李 飛，成祥林

李 飛，成祥林*

目的 研究天麻素對戊四氮(PTZ)致疒間大鼠海馬氧化應(yīng)激水平的影響。方法 將30只成年Wistar大鼠隨機分為正常對照(NC)組、癲疒間模型(PTZ)組、天麻素(GS)組，觀察三組大鼠的行為學(xué)和腦電圖的變化，采用比色法檢測大鼠海馬超氧化物岐化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活力和丙二醛(MDA)含量的變化。結(jié)果 與PTZ組比較，GS組大鼠癲疒間發(fā)作程度減輕，腦電圖明顯改變，海馬組織中SOD和GSH-Px活力增加，MDA含量明顯減少(P<0.01)。結(jié)論 天麻素可通過增加癲疒間大鼠海馬SOD、GSH-Px活力、抑制MDA的產(chǎn)生，從而影響氧化應(yīng)激水平，達(dá)到對抗癲疒間的效果。

天麻素；癲疒間；戊四氮；氧化應(yīng)激

0 引言

癲疒間是由神經(jīng)元異常放電而導(dǎo)致大腦機能失調(diào)的一種慢性、反復(fù)發(fā)作性的疾病，發(fā)病率高，難以控制。目前，治療本病仍以藥物為主，但患者長期服用化學(xué)藥物的依從性差，不良反應(yīng)較大[1-2]，因此必須尋找有效、低毒的治療藥物。天麻作為傳統(tǒng)中藥，是治療癲疒間的主要藥物之一，其有效成分天麻素具有抗炎、抗氧化作用。本研究旨在通過觀察天麻素對戊四氮(PTZ)致癇大鼠的行為學(xué)、腦電圖、海馬超氧化物岐化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活力及丙二醛(MDA)含量的影響，探討天麻素抗癲疒間的機制。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 戊四氮及多聚甲醛均為Sigma公司產(chǎn)品；超氧化物歧化酶測試盒、谷胱甘肽過氧化物酶測試盒、丙二醛測定試劑盒由南京建成生物工程研究所提供；天麻素(C13H18O7)由江蘇寶澤堂醫(yī)藥科技有限公司提供(批號：20100801，純度：99.2%)。

1.2 動物

1.2.1 動物的分組與處理 Wistar大鼠由長江大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物中心提供，清潔級健康雄性Wistar大鼠30只，體重280～340 g。隨機分為正常對照組(NC組)、戊四氮(PTZ)組、天麻素(GS)組，每組10只。分籠飼養(yǎng)于正常晝夜環(huán)境中，正常進(jìn)食水。實驗室安靜、通風(fēng)、空氣清潔，溫度21～23 ℃，濕度42%～45%。

1.2.2 動物模型的制備 NC組腹腔內(nèi)給予生理鹽水10 mL/kg，1次/d，周期為10 d，第8、9、10天時腹腔注射給予生理鹽水45 mL/kg，1次/d；PTZ組腹腔內(nèi)給予生理鹽水10 mL/kg，1次/d，周期為10 d，第8、9、10天時每天腹腔注射戊四氮稀釋液(5 g/L)40 mL/kg[3]；GS組腹腔內(nèi)給予天麻素200 mg/kg，1次/d，周期為10 d，第8、9、10天時每天腹腔注射戊四氮稀釋液(5 g/L)40 mL/kg。三組實驗于周期第10天終止，完成注射后觀察2 h并記錄腦電圖。

1.2.3 腦電圖記錄 清醒狀態(tài)下將大鼠固定，采用頭皮針電極、雙極導(dǎo)聯(lián)法(額-頂)連接。電極分別取兩眼連線中點(額葉)及兩耳連線中點(頂葉)插入固定，鼻根部接地線。

1.2.4 行為學(xué)觀察 參照Racine癲疒間發(fā)作行為標(biāo)準(zhǔn)[4]進(jìn)行觀察記錄：Ⅰ級：面肌抽動；Ⅱ級：節(jié)律性動頭；Ⅲ級：前肢抽搐；Ⅳ級：軀干及前肢陣攣；Ⅴ級：四肢抽搐、全身陣攣。

1.2.5 標(biāo)本采集與處理 觀察2 h后，三組大鼠均行心臟灌注固定、斷頭取腦，依據(jù)文獻(xiàn)[5]確定腦及海馬部位、形態(tài)，制備海馬組織勻漿，全過程不超過15 min。

1.2.6 指標(biāo)測定 按照南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的超氧化物歧化酶測試盒、谷胱甘肽過氧化物酶測試盒、丙二醛測定試劑盒說明書操作。采用考馬斯亮藍(lán)蛋白檢測法檢測海馬組織中的蛋白含量。

2 結(jié)果

2.1 行為變化 PTZ組大鼠給藥后平均56 s出現(xiàn)眨眼、動須、節(jié)奏性咀嚼、節(jié)律性點頭、肢體抽搐等表現(xiàn)，其中7只出現(xiàn)Ⅴ級發(fā)作，2只出現(xiàn)Ⅳ級發(fā)作，1只出現(xiàn)Ⅲ級發(fā)作。GS組大鼠給藥后平均12 min出現(xiàn)上述表現(xiàn)，其中1只出現(xiàn)Ⅳ級發(fā)作，1只出現(xiàn)Ⅲ級發(fā)作，6只出現(xiàn)Ⅱ級發(fā)作，2只出現(xiàn)Ⅰ級發(fā)作。N組給藥前后均無明顯變化。PTZ組與NC組、GS組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 三組大鼠行為學(xué)改變比較(只)

2.2 腦電圖變化 NC組大鼠腦電圖表現(xiàn)為α或β波， PTZ組10只大鼠均出現(xiàn)陣發(fā)性癇性放電，表現(xiàn)為高電位的棘波、尖波、棘-慢復(fù)合波、尖-慢復(fù)合波；GS組部分大鼠有尖波、棘-慢復(fù)合波、尖-慢復(fù)合波出現(xiàn)，PTZ組與NC組、GS組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 三組大鼠腦電圖改變比較

2.3 檢測結(jié)果 三組大鼠海馬SOD、GSH-Px活性及MAD含量比較見表3。與NC組比較，GS組、PTZ組的SOD活力明顯下降(P<0.05，P<0.01)；與PTZ組比較，GS組SOD活力明顯升高(P<0.05)。PTZ組GSH-Px活力較NC組明顯降低(P<0.01)，GS組GSH-Px活力較PTZ組明顯升高(P<0.05)，GS組GSH-Px活力與NC組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。PTZ組MDA含量較NC組明顯升高(P<0.01)，GS組MDA含量較PTZ組明顯降低(P<0.01)。GS組MDA含量與NC組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表3 三組大鼠海馬SOD、GSH-Px、MDA指標(biāo)比較

3 討論

氧化應(yīng)激(Oxidative stress)是指機體或細(xì)胞內(nèi)氧自由基的產(chǎn)生與清除失衡，導(dǎo)致活性氧(Reactive oxygen species，ROS)和活性氮(Reactive nitrogen species，RNS)在體內(nèi)或細(xì)胞內(nèi)蓄積而引起的氧化損傷過程。近年大量試驗發(fā)現(xiàn)自由基與癲疒間的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切，動物試驗及臨床觀察均表明癲疒間時伴有非?；钴S的自由基活動[5-6]。有研究表明，活性氧自由基可以增加通過膜的脂質(zhì)過氧化以及減少致癇灶的GSH-Px水平，引起神經(jīng)元變性[7]。另外，MDA是自由基脂質(zhì)過氧化的主要代謝產(chǎn)物，其含量可以反映機體脂質(zhì)過氧化的程度，間接反映氧化應(yīng)激水平。Gulati等[8]研究也證實癲疒間組動物腦組織勻漿中的MDA水平升高，而抗氧化劑預(yù)處理可以減輕這一改變。SOD是機體非常重要的自由基清除劑，兩者活力的高低間接反映機體清除氧自由基的能力。Eun等[9]報道，SOD與癲疒間的發(fā)病機制存在明顯聯(lián)系。Ilhan等[10]利用戊四氮制作大鼠癲疒間模型，來研究厄多半胱對其氧化應(yīng)激的改善作用，證實癲疒間過程存在氧化應(yīng)激。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，自由基清除劑依達(dá)拉奉可以有效減輕癲疒間大鼠的發(fā)作次數(shù)，并且對癲疒間大鼠皮質(zhì)、海馬的谷氨酸及其受體、轉(zhuǎn)運體都有抑制作用，因此也證明自由基在癲疒間的發(fā)生與發(fā)展中起重要作用[11]。

天麻為蘭科天麻屬植物天麻(Gastrodin elala BL)的干燥塊莖，主產(chǎn)于云南、四川、陜西及貴州等地，主要有抗炎、清除自由基、抗凋亡效應(yīng)[12-13]。天麻的主要藥物活性成分為天麻素(對羥基苯甲醇-O-β-D-吡喃葡萄糖苷)。有研究表明，天麻的抗癲疒間活性主要是通過天麻素來完成的[14]。此外，筆者在長期臨床工作中發(fā)現(xiàn)，對于常規(guī)西藥難以控制的癲疒間(特別是癲疒間持續(xù)狀態(tài))，合用天麻素注射液，可以更好地控制癲疒間發(fā)作(與對照組比較，患者發(fā)作持續(xù)時間更短，發(fā)作次數(shù)明顯減少，癲疒間樣放電明顯抑制)。對于天麻素的具體抗癲疒間機制，國內(nèi)外學(xué)者也進(jìn)行了初步探討。Xu等[15]研究發(fā)現(xiàn)，天麻素可以明顯抑制低氧誘導(dǎo)的細(xì)胞外谷氨酸水平的升高；趙燕玲等[16]報道，海人酸誘導(dǎo)大鼠大腦皮層神經(jīng)元凋亡過程中EphA4表達(dá)增高，天麻素在這一過程中抑制EphA4表達(dá)，對神經(jīng)元具有一定保護(hù)作用；穆朝娟等[14]發(fā)現(xiàn)，天麻素能減輕戊四氮致癇大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，從多個層面保護(hù)腦組織，減輕由癲疒間導(dǎo)致的損傷；曹亞芹等[17]研究表明，天麻素能夠降低致病大鼠驚厥的易感性，抑制大鼠顳葉和海馬區(qū)Cx43表達(dá)，抑制異?？p隙連接的形成，達(dá)到抗癲疒間形成。

本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，癲疒間組大鼠MDA升高，SOD、GSH-Px降低，說明癲疒間大鼠體內(nèi)抗氧化/氧化平衡被打破，發(fā)生了氧化反應(yīng)。天麻素干預(yù)后癲疒間大鼠 MDA降低，SOD、GSH-Px升高，說明天麻素可以明顯改善癲疒間導(dǎo)致的氧化損傷，從而推測天麻素是通過減輕氧化應(yīng)激水平而起到神經(jīng)保護(hù)作用。同時，天麻素組大鼠較模型組癲疒間發(fā)作時大鼠的行為學(xué)和腦電圖有明顯改善，提示天麻素能減輕癲疒間發(fā)作的危害程度。

綜上所述，癲疒間發(fā)病機制非常復(fù)雜，除與氧化應(yīng)激有關(guān)外，還有其他方面的因素，而天麻素可能僅從降低氧化應(yīng)激水平方面縮短癲疒間發(fā)作時間，減輕神經(jīng)元損傷，從而起到保護(hù)神經(jīng)元的作用，但不能完全防治癲疒間的發(fā)作。

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Effect of gastrodin on oxidative stress of hippocampus in epileptic rats

LI Fei,CHENG Xiang-lin*

(Department of Emergency,The First Affiliated Hospital of Yangtze University,Jingzhou 434000,China)

Objective To explore the effect of gastrodin on oxidative stress of hippocampus in epileptic rats induced by pentylenetetrazole(PTZ).Methods 30 adult Wistar rats were randomly divided into normal control(NC)group,epileptic model(PTZ)group and gastrodin (GS)group.The changes of electroencephalogram and ethology of the three groups were observed,and the superoxide dismutase(SOD),glutathione peroxidase(GSH-Px),malondialdehyde(MDA)content were detected by colorimetry.Results Compared with GS group and PTZ group,the activity of SOD and GSH-Px in epilepsy rats reduced,EEG changed,hippocampus increased and MDA content decreased significantly(P<0.01),the seizures degree reduced.Conclusion Gastrodin could increase the SOD and GSH-Px activity in hippocampus of epilepsy rats,inhibit the production of MDA,achieve the antagonistic epilepsy effect by affecting the level of oxidative stress.

Gastrodin;Epilepsy;Pentylenetetrazole;Oxidative stress

2014-09-11

長江大學(xué)附屬第一醫(yī)院急診科，湖北 荊州 434000

2013-2014年度湖北省衛(wèi)生廳科研一般項目(JX6B33)

10.14053/j.cnki.ppcr.201506008

*通信作者