計春燕 譚詩云

表沒食子兒茶素沒食子酸酯通過抑制Akt信號通路誘導(dǎo)大腸癌細(xì)胞凋亡

計春燕 譚詩云

目的 探討表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)對大腸癌細(xì)胞系HT-29細(xì)胞增殖和凋亡的影響及可能的作用機(jī)制。 方法 體外培養(yǎng)的HT-29細(xì)胞,分為對照組和實(shí)驗(yàn)組,實(shí)驗(yàn)組和對照組加入同等體積的培養(yǎng)基,實(shí)驗(yàn)組用不同濃度(15～120 μg/ml)EGCG分別處理24、48、72 h,MTT比色法測定其對HT-29細(xì)胞增殖的影響;EGCG(濃度分別為0、15、30、60 μg/ml)處理HT-29細(xì)胞48 h后,流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡,分光光度計檢測Casepase-9相對活性,Rho123探針染色流式細(xì)胞儀檢測線粒體膜電位變化,Western blot法檢測Bax、Bcl-2、Akt、p-Akt、p-GSK-3β的表達(dá)。 結(jié)果 EGCG能有效抑制HT-29細(xì)胞增殖,且呈劑量和時間依賴性;EGCG(15、30、60 μg/ml)作用于HT-29細(xì)胞48 h后,細(xì)胞凋亡率分別為11.6%、23.4%、34.5%;Bax表達(dá)量上調(diào),而Bcl-2表達(dá)量下調(diào);Casepase-9相對活性顯著增加;線粒體膜電位顯著降低;此外,EGCG可抑制p-Akt及其下游蛋白p-GSK-3β的表達(dá)。 結(jié)論 EGCG可通過抑制HT-29細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡,其作用機(jī)制可能與抑制Akt信號通路,繼而激活線粒體凋亡途徑相關(guān)。

表沒食子兒茶素沒食子酸酯; HT-29細(xì)胞; 凋亡; Akt信號通路

大腸癌是常見的消化道惡性腫瘤,其死亡率高居腫瘤相關(guān)死亡的第2位。全球每年有>120萬的新增病例,并有>60萬大腸癌患者死亡[1-2]。隨著我國經(jīng)濟(jì)的發(fā)展、人民生活水平的提高、生活方式的西方化及體力活動的減少等因素,大腸癌的發(fā)病率和死亡率逐漸上升。大腸癌治療方法以手術(shù)切除為主,輔以化療,但常規(guī)的化療藥物毒性大且常出現(xiàn)耐藥性,因此尋找具有抗腫瘤活性的天然化合物成為國內(nèi)外研究熱點(diǎn)。近年來研究發(fā)現(xiàn)綠茶中富含兒茶素,其具有多種藥理學(xué)活性,包括抗腫瘤、抗炎、降血壓、降脂、降血糖及抗氧化等。其中表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechingallate, EGCG)是兒茶素中含量最高、活性最強(qiáng)的單體,國內(nèi)外研究證實(shí),EGCG對前列腺癌、肝癌、乳腺癌等多種腫瘤細(xì)胞均有抑制作用[3-5]。

Akt信號通路在細(xì)胞代謝、增殖、凋亡及腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中起重要調(diào)控作用,過度激活的Akt通路可促進(jìn)細(xì)胞增殖并抑制細(xì)胞凋亡[6-7]。本研究旨在探討EGCG對大腸癌HT-29細(xì)胞增殖和凋亡的影響,探討其對Akt信號通路的影響,并分析其作用機(jī)制,以期為臨床應(yīng)用提供理論研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料 大腸癌細(xì)胞HT-29細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫;EGCG、羅丹明123(Rhodamine 123, Rho123)購自sigma公司;AnnexinV/PI試劑盒購于BENDER公司;胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)液購于碧云天生物技術(shù)研究所;MTT試劑盒、辣根酶標(biāo)記山羊抗兔或山羊抗鼠IgG購于武漢谷歌生物科技有限公司;Caspase-9活性檢測試劑盒購于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司;Akt, p-Akt (Ser473), p-GSK-3β (Ser9), Bax, Bcl-2 及β-actin抗體購自Cell Signaling Technology公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng):HT-29細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI1640培養(yǎng)液中(含10%小牛血清,100 U/ml青霉素,100 μg/ml鏈霉素),置于37 ℃,飽和濕度,5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),根據(jù)生長情況2～3 d傳代1次,取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 MTT比色法檢測細(xì)胞活力:取對數(shù)生長期的HT-29細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度(1×104/ml)種于96孔板內(nèi),每孔200 μl,細(xì)胞貼壁后分為對照組和實(shí)驗(yàn)組,實(shí)驗(yàn)組換EGCG終濃度為15、30、60、120 μg/ml的培養(yǎng)液,對照組加入等量的培養(yǎng)液,每組5個復(fù)孔,并設(shè)置調(diào)零孔(不含細(xì)胞孔中加入等量的培養(yǎng)液)。繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h,于實(shí)驗(yàn)結(jié)束前4 h每孔加入20 μl MTT溶液,繼續(xù)孵育4 h,小心吸掉上清,每孔加150 μl DMSO,搖床上振蕩10 min,結(jié)晶充分溶解后酶標(biāo)儀上檢測490 nm處的吸光值(A值),根據(jù)公式計算細(xì)胞活力:細(xì)胞活力(%)=[(實(shí)驗(yàn)組平均A值-調(diào)零孔A值)/(對照組平均A值-調(diào)零孔A值)]×100%。

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡:將對數(shù)生長期細(xì)胞(濃度為1×106/ml)接種于6孔板中,貼壁后分為對照組和實(shí)驗(yàn)組,實(shí)驗(yàn)組加入含EGCG(終濃度為0、15、30、60 μg/ml)的培養(yǎng)液,對照組加入等量培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)48 h后,收集細(xì)胞,離心、洗滌后加入AnnexinV-FITC 和PI,室溫避光染色。篩網(wǎng)過濾后送上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.2.4 分光光度法檢測Caspase-9活性變化:細(xì)胞接種及分組同上,收集細(xì)胞,分別加入50 μl冷裂解緩沖液,冰浴裂解15 min,然后4 ℃,1200 r/min離心15 min,將上清移至預(yù)冷的離心管中,置于冰上,取5 μl用BCA法測定蛋白濃度,取50 μl調(diào)好蛋白濃度(2～4 g/L),加入20 μl緩沖液吹打均勻,加入5 μl Caspase-9反應(yīng)底物Ac-LEHD-pNA,細(xì)胞培養(yǎng)箱中避光孵育4 h,酶標(biāo)儀上405 nm處測定吸光值(A405)。

1.2.5 Rho123染色流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞線粒體膜電位水平:細(xì)胞接種及分組同上,收集細(xì)胞,PBS漂洗3次,重懸于1 ml的1 μg/ml Rho123中,放置培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育30 min。PBS再洗滌3次,用EPICS-XL型流式細(xì)胞儀以507 nm為激發(fā)波長,529 nm為發(fā)射波長測定細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度。

1.2.6 western blot檢測Akt、 p-Akt (Ser473)、p-GSK-3β (Ser9)、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)變化:細(xì)胞接種及分組同上,收集細(xì)胞,參照細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒的說明書提取細(xì)胞總蛋白,BCA法測定蛋白濃度,蛋白樣品加入1/5體積的5×上樣緩沖液,沸水煮沸5 min后上樣(20 μg/孔),行10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳,后電轉(zhuǎn)至PVDF膜上,5%脫脂奶粉室溫封閉1 h,分別加入1∶1000稀釋的兔抗或鼠抗人Akt、 p-Akt (Ser473)、 p-GSK-3β (Ser9)、 Bax及Bcl-2蛋白,4 ℃過夜,β-actin作為內(nèi)參,TBST洗膜后加入1∶1000稀釋的辣根酶標(biāo)記的山羊抗兔或山羊抗鼠IgG,室溫孵育2 h,再次洗膜后加入ECL發(fā)光液顯色,觀察各條帶深淺變化。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 所有資料經(jīng)SPSS 17.0統(tǒng)計軟件處理,計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,兩樣本間參數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),以P< 0. 05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EGCG對HT-29細(xì)胞活力的影響 EGCG在15～120 μg/ml濃度范圍內(nèi)均能抑制HT-29細(xì)胞的活力,且隨著藥物濃度的增加,抑制作用越明顯,同一藥物濃度,隨著作用時間的延長,細(xì)胞活力亦逐漸降低,呈顯著的劑量和時間依賴效應(yīng)。見表1。

表1 EGCG對HT-29細(xì)胞活力的影響

注:與EGCG 0 μg/ml比較,*P<0.05

2.2 EGCG對HT-29細(xì)胞凋亡的影響 HT-29細(xì)胞經(jīng)EGCG處理后行流式細(xì)胞儀凋亡檢測結(jié)果顯示,EGCG(15、30、60 μg/ml)處理后,細(xì)胞凋亡率較對照組的凋亡率(2.3%)明顯升高,分別為11.6%、23.4%、34.5%。見圖1。

圖1 EGCG對HT-29細(xì)胞凋亡率的影響

2.3 EGCG對HT-29細(xì)胞Bax、Bcl-2表達(dá)的影響 Western blot結(jié)果顯示,EGCG(15、30、60 μg/ml)作用HT-29細(xì)胞48 h后,Bax蛋白表達(dá)隨著藥物濃度的升高也逐漸增加,而Bcl-2蛋白表達(dá)量則逐漸降低,呈濃度依賴性。見圖2。

2.4 EGCG對HT-29細(xì)胞Caspase-9活性的影響 Caspase-9活性檢測結(jié)果顯示,EGCG(15、30、60 μg/ml)處理后,HT-29細(xì)胞Caspase-9相對活性分別為0.177±0.04、0.231±0.05和0.306±0.04,與對照組(0.108±0.03)比較,Caspase-9相對活性明顯升高(P<0.05)。

2.5 EGCG對HT-29細(xì)胞線粒體膜電位的影響 細(xì)胞

圖2 EGCG對HT-29細(xì)胞Bax、Bcl-2表達(dá)的影響

線粒體膜電位檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),EGCG(15、30、60 μg/ml)處理48 h后,HT-29細(xì)胞線粒體熒光強(qiáng)度隨著藥物濃度的升高逐漸降低,分別為76.48±2.34、56.32±2.46、37.76±2.16(P<0.05);Rho123熒光強(qiáng)度值可間接反映線粒體膜電位(MMP)相對強(qiáng)度。結(jié)果顯示EGCG能降低HT-29細(xì)胞的線粒體膜電位。

2.6 EGCG對HT-29細(xì)胞Akt信號通路的影響 EGCG(15、30、60 μg/ml)作用HT-29細(xì)胞48 h后,Western blot 檢測Akt信號通路相關(guān)蛋白,細(xì)胞總的Akt表達(dá)量沒有變化,而p-Akt表達(dá)減少,同時,Akt下游效應(yīng)蛋白p-GSK-3β表達(dá)也減少,且呈濃度依賴性。表明EGCG能抑制Akt磷酸化,并抑制下游蛋白的活性,即抑制Akt信號通路。見圖3。

圖3 EGCG對HT-29細(xì)胞Akt信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3 討論

細(xì)胞凋亡是維持多細(xì)胞機(jī)體平衡的一個重要生理機(jī)制,細(xì)胞過度增殖及凋亡不足在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中起重要作用[8],通過抑制細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡可能是腫瘤治療的有效途徑。本研究發(fā)現(xiàn),EGCG在15～120 μg/ml濃度范圍內(nèi)均能有效抑制HT-29細(xì)胞的增殖,且隨著藥物濃度的增加和作用時間的延長,抑制作用亦逐步增強(qiáng),呈明顯的劑量和時間依賴效應(yīng)。此外,本研究進(jìn)一步探討了EGCG對是否通過促進(jìn)細(xì)胞凋亡發(fā)揮抑制細(xì)胞的增殖作用。流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示,EGCG處理HT-29細(xì)胞后,細(xì)胞凋亡率明顯升高。提示EGCG能抑制大腸癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

細(xì)胞凋亡是程序化、多基因調(diào)控的細(xì)胞死亡過程,凋亡過程受到凋亡促進(jìn)蛋白和凋亡抑制蛋白的共同調(diào)節(jié)及其相互間協(xié)調(diào)。Bcl-2是一種內(nèi)膜蛋白,主要存在于線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核膜上,Bcl-2在多種腫瘤細(xì)胞中表達(dá),是公認(rèn)的強(qiáng)效凋亡抑制分子,主要是通過增強(qiáng)線粒體膜電位,保持線粒體內(nèi)外膜的完整性,及抑制鈣離子釋放,阻止核酸內(nèi)切酶活化等機(jī)制發(fā)揮抗凋亡作用[9-11];Bax亦屬于Bcl-2家族成員,但其與Bcl-2作用相反,Bax可直接激活死亡效應(yīng)因子Caspase或改變細(xì)胞膜通透性引起細(xì)胞色素C釋放某些離子和小分子通過細(xì)胞膜,進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡[12]。細(xì)胞Bcl-2和Bax比例改變可調(diào)控細(xì)胞凋亡發(fā)生與否[13],當(dāng)Bcl-2占優(yōu)勢時,細(xì)胞具有抗凋亡作用,反之,當(dāng)Bax表達(dá)上調(diào)時,細(xì)胞易被誘導(dǎo)凋亡。本研究發(fā)現(xiàn),HT-29細(xì)胞經(jīng)EGCG處理48 h后,細(xì)胞Bax蛋白表達(dá)量逐漸升高,而Bcl-2蛋白表達(dá)量則逐漸降低,呈濃度依賴性。同時細(xì)胞線粒體膜電位降低,Caspase-9活性顯著升高。Caspase家族的激活在細(xì)胞凋亡過程中扮演著至關(guān)重要的角色,被認(rèn)為是誘發(fā)細(xì)胞凋亡的直接效應(yīng)物。Caspase-9作為線粒體凋亡途徑的關(guān)鍵酶,處于Caspase“瀑布式”激活的頂端,其活化可進(jìn)一步激活Caspase-3,后者是細(xì)胞凋亡的“執(zhí)行器”,其活化標(biāo)志著凋亡進(jìn)入不可逆階段[14],繼而裂解DNA修復(fù)相關(guān)分子、凋亡抑制蛋白、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白和骨架蛋白等,最終促進(jìn)細(xì)胞凋亡。這些結(jié)果提示EGCG可能通過線粒體途徑誘導(dǎo)HT-29細(xì)胞凋亡。

本研究進(jìn)一步探討了EGCG引起凋亡的機(jī)制。Akt及p-Akt在多種類型的腫瘤中過表達(dá),p-Akt是Akt的活化形式,活化的Akt在介導(dǎo)細(xì)胞生長、增殖、侵襲轉(zhuǎn)移、凋亡、抵抗化療、放療等方面有重要作用[15-16]。Akt磷酸化激活后,可對下游相關(guān)蛋白包括BAD、Caspase-9、GSK-3β、NF-κB等進(jìn)行調(diào)節(jié),最終促進(jìn)細(xì)胞增殖并抑制細(xì)胞凋亡。Akt激活后可使BAD磷酸化,后者與Bcl-2或Bcl-xL解聚,游離的Bcl-2發(fā)揮凋亡抑制作用[17]。此外,Akt信號通路可直接或間接調(diào)控其他信號通路[18],因此,抑制Akt信號通路可能成為腫瘤治療的有效方法。本研究發(fā)現(xiàn),EGCG處理HT-29細(xì)胞后,細(xì)胞總Akt表達(dá)量沒有變化,而p-Akt表達(dá)減少,同時,Akt下游效應(yīng)蛋白p-GSK-3β表達(dá)也減少。表明EGCG能抑制Akt信號通路。

總之,本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)EGCG可抑制HT-29細(xì)胞增殖,并促進(jìn)細(xì)胞凋亡,其機(jī)制可能與EGCG抑制Akt信號通路,繼而激活線粒體凋亡途徑相關(guān)。EGCG的潛在作用機(jī)制尚需進(jìn)一步探索和研究,作為前景廣闊的抗腫瘤藥物,EGCG有望能成為高效低毒的抗腫瘤藥物，單獨(dú)或與傳統(tǒng)化療藥物聯(lián)合應(yīng)用于臨床。

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EGCG induces cell apoptosis through inhibiting Akt signaling pathway in HT-29 colorectal cancer cells

JIChun-yan.DepartmentofGastroenterology,HubeiXinhuaHospital,Wuhan430015,China;TANShi-yun.DepartmentofGastroenterology,People’sHospitalofWuhanUniversity,Wuhan430060,China

Objective To investigate the effect of epigallocatechingallate (EGCG) on cell proliferation and apoptosis in colorectal cancer line HT-29 cells and to explore the possible mechanisms. Methods HT-29 cells were cultured in vitro, and were divided into two groups, control group and drug-treated group. The control group received only the culture medium. After treatment by EGCG at different concentrations respectively at different time, the cell survival was determined by MTT method. Apoptosis was detected by flow cytometry. The relative activity of caspase-9 was monitored by spectrophotometer. The mitochondrial membrane potential was evaluated by flow cytometry analysis after Rho123 probe staining. Western blot was used for Bcl-2, Bax, Akt, p-Akt and p-GSK-3β protein analysis. Results From the data of MTT, the cell proliferation of HT-29 cells was inhibited by EGCG at a dose-dependent and time-dependent manner. Flow cytometry analysis showed that EGCG significantly induced cell apoptosis. After treatment with EGCG(15,30,60 μg/ml) , the apoptosis rate of HT-29 cells was 11.6%, 23.4%, 34.5%, which showed an obvious concentration-effect relationship. The treatment with EGCG promoted the expression of pro-apoptotic factor Bax, and suppressed the expression of anti-apoptotic factor Bcl-2. The relative activity of caspase-9 of EGCG group was increased. Furthermore, the mitochondrial membrane potential was reduced. The data of western blot showed that EGCG decreased the expression of p-AKT and downstream effector of Akt, p-GSK-3β at a dose-dependent manner. Conclusions EGCG inhibits the cell proliferation and induces cell apoptosis of HT-29 cells, and the effects of antitumor may be associated with inhibition of the Akt signaling pathway, thus activating mitochondria apoptosis pathway.

epigallocatechingallate; HT-29 cell; apoptosis; Akt signaling pathway

湖北省自然科學(xué)基金課題(302-131854)

430015湖北省武漢市,湖北省新華醫(yī)院消化內(nèi)科(計春燕);430060湖北省武漢市,武漢大學(xué)人民醫(yī)院消化內(nèi)科(譚詩云)

R 735.34

A

10.3969/j.issn.1003-9198.2015.07.019

2014-08-15)