劉曉梅，鄭桂英

卵泡刺激素及其受體對卵巢癌細胞株的增殖作用

劉曉梅1*，鄭桂英2

目的 研究卵泡刺激素(FSH)對卵巢癌細胞株的增殖作用，探討FSH在卵巢上皮性腫瘤(OET)發(fā)生、發(fā)展過程中的潛在生物學作用機制。方法 用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)HO8910細胞及SKOV3細胞；采用免疫熒光法檢測HO8910細胞及SKOV3細胞卵泡刺激素受體(FSHR)的表達；以0 IU/L的FSH作為對照組，不同濃度FSH分別培養(yǎng)HO8910細胞和SKOV3細胞不同時間后，MTT比色法測定各組吸光度值A，并比較各實驗組的增殖指數(shù)(增殖指數(shù)=實驗組吸光度(A)/對照組吸光度(A)×100%)；以最佳FSH濃度為實驗組，等量培養(yǎng)液替代作為對照組，分別培養(yǎng)最佳時間，用流式細胞儀分別檢測實驗組及對照組細胞周期分布。結果 ①HO8910細胞FSHR表達陽性，特異性位于細胞核周及細胞質(zhì)內(nèi)；SKOV3細胞FSHR表達陰性；②不同濃度FSH作用于HO8910細胞24 h、48 h、72 h時，其A值均較對照組明顯升高，其增殖程度與FSH呈濃度依賴效應，40 IU/L FSH培養(yǎng)48 h時，細胞增殖指數(shù)最高(P<0.05)，隨著FSH濃度升高(直至160 IU/L)，該細胞株的增殖并未繼續(xù)增加。SKOV3細胞各實驗組A值均較對照組略有升高，40 IU/L FSH培養(yǎng)48 h時，細胞增殖指數(shù)最高(P<0.05)，但未表現(xiàn)出明顯的FSH濃度依賴效應;③FSH濃度為40 IU/L時，培養(yǎng)HO8910細胞及SKOV3細胞48 h，兩種細胞G0/G1期比例均減少，S期及G2/M期比例均增加(P<0.05)。而且FSH對HO8910促進細胞分裂作用較SKOV3更明顯，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結論 通過建立FSH作用于HO8910和SKOV3兩種細胞模型，證實FSH與FSHR均與卵巢癌的增殖相關；FSH對FSHR表達陽性的卵巢癌細胞作用呈劑量效應；FSH通過促進細胞周期時相變化促進卵巢癌細胞增殖，且當FSHR陽性時，細胞周期變化更明顯。

卵巢癌細胞；卵泡刺激素；卵泡刺激素受體

0 引言

卵巢癌是婦科最致命的惡性腫瘤，其發(fā)病率雖低于宮頸癌和內(nèi)膜癌，但其死亡率明顯超過宮頸癌與內(nèi)膜癌死亡率之和[1]。卵巢癌約占卵巢腫瘤的10%～20%，卵巢腫瘤發(fā)生在絕經(jīng)前婦女僅7%為惡性，而在絕經(jīng)后婦女30%為惡性。卵巢癌發(fā)病高峰年齡為56～60歲，其中大約90%為上皮性卵巢癌(Epithelial ovarian cancer，EOC)[2]。由于卵巢位于盆腔深處，解剖部位相對隱蔽，組織發(fā)生來源復雜，故其疾病早期缺乏相對特異癥狀及確診特異指標，使得大多數(shù)患者缺乏特異的早期診斷措施，確診時約70%的婦女處于腫瘤晚期[3]，嚴重影響了其預后，其5年生存率晚期比早期下降超過70%[4]。因此，盡早查明卵巢癌的發(fā)病原因十分重要。

國外有學者研究發(fā)現(xiàn),第一次妊娠后，每再增加一次足月妊娠，卵巢癌發(fā)病風險能降低10%～16%[5-6]，口服避孕藥的婦女與未用者相比卵巢癌風險減少30%[7-9]，提示低卵泡刺激素(Follicle-stimulating hormone,FSH)環(huán)境對卵巢癌的發(fā)生可能有一定的保護作用。圍絕經(jīng)期仍有排卵的婦女，在多數(shù)周期中FSH水平升高，呈波動型；絕經(jīng)后雌激素水平降低，誘導下丘腦釋放促性腺激素釋放激素增加，刺激垂體釋放FSH增加，而80%以上的上皮性卵巢癌發(fā)生在圍絕經(jīng)期及絕經(jīng)后婦女[10-12]，推測高FSH環(huán)境與卵巢癌的發(fā)生有一定的內(nèi)在聯(lián)系。然而，卵巢癌的發(fā)病原因尚不明了，F(xiàn)SH在卵巢癌發(fā)展的獨立作用仍然令人困惑。本文通過構建FSH作用于FSHR陽性及陰性的卵巢癌細胞株體外模型，探討FSH與EOC發(fā)生、發(fā)展的關系及潛在生物學作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 HO8910人卵巢漿液性囊腺癌細胞株，由吉林大學基礎醫(yī)學院病理學重點實驗室饋贈，SKOV3人卵巢漿液性囊腺癌細胞株，購于中國科學院北京細胞庫。FSH 及FSHR單克隆抗體(兔抗人)均購于美國SIGMA公司,CY3熒光二抗(羊抗兔)購于中國武漢博士德公司。RPMI 1640培養(yǎng)基及胰蛋白酶為美國GIBCO；FBS胎牛血清為杭州四季青生物制品公司；PI 碘化丙碇、MTT噻唑藍均購于美國SIGMA公司。熒光顯微鏡為OLYMPUS BX 51；日本全自動酶標儀為美國BIO-TEK；流式細胞儀為美國Beckman-Coulter。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 將HO8910細胞及SKOV3細胞置于含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液中，37 ℃、5%CO2飽和濕度恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用胰蛋白酶消化后按1∶3的比例傳代，每3天傳代1次，取對數(shù)生長期的細胞用于實驗研究。

1.2.2 免疫熒光法檢測HO8910細胞及SKOV3細胞FSHR的表達 將高壓后的玻片放入無菌24孔板內(nèi)，取對數(shù)生長期HO8910細胞及SKOV3細胞，胰酶消化后調(diào)整濃度為1.2×105/mL，按每孔500 μL接種于無菌24孔培養(yǎng)板中，置于37 ℃、5%CO2恒溫箱中培養(yǎng)。每種細胞設3個重復孔。顯微鏡下觀察細胞融合率為50%～60%，4%多聚甲醛室溫固定，細胞水化，蛋白酶K消化修復，3%H2O2封閉，5%山羊血清封閉，加一抗(兔抗人FSHR單克隆抗體)孵育后加二抗(羊抗兔CY3熒光二抗)孵育。Hotrest復染后水性封片劑封片。熒光顯微鏡上機檢測兩種細胞FSHR的表達情況。

1.2.3 MTT法檢測FSH對HO8910細胞及SKOV3細胞的增殖 取對數(shù)生長期HO8910細胞及SKOV3細胞，調(diào)整濃度為5×104/mL，每孔100 μL分別接種于無菌96孔培養(yǎng)板中，37 ℃、5%CO2恒溫箱中培養(yǎng)。24 h后接種細胞的孔更換為無血清培養(yǎng)液饑餓24 h促細胞同步化。實驗組每組分別加不同濃度FSH溶液200 μL，終濃度分別為10、20、40、80、160 IU/L；以等量的細胞培養(yǎng)液替代FSH溶液作為對照組。分別檢測不同濃度FSH對2種細胞培養(yǎng)24、48、72 h時細胞增殖情況的影響。每組設5個平行孔。FSH作用結束時，每孔加入20 μL MTT(5 mg/mL)，恒溫箱內(nèi)孵育4 h，每孔加150 μL DMSO后震蕩10 min。選擇490 nm波長，在酶標儀上測定各孔的吸光度值，記錄結果后進行比較。實驗重復3次，取平均值。

結果判定:細胞增殖指數(shù)(%)=實驗組吸光度(A)/對照組吸光度(A)×100%。判定FSH作用于HO8910細胞及SKOV3細胞的最佳藥物濃度及時間。

1.2.4 流式細胞儀檢測FSH作用HO8910及SKOV3細胞后細胞周期分布 以“1.2.3”項中選出的最佳FSH濃度和作用時間作用于細胞作為實驗組，以等量的培養(yǎng)液替代FSH溶液作為對照組，分別收集對照組及實驗組的HO8910細胞及SKOV3細胞，各約(2～3)×106個，洗滌并固定。離心后細胞沉淀加入PI染液(內(nèi)含RNA酶)1 mL，欲檢測樣品用30目尼龍網(wǎng)過濾，上機檢測各組細胞的周期分布。

2 結果

2.1 免疫熒光法檢測HO8910及SKOV3細胞FSHR的表達 結果判定:紅色熒光表示FSHR表達陽性。HO8910細胞免疫熒光檢測FSHR為陽性，特異性位于細胞核周及細胞質(zhì)內(nèi)，見圖1。SKOV3細胞免疫熒光檢測FSHR為陰性，見圖2。

圖1 HO8910細胞FSHR免疫熒光染色陽性

圖2 SKOV3細胞FSHR免疫熒光染色陰性

2.2 MTT法測定FSH對HO8910細胞及SKOV3細胞的增殖 不同濃度FSH分別培養(yǎng)HO8910細胞和SKOV3細胞不同時間后，MTT比色法測定各組吸光值A，并分別比較各實驗組的增殖指數(shù)。增殖指數(shù)=實驗組吸光度(A)/對照組吸光度(A)×100%。見表1～表4。

由表1～表4可見，①不同濃度FSH作用于HO8910細胞24、48、72 h時，其A值均較對照組明顯升高，其增殖程度與FSH濃度呈濃度依賴效應，40 IU/L FSH 培養(yǎng)48 h時，細胞增殖指數(shù)最高(P<0.05)，其后隨著FSH濃度增加(直至160 IU/L)，該細胞株的增殖并未繼續(xù)增加，雖然仍有促進作用，但較40 IU/L時有所減弱；②不同濃度FSH作用于SKOV3細胞24、48、72 h時，其A值均較對照組略有升高，40 IU/L FSH培養(yǎng)48 h時，細胞增殖指數(shù)最高(P<0.05)，但未表現(xiàn)出明顯的FSH濃度依賴效應。

表1 FSH作用HO8910細胞的吸光值A

表2 FSH作用HO8910組間細胞增殖指數(shù)比較(%)

表3 FSH 作用SKOV3細胞的吸光值A

表4 FSH作用SKOV3組間細胞增殖指數(shù)比較(%)

注：*與對照組比較，P<0.05

2.3 流式細胞儀檢測HO8910細胞及SKOV3細胞的細胞周期分布 將等量HO8910細胞及SKOV3細胞分別接種至培養(yǎng)瓶中，細胞貼壁后進行同步化處理。根據(jù)“2.2”項結果，兩種細胞均以40 IU/L FSH作用48 h作為實驗組，以等量培養(yǎng)液替代作為對照組，流式細胞儀檢測HO8910細胞株和SKOV3細胞株細胞周期情況，見表5及圖3、圖4。

表5 兩組HO8910、SKOV3細胞周期分布(%)

圖3 FSH作用HO8910細胞后其細胞周期分布

圖4 FSH作用SKOV3細胞后其細胞周期分布

結果表明，①FSH作用于HO8910及SKOV3后，兩種細胞G0/G1期比例均減少，S期比例均增加，G2/M期比例均增加，以上差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；②FSH對HO8910(FSHR+)促進細胞分裂作用較SKOV3(FSHR-)更明顯，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

3 討論

卵巢癌病因復雜，目前說法不一，傳統(tǒng)說法包括卵巢癌發(fā)生的遺傳學說、持續(xù)排卵學說、高促性腺素學說以及卵巢癌的輸卵管起源學說等。近年來有學者提出，漿液性卵巢癌發(fā)生學的二元論模型，即低級別(高分化)漿液性卵巢癌發(fā)生存在多步驟過程，有前體病變，從良性轉(zhuǎn)變到交界性，再到惡性的癌變；而高級別(低分化)漿液性卵巢癌則直接起源于卵巢表面上皮或包涵囊腫，缺乏前體病變。而其遺傳學特征亦存在差異：在低級別漿液性癌K-RAS、B-RAF、P21等基因表達譜與交界性腫瘤相似；而高級別漿液性癌中P53及染色體不穩(wěn)定性更為常見，基因表達譜與交界性腫瘤明顯不同。傳統(tǒng)觀念認為，激素受體表達陽性的癌細胞分化較好，而本實驗中HO8910細胞雖為低分化漿液性腺癌，即屬于高級別癌，但經(jīng)免疫熒光法檢測其FSHR表達為陽性，可見FSHR與高級別卵巢癌之間仍存在一定的聯(lián)系。

眾所周知，F(xiàn)SH通常與FSHR特異性結合發(fā)揮活性作用，而卵巢癌高發(fā)于FSH水平升高的圍絕經(jīng)期及絕經(jīng)后期婦女，因此，推測高FSH環(huán)境與卵巢癌的發(fā)生可能有一定的內(nèi)在關系。在女性正常月經(jīng)周期中，排卵前FSH在血中含量僅為5～20 IU/L，而排卵前雖升高但不超過30 IU/L，絕經(jīng)后或卵巢功能衰退患者血FSH多>40 IU/L。本實驗中選取濃度為0～160 IU/L的FSH溶液作用于上皮性卵巢癌細胞株HO8910及SKOV3，利用MTT比色法檢測各組細胞的增殖情況，結果發(fā)現(xiàn)：當FSH 濃度較低時，對以上細胞雖略有促進增殖作用，但與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；當FSH 濃度為40 IU/L時，細胞增殖程度最高，且僅此時與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。以上結果提示，較高濃度的FSH可能為卵巢癌的誘導因素，支持Stadel等[13]提出的卵巢癌發(fā)生促性腺激素假說。其后在直至160 IU/L的FSH濃度范圍內(nèi)，這兩種卵巢癌細胞株的增殖并未繼續(xù)增加，雖然仍有促進作用，但較濃度為40 IU/L時卻有所減弱，不排除與培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)耗竭有關。

關于卵巢癌發(fā)病原因的各種學說，均與高FSH環(huán)境有關。本實驗構建了FSHR表達陽性和陰性的細胞模型，對兩種細胞分別給予不同濃度的FSH作用后，觀察到兩種細胞均有增殖，但在一定濃度的FSH范圍內(nèi)，F(xiàn)SHR表達陽性的HO8910細胞存在濃度依賴效應，符合界定致畸、致突變及致癌動物模型中的劑量效應關系。如前所述，在卵巢癌發(fā)生學二元論模型中低級別卵巢癌發(fā)生存在多步驟過程，有前體病變，從良性轉(zhuǎn)變到交界性，再到惡性的癌變，是一個環(huán)境累積的誘變過程。卵巢癌高發(fā)于40～60歲女性，從生物學上恰處于流行病學中絕經(jīng)前后FSH開始升高及自高分泌峰值逐漸衰退環(huán)境。而在FSHR表達陰性的SKOV3細胞雖然也有增殖，但未表現(xiàn)出此濃度依賴效應，推測與二元論學說中的高級別卵巢癌缺乏前體病變，高FSH環(huán)境直接誘發(fā)基因突變相關。

本實驗進一步利用流式細胞儀檢測HO8910細胞株和SKOV3細胞株細胞周期分布情況，根據(jù)MTT比色法的實驗結果，選取40 IU/L的FSH溶液作用48 h作為實驗組，以等量培養(yǎng)液替代作為對照組，結果兩種細胞均有由G0/G1期向S期及G2/M期轉(zhuǎn)化趨勢，但FSH對HO8910促進細胞分裂作用較SKOV3更明顯。此結果提示，F(xiàn)SH可以通過促進細胞周期時相變化而促進卵巢癌細胞增殖，且與FSHR陰性細胞相比，F(xiàn)SHR陽性細胞的周期時相變化更明顯，進一步支持卵巢癌發(fā)生的二元論學說。

綜上所述，通過建立FSH作用于HO8910和SKOV3兩種細胞模型，證實了FSH、FSHR均與卵巢癌的增殖相關。而且FSH對FSHR表達陽性的卵巢癌細胞作用呈劑量效應。FSH通過促進細胞周期時相變化而促進卵巢癌細胞增殖，且當FSHR陽性時，細胞周期變化更明顯。

[1] Wingo PA,Tong T,Bolden S.Cancer statistics[J].CA Cancer J Clin,1995,45(8):30.

[2] Holschneider CH,Berek JS.Ovarian cancer: epidemiology,biology,and prognostic factors[J].Semin Surg Oncol,2000,19(3):10.

[3] June Y,Hou Michael G,Herbert Yu,et al.Neoadjuvant chemotherapy lessens surgical morbidity in advanced ovarian cancer and leads to improved survival in stage IV disease [J].Gynecologic Oncology,2007,10(5): 211-217.

[4] Heintz AP,Odicino F,Maisonneuve P,et al.Carcinoma of the ovary.FIGO 6th Annual Report on the Results of Treatment in Gynecological Cancer[J].Int J Gynaecol Obstet,2006,9:161-192.

[5] Hankinson SE,Colditz GA,Hunter DJ,et al.A prospective study of reproductive factors and risk of epithelial ovarian cancer[J].Cancer,1995,76:284-290.

[6] Risch HA,Marrett LD,Jain M,et al.Differences in risk factors for epithelial ovarian cancer by histologic type.Results of a case-control study[J].Am J Epidemiol,1996,144:363-372.

[7] Tung KH,Wilkens LR,Wu AH,et al.Effect of anovulation factors on pre- and postmenopausal ovarian cancer risk: revisiting the incessant ovulation hypothesis[J].Am J Epidemiol,2005,161:321-329.

[8] Modugno F,Ness RB,Allen GO,et al.Oral contraceptive use,reproductive history,and risk of epithelial ovarian cancer in women with and without endometriosis[J].Am J Obstet Gynecol,2004,191:733-740.

[9] Bosetti C,Negri E,Trichopoulos D,et al.Long-term effects of oral contraceptives on ovarian cancer risk[J].Int J Cancer,2002,102:262-265.

[10]Scully RE,Young RH,Clement PB.Tumors of the ovary,maldeveloped gonads,fallopian tube,and broad ligament.In:Atlas of tumor pathology[M].Washington,DC: Armed Forces Institute of Pathology，1998:3

[11]Berek JS,Hacker NF.Practical gynecologic oncology[M].4th ed.Philadelphia,PA: Lippincott Williams & Wilkins,2005:443-541.

[12]Pecorelli S,Odicino F,Maisonneuve P,et al.Carcinoma of the ovary.Annual report on the results of treatment of gynaecological cancer,International Federation of Gynecology and Obstetrics[J].J Epidemiol Biostat,1998,23(3):75-102.

[13]Stadel BV.The etiology and prevention of ovarian cancer[J].Am J Obstet Gynecol,1975,123:772-774.

Effects of FSH and FSHR on proliferation of ovarian cancer cell line

LIU Xiao-mei1*,ZHENG Gui-ying2

(1.Department of Gynecology and Obstetrics,Shengjing Hospital of China Medical University,Shenyang 110004,China; 2.The Second Clinical Medical College of Jilin University,Changchun 130021,China)

Objective To study the effects of FSH and its receptor on the proliferation of ovarian cancer cell line，then discuss the potential biological mechanisms and function of FSH during the occurrence and development of the ovarian epithelial tumors.Methods We cultured HO8910 cells and SKOV3 cells with RPMI1640 culture medium which contained 10% fetal bovine serum.Then the follicle-stimu/lating hormone receptor (FSHR) expression of HO8910 and SKOV3 cells was assayed by immunofluorescence.0 IU/L of FSH was taken as a control group,the proliferation of HO8910 and SKOV3 cells cultured in different concentrations of FSH was assayed at different time points by Methyl thiazolyltetrazolium (MTT).Then the cells were cultured with the best FSH concentration at the best time,the cell cycle distribution was detected by flow cytometry (Fcm).Results ①The FSHR expression of HO8910 cell was positive,it located in the cytoplasm and around the nucleus; SKOV3 cell was negative.②At 24 h,48 h,72 h after HO8910 cells with different concentrations of FSH,the absorbance was significantly higher than that of control group,the degree of proliferation was in a concentration dependent manner.When FSH concentration was 40 IU/L,the cell proliferation index was the highest at 48 h (P<0.05).The proliferation of the cells did not increase,along with the increase of FSH concentration (up to 160 IU/L)②At 24 h,48 h,72 h after SKOV3 cells with different concentrations of FSH,the absorbance was slightly higher than that of control group,when FSH concentration was 40 IU/L,the cell proliferation index was the highest at 48 h(P<0.05),but the degree of proliferation was not in a concentration dependent manner.③HO8910 and SKOV3 cells were cultured with 40 IU/L of FSH for 48 h,G0/G1-phase fraction both reduced,S phase and G2/M phase fraction both increased (P<0.05),and the effects on HO8910 were more obvious than SKOV3 (P<0.05).Conclusion FSH and FSHR are confirmed to associate with the proliferation of ovarian cancer through the establishment of FSH acting on the HO8910 and SKOV3 cells.FSH has a dose effect on ovarian cancer cells with positive FSHR expression.FSH plays an important role in the promotion of cell cycle phase changes,especially on FSHR-positive cells.

Ovarian cancer cell line; Follicle-stimulating hormone; Follicle-stimulating hormone receptor

2014-07-23

1.中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院婦產(chǎn)科，沈陽110004；2.吉林大學第二臨床醫(yī)學院，長春130021

*通信作者

10.14053/j.cnki.ppcr.201504006