 A組

正常飼養(yǎng)(以下各組略),不進行造模及電針治療。

1.4.2 B組

造模,不予電針治療。

1.4.3 C組

造模成功后,參照華興邦等制定的《實驗動物穴位圖譜》,取關元、足三里和百會。穴區(qū)剪毛備皮,75%醫(yī)用乙醇常規(guī)消毒,用0.35 mm×25 mm不銹鋼毫針針刺,關元直刺3～5 mm,雙側(cè)后三里直刺3～5 mm,百會向后平刺5 mm。其中關元與足三里接HANS LH202H型電針儀,雙側(cè)足三里與關元隔日交替接1對電極,選用連續(xù)波,頻率為2 Hz,強度為1 mA,通電15 min。每日上午9～11時治療1次,每星期治療6次,共治療4星期。

1.4.4 D組

造模完成后第2天,取中極、陰陵泉、印堂進行電針治療處理,操作方法及療程同A組。

A組和B組相同方法、相同時間段內(nèi)抓取固定。各組大鼠治療及游泳力竭試驗結(jié)束后,禁食,于第2天取材,進行相應指標檢測。

1.5 標本采集與指標檢測

1.5.1 游泳力竭試驗

各組大鼠于末次治療后進行游泳力竭試驗。采用負重游泳運動方式[9],泳池水深30 cm,水溫保持在(26 ±1)℃,每0.2 m2水面同時放4～5只大鼠游泳,游泳時避免大鼠互相抓抱或者趴于池壁休息,當大鼠游泳動作明顯不協(xié)調(diào),然后沉入水中10 s以上不能浮出時視為力竭。從大鼠入水開始計時,至大鼠力竭停止,記錄每只大鼠力竭潛伏時間。

1.5.2 肝臟線粒體超微結(jié)構(gòu)檢測

將大鼠腹腔麻醉,頸部脫臼處死,迅速剖開腹腔取出肝組織,剪下約1 mm3肝組織塊,放入2.5%戊二醛中固定2 h后送至武漢大學電鏡室,透射電鏡觀察肝臟線粒體超微結(jié)構(gòu)的變化。

1.5.3 肝組織Na+-K+-ATP酶及Ca2+-Mg2+-ATP酶活性檢測

另取肝組織塊約0.5 g,分成若干份,在預冷的生理鹽水中漂洗,除去血液,濾紙拭干。將肝組織塊稱重后置于勻漿器中,按1:9的比例加入0.9%的冷生理鹽水制成10%的勻漿液。將制備好的組織勻漿液轉(zhuǎn)入離心管,置冷凍離心機,4℃以2000 r/min離心15 min。取上清液裝入樣品管中-20℃冷藏備用。肝組織蛋白含量的測定采用考馬斯亮藍法。具體操作按各試劑盒說明書進行。

1.6 統(tǒng)計學方法

所有實驗數(shù)據(jù)使用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計學處理,計量資料用均數(shù)±標準差表示,采用方差齊性檢驗和單因素方差分析,組間比較采用q檢驗。以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠平均游泳力竭時間比較

由表1可見,B組和D組大鼠平均游泳力竭較A組明顯縮短(P＜0.01);經(jīng)“雙固一通”電針處理的C組大鼠平均游泳力竭時間與B組比較,差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);而D組游泳力竭時間雖較B組延長,但與C組比較,差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

表1 各組大鼠平均游泳力竭時間比較 (±s,min)

表1 各組大鼠平均游泳力竭時間比較 (±s,min)

注:與A組比較1)P＜0.01;與B組比較2)P＜0.01;與C組比較3)P＜0.05

組別 n 平均游泳力竭時間A組 10 94.64±6.31 B組 10 67.72±7.211)C組 10 88.27±7.602)D組 10 76.49±6.591)3)

2.2 電鏡觀察肝臟線粒體超微結(jié)構(gòu)的變化

各組大鼠肝臟線粒體超微結(jié)構(gòu)見圖1。A組線粒體內(nèi)外膜清晰,線粒體嵴完整可見(圖1-1),粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富且無脫顆?，F(xiàn)象(圖1-2)。B組線粒體內(nèi)外膜模糊不清,嵴變形、斷裂或消失,線粒體出現(xiàn)腫脹融合等改變(圖2-1),粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)減少(圖2-2)。C組線粒體數(shù)目較B組增多,形態(tài)結(jié)構(gòu)完整,膜清晰,嵴完整(圖3-1),粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)無明顯改變(圖3-2)。D組線粒體形態(tài)清楚(圖4-1),但粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)有脫顆粒(圖4-2)。

圖1 各組大鼠肝臟線粒體超微結(jié)構(gòu)示意圖

2.3 各組大鼠肝組織Na+-K+-ATP酶及Ca2+-Mg2+-ATP酶活性比較

采用定磷法按照ATP酶試劑盒說明書檢測大鼠肝組織Na+-K+-ATP酶及Ca2+-Mg2+-ATP酶活性,ATP酶活性以每小時每毫克蛋白分解ATP產(chǎn)生1 μmol無機磷的量為1個ATP酶活力單位表示,即μmolPi/mgprot/h。計算公示為,ATP酶活性＝[(測定管吸光度－空白管吸光度)/標準管吸光度]×標準濃度(1 μmol/mL) ×[(樣本稀釋倍數(shù)×6)/蛋白濃度]。

由表2可見,A組大鼠Na+-K+-ATP酶及Ca2+-Mg2+-ATP酶活性明顯低于B組(P＜0.05,P＜0.01)。與B組比較,C組Na+-K+-ATP酶及Ca2+-Mg2+-ATP酶活性均明顯提高,兩組相比較差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05, P＜0.01)。D組Na+-K+-ATP酶及Ca2+-Mg2+-ATP酶活性均低于C組,兩組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

表2 各組大鼠肝組織Na+-K+-ATP酶及Ca2+-Mg2+-ATP酶活性

3 討論

肝臟是能量代謝的重要器官,線粒體是細胞氧化磷酸化產(chǎn)生ATP以供能的主要場所。Na+-K+-ATP酶是維持線粒體膜水鈉平衡的關鍵物質(zhì),Ca2+-Mg2+-ATP酶是維持細胞內(nèi)鈣鎂平衡的重要物質(zhì),其生理作用均需通過分解ATP來實現(xiàn)[10],ATP酶活性是衡量線粒體能量代謝及功能有無損傷的重要指標。研究表明[11-12],細胞內(nèi)Ca2+的超載與機體的老年性疾病密切相關,而Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶的活性是Ca2+分布的基礎,線粒體的結(jié)構(gòu)破壞與功能抑制,將使老年機體處于代謝紊亂狀態(tài)[13]。老年陽虛者畏寒怕冷、疲乏無力、多種代謝功能低下,與肝臟線粒體功能低下密切相關。為了從行為學方面反映電針對陽虛證的改善效果,在實驗中借鑒以往研究[14]引入游泳力竭試驗,結(jié)果表明,老年陽虛模型大鼠平均游泳力竭時間較正常對照組明顯增加(P＜0.01);而通過“雙固一通”電針治療能明顯延長大鼠游泳力竭時間(P＜0.01),提示“雙固一通”電針能改善老年陽虛模型大鼠陽虛癥狀。電鏡觀察發(fā)現(xiàn),老年陽虛證模型大鼠肝線粒體內(nèi)外膜模糊不清,嵴變形、斷裂或消失,線粒體腫脹融合;采用定磷法檢測Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性均明顯降低,表明機體處于陽虛供能不足、能量代謝低下狀態(tài)。經(jīng)“雙固一通”電針治療后大鼠線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)得到改善,Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性均明顯升高。提示“雙固一通”電針法能改善肝細胞受損狀態(tài),促進ATP合成與分解,使肝細胞處于能量代謝活躍狀態(tài)。

《靈樞?天年》:“五十歲,肝氣始衰,肝葉始薄,膽汁始減,目始不明。六十歲,心氣始衰,苦憂悲,血氣懈墮,故好臥。七十歲,脾氣虛,皮膚枯。八十歲,肺氣衰,魄離,故言善誤。九十歲,腎氣焦,四藏經(jīng)脈空虛?！睆娬{(diào)人體衰老始于肝,根于脾腎,機體衰老與臟腑功能減退密切相關。中醫(yī)學理論認為腎藏先天之精,是生命之本源,為人體先天之本。脾主運化水谷精微,化生氣血,為人體后天之本。肝藏血,主疏泄,精血皆由水谷精微所化生和充養(yǎng),肝腎同源而藏泄互用。老年陽虛者表現(xiàn)為機體陽氣不足,虛寒內(nèi)生,溫煦推動功能減退,其主要原因可歸納為腎氣虧虛,脾胃虛弱,肝陽虛衰,肝失疏泄,氣血運行不暢。本實驗選用具有固護先天的關元、固護后天的足三里和益氣安神的百會,是基于“雙固一通”針法[15]而來,針灸“治未病”以正氣為本,固護先天和后天是其基礎和關鍵,這為“雙固一通”電針法防治陽虛衰老提供了理論指導。足三里為足陽明胃經(jīng)合穴,具有健脾益胃、補益氣血、強壯機體的作用;關元位于任脈,具有補腎壯陽、延年益壽之效;百會歸屬督脈,與手足少陽、足太陽、足厥陰經(jīng)相交會,故又稱三陽五會,其穴居巔頂,內(nèi)絡于腦,補之能益氣升陽,寧心安神。以往研究多從神經(jīng)內(nèi)分泌免疫抗衰老、抗自由基氧化等方面研究關元、足三里、百會穴對老年機體延緩衰老的作用機制[16-17],而從肝能量代謝方面對老年陽虛證的探討較少。

為了探討“雙固一通”配穴電針治療對老年陽虛證肝臟能量代謝作用是否具有優(yōu)勢,實驗同時選取關元、足三里、百會各穴鄰近穴位(中極、陰陵泉、印堂)作為對照電針治療,結(jié)果表明,“雙固一通”電針對老年陽虛模型大鼠陽虛改善、肝線粒體超微結(jié)構(gòu)改善及ATP酶活性的提高能力均優(yōu)于中極、陰陵泉、印堂的治療效果。

[1] 倪莉,張冰.糖皮質(zhì)激素誘導陰虛陽虛狀態(tài)動物模型的再認識[J].北京中醫(yī)藥大學學報,2009,32(5):327-330.

[2] 孫廣仁.《內(nèi)經(jīng)》中陽虛的概念及相關的幾個問題[J].山東中醫(yī)藥大學學報,2005,29(4):300-301.

[3] 劉欣,張冰,劉小青,等.氫化可的松誘導大鼠類陽虛狀態(tài)的動態(tài)觀察[J].中華中醫(yī)藥雜志,2011,26(1):126-128.

[4] 盧德趙,沃興德,施孟如,等.激素型腎陽虛動物肝線粒體蛋白質(zhì)組與能量代謝相關性[J].中國生物化學與分子生物學報,2005, 21(6):807-814.

[5] 王華,毛慧芳,劉建民,等.“雙固一通”配穴電針對老年陽虛模型大鼠免疫衰老的調(diào)控效應及機制探討[J].中國針灸,2012,32(6): 529-533.

[6] 王華,劉靜,劉建民,等.“雙固一通”配穴電針對老年陽虛模型大鼠抗疲勞能力及肝線粒體呼吸功能的影響[J].針刺研究,2013, 38(4):259-264.

[7] 黃兆勝,孫維廣,劉明平,等.養(yǎng)壽丹對阿爾茨海默病腎陽虛模型大鼠學習記憶的影響[J].中成藥,2002,24(2):113-115.

[8] 沈自尹,王文健.中醫(yī)虛證辨證參考標準[J].中西醫(yī)結(jié)合雜志,1986,6(10):598.

[9] 侯莉娟,劉曉莉,喬德才.大鼠游泳運動疲勞模型建立的研究[J].實驗動物科學與管理,2005,22(1):1-3.

[10] 農(nóng)文田,顏小若,藍賢俊.maFGF對慢性衰老大鼠肝組織中ATP酶活力的影響[J].臨床和實驗醫(yī)學雜志,2011,10(8):561-563.

[11] Scorrano L, Oakes SA, Opferman JT, et al. BAX and BAK regulation of endoplasmic reticulum Ca2+: a control point for apoptosis[J].Science, 2003, 300 (5616): 135-139.

[12] Bras M, Queenan B, Susin SA. Programmed cell death via mitochondria:different modes of dying[J]. Biochemistry (Most), 2005,70(2): 231-239.

[13] Tsujimoto Y. Cell death regulation by the Bcl-2 protein family in the mitochondria[J]. J Cell Physiol, 2003, 195(2):158-167.

[14] 許莉,高涵,宋娟,等.靈芝茶對老年小鼠抗疲勞、抗缺氧能力及肝臟核酸含量的影響[J].中國臨床康復,2004,8(24):5194-5195.

[15] 王華,梁鳳霞.“雙固一通”針灸法與疾病防治[J].湖北中醫(yī)雜志, 2004,26(4):3-5.

[16] 朱梅,祖國美,呂強,等.針刺老年大鼠“足三里”、“關元”穴區(qū)對肝臟抗衰老的實驗研究[J].針灸臨床雜志,2004,20(7):48-49.

[17] 趙利華,文建軍,楊柯,等.艾灸對D-半乳糖致小鼠衰老模型抗衰老作用的研究[J].針刺研究,2008,33(4):255-257.

Effect of “Double Reinforcing and One Unblocking” Electroacupuncture on Hepatic Mitochondrial Structure and ATPase Activity in a Rat Model of Senile Yang Deficiency

LIU Jian-min1, LV Jing-fang2, WANG Hua1, LIU Jing3, CHEN Ming-yang4, WANG Jing-zhi1. 1.Hubei University of Traditional Chinese Medicine,Wuhan 430061,China; 2.Shiyan Maternal and Child Health Hospital,Shiyan 442000,China; 3.Xiaogan Central Hospital,Xiaogan 432000,China; 4.Wuhan Hospital of Traditional Chinese Medicine,Wuhan 430010,China

ObjectiveTo explore the effect of “double reinforcing and one unblocking” electroacupuncture on hepatic mitochondrial structure and ATPase activity in a rat model of senile yang deficiency.MethodsForty 5-month-old male SD rats were selected and randomly allocated to groups A, B, C and D, 10 rats each. Group A was a normal control group. A model of senile yang deficiency was made by 40 days’ subdermal injection of D-galactose and then 7 days’ intramuscular injection of hydrocortisone in the other three groups of rats. Group C received treatment with “double reinforcing and one unblocking”electroacupuncture at points Guangyuan(CV4), Zusanli(ST36) and Baihui(GV20); group D, treatment with electroacupuncture at points Zhongji(CV3), Yinlingquan(SP9) and Yintang(GV29). Treatment was given 6 times a week for a total of 4 weeks. After treatment, the anti-fatigue ability was determined by swimming exhaustion time, hepatic mitochondrial structure was observed under a transmission electron microscope and hepatic Na+-K+-ATPase and Ca2+-Mg2+-ATPase activities were measured by colorimetry in every group of rats.ResultsThe mean swimming exhaustion time shortened significantly (all P＜0.01); hepatic mitochondrial inner and outer membranes were blurred, mitochondrial ridges deformed, ruptured or disappeared and mitochondria swelled; both Na+-K+-ATPase and Ca2+-Mg2+-ATPase activities decreased (P＜0.01, P＜0.05) in groups B, C and D of rats compared with group A. Swimming exhaustion time lengthened significantly (P＜0.01), hepatic mitochondrial structure improved significantly and both Na+-K+-ATPase and Ca2+-Mg2+-ATPase activities increased significantly (P＜0.01, P＜0.05) in group C compared with group B. Rat mean swimming exhaustion time shortened (P＜0.05), hepatic rough endoplasmic reticula degranulated and hepatic Na+-K+-ATPase and Ca2+-Mg2+-ATPase activities decreased (P＜0.05) in group D compared with group B. Conclusion “Double reinforcing and one unblocking” electroacupuncture can improve anti-fatigue ability, ameliorate hepatic mitochondrial ultrastructure, increase hepatic Na+-K+-ATPase and Ca2+-Mg2+-ATPase activities and promote hepatic energy metabolism in a rat model of senile yang deficiency.

Acupuncture therapy; Electroacupuncture; Yang deficiency syndrome; Hepatic mitochondria; ATPase; “Double reinforcing and one unblocking” electroacupuncture; Rats

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2015.01.0063

2014-09-01

1005-0957(2015)01-0063-04

湖北省自然科學基金重點項目(2008CDA051)

劉建民(1976 - ),男,副教授

王華(1955 - ),男,教授,博士生導師,E-mail:Hwang.TCM@china.com