暢濤，楊成德，薛莉，楊小利，馮中紅，郝蓉蓉，張振粉，陳秀蓉

(草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室,甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院,甘肅省草業(yè)工程實驗室,中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心,甘肅 蘭州730070)

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珠芽蓼內(nèi)生菌ZA1對馬鈴薯的防病促生研究

暢濤，楊成德*，薛莉，楊小利，馮中紅，郝蓉蓉，張振粉，陳秀蓉

(草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室,甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院,甘肅省草業(yè)工程實驗室,中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心,甘肅 蘭州730070)

利用常規(guī)方法對莫海威芽孢桿菌ZA1分泌吲哚乙酸(IAA)、固氮、溶磷和產(chǎn)抑菌酶等能力進(jìn)行定性測定，并在室內(nèi)和大田條件下對其防治馬鈴薯病害及促生作用進(jìn)行了研究。ZA1在含和不含色氨酸的King培養(yǎng)基中分泌IAA分別為12.17和9.75 mg/L，具有固氮能力并能分泌胞外蛋白酶，但無溶磷能力，且不能產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶和葡聚糖酶；10倍液噴霧對貯藏期馬鈴薯壞疽病的防效達(dá)85.9%；20倍液拌種對田間馬鈴薯晚疫病防效為26.56%，但馬鈴薯商品薯增產(chǎn)率達(dá)36.29%，每hm2增產(chǎn)率達(dá)33.88%。采用10倍稀釋液對馬鈴薯塊莖拌種后盆栽55 d，根、莖及葉綠素含量均高于對照，其中經(jīng)10倍ZA1處理后，根長與干、鮮重分別增加8 cm、0.75 g和5.07 g，株高、莖粗及莖干、鮮重分別增加2.74 cm、0.27 cm、0.52 g和5.73 g，干濕根冠比分別增加0.214和0.094，葉綠素含量增加0.54 mg/g；且可誘導(dǎo)馬鈴薯植株內(nèi)的過氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT )和苯丙氨酸解氨酶(PAL)酶活性增加。本研究明確了菌株ZA1對馬鈴薯的防病促生作用及對其防御酶的誘導(dǎo)，為ZA1開發(fā)成為微生物農(nóng)藥及菌肥提供理論依據(jù)。

莫海威芽孢桿菌；馬鈴薯；防病促生；防御酶

馬鈴薯(Solannmtuberosum)在全國種植面積較廣，是農(nóng)民重要的經(jīng)濟(jì)支柱。據(jù)調(diào)查，近年來，馬鈴薯貯藏期病害發(fā)生嚴(yán)重，其中以馬鈴薯壞疽病菌(Phomafoveata)引起的進(jìn)境檢疫病害馬鈴薯壞疽病最為嚴(yán)重，嚴(yán)重影響馬鈴薯的品質(zhì)，加之馬鈴薯苗期晚疫病(Phytophthorainfestans)發(fā)病率較高，導(dǎo)致馬鈴薯的商品薯率下降，帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。貯藏庫中，由于不便多次施用化學(xué)農(nóng)藥進(jìn)行防治，而生物防治可以1次施用，菌株定殖后較長時間有效，因此成為馬鈴薯貯藏期病害防治的更佳途徑。目前，植物內(nèi)生菌[1]作為生防菌的來源之一，已成為研究熱點。目前，有關(guān)從植物體內(nèi)分離得到可以抑制植物病原菌的內(nèi)生菌[2-9]的文獻(xiàn)較多，且分離得到的部分內(nèi)生菌憑借其生物學(xué)功能可以使植物得到更多的養(yǎng)分補(bǔ)充[10-13]，從而達(dá)到對植物的促生作用。對生防菌抑菌機(jī)制的研究更是得到眾多學(xué)者的青睞，劉雪等[14]認(rèn)為，生防菌之所以能夠抑制病原菌，是因為其能夠產(chǎn)生胞外分泌型抑菌物質(zhì)；與此同時，邢介帥等[15]從生防菌T2中分離純化得到了具有抑菌作用的胞外蛋白酶，經(jīng)過進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，生防菌還可以分泌小分子量的抗菌肽[16]和大分子量的抑菌蛋白[17]等胞外分泌型物質(zhì)；也有學(xué)者從植物誘導(dǎo)抗病性入手研究生防菌的防病機(jī)制，如孫建波等[18]、楊海蓮等[19]通過試驗證明生防菌可誘導(dǎo)植物的防御酶，使其活性增加，從而達(dá)到抵抗病原菌侵染的目的。本課題組從東祁連山高寒草地珠芽蓼(Polygonumviviparum)內(nèi)生細(xì)菌中篩選得到的莫海威芽孢桿菌(Bacillusmojavensis)ZA1對馬鈴薯壞疽病菌具有明顯的抑制作用，且該菌株對馬鈴薯貯藏期的多種病害具有較好的抑制作用[20]，雖然莫海威芽孢桿菌ZA1對P.foveata的室內(nèi)抑制效果明顯，但其對馬鈴薯在貯藏期及田間的防病促生是否明顯有待于研究，其防病促生的機(jī)制也有待于明確，加之馬鈴薯壞疽病是我國檢疫性病害，有關(guān)其生物防治國內(nèi)除本項目組外未見報道，對該病害的生物防治研究具有一定的意義。因此，明確菌株ZA1的生物學(xué)功能及其在貯藏期和田間的防病促生作用，為ZA1開發(fā)成為微生物菌肥及農(nóng)藥提供理論依據(jù)，以便為馬鈴薯生長期促生及貯藏期病害防治提供新的途徑和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1供試菌株 供試拮抗菌：莫海威芽孢桿菌(Bacillusmojavensis)ZA1，為珠芽蓼內(nèi)生細(xì)菌；供試病原菌：馬鈴薯壞疽病菌，均由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理實驗室提供。

1.1.2供試農(nóng)藥及馬鈴薯品種 供試農(nóng)藥：75%肟菌·戊唑醇(75% Oxime bacteria·tebuconazole,水分散劑，德國拜耳集團(tuán))；25%嘧菌酯(25% Azoxystrobin,懸浮劑，英國先正達(dá)有限公司)；供試品種：新大坪，隴薯3號。

1.1.3供試培養(yǎng)基 牛肉胨培養(yǎng)基、牛肉胨培養(yǎng)液、馬鈴薯葡萄糖瓊膠培養(yǎng)基、無機(jī)磷培養(yǎng)基(PKO)、阿須貝培養(yǎng)基、幾丁質(zhì)培養(yǎng)基、葡聚糖培養(yǎng)基和蛋白酶培養(yǎng)基[15,21-23]。

1.2ZA1產(chǎn)IAA、溶磷和固氮能力測定

1.2.1產(chǎn)IAA的定性及定量測定 采用Salkowski比色法對ZA1進(jìn)行產(chǎn)IAA能力測定，3個重復(fù)均變紅為陽性，表示能分泌IAA，不變色為陰性，表示不分泌IAA。制作純3-IAA標(biāo)準(zhǔn)曲線，配制2組濃度依次為2.5，5.0，7.5，10.0，12.5，15.0，17.5 mg/L和25，50，75，100，125，150，175 mg/L的標(biāo)液，分別取4 mL，在1組中加入PC比色液4 mL，另1組中加入S2比色液4 mL，黑暗靜置30 min，取出后測其OD530值，制作純3-IAA標(biāo)準(zhǔn)曲線。將培養(yǎng)12 d的ZA1的菌懸浮液和空白對照離心10 min，轉(zhuǎn)速為10000 r/min，取上清液4 mL分別加入等量比色液，黑暗靜置30 min后測OD530值，以加了比色液的空白為對照。用相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算菌株分泌IAA的量。

1.2.2溶磷能力的定性測定 將ZA1點接于PKO(或蒙金娜)平板培養(yǎng)基上，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 d后，觀察菌株在培養(yǎng)基平板上形成的溶磷圈，有溶磷圈的記為陽性。

1.2.3固氮能力的定性測定 將ZA1點接于阿須貝培養(yǎng)基上，同時將200 μL ZA1菌懸液接入阿須貝液體培養(yǎng)基中，重復(fù)3次，以無菌水接種做對照，28℃培養(yǎng)，在第3，5，7天目測其生長狀況，在阿須貝培養(yǎng)基上明顯生長者和能使液體培養(yǎng)基變渾濁的記為陽性，繼代培養(yǎng)3代仍為陽性，則認(rèn)為具有固氮能力。

1.3抑菌酶類的定性測定

ZA1分別點接于各培養(yǎng)基，在幾丁質(zhì)培養(yǎng)基30℃下培養(yǎng)3～5 d，葡聚糖培養(yǎng)基28℃下培養(yǎng)7 d，蛋白酶培養(yǎng)基37℃下培養(yǎng)5 d，若菌落周圍出現(xiàn)透明圈，則定性認(rèn)為ZA1具有分泌這些酶的能力。

1.4室內(nèi)貯藏期藥效試驗

活化馬鈴薯壞疽病菌后制成濃度約1×106孢子懸液待用。選大小均勻且無病的新大坪薯塊200個，用昆蟲針在塊莖上造表面為1 cm2、深度為0.2 cm的傷口，后將懸浮液均勻噴在薯塊表面，100%保濕48 h。設(shè)置處理拮抗菌發(fā)酵液稀釋10，20，30倍，以75%肟菌·戊唑醇4000倍液和25%嘧菌酯1800倍液藥劑對照，以清水為空白對照。將處理液均勻噴在薯塊表面。15℃下黑暗處理，待其發(fā)病后，對發(fā)病情況進(jìn)行分級，計算病情指數(shù)并測定ZA1的防治效果。

病情指數(shù)=[∑(各級病斑數(shù)×對應(yīng)級數(shù))/(總調(diào)查數(shù)×最高級數(shù))]×100 防效(%)=[(對照病情指數(shù)-處理病情指數(shù))/對照病情指數(shù)]×100

分級標(biāo)準(zhǔn)：0級，不發(fā)??；1級，病斑邊緣無擴(kuò)展，腐爛深度0.1～0.2 cm；3級，病斑邊緣無擴(kuò)展，腐爛深度0.2～0.5 cm；5級，病斑邊緣有擴(kuò)展，腐爛深度0.5 cm以內(nèi)；7級，病斑邊緣有擴(kuò)展，腐爛深度0.5～1.0 cm；9級，病斑邊緣有擴(kuò)展，腐爛深度1 cm以上。

1.5盆栽促生能力測定

活化ZA1 24 h后，將其發(fā)酵液(3.8×108CFU/mL)稀釋10，20，30倍，取未發(fā)芽的馬鈴薯切塊進(jìn)行拌種，種植于花盆中，并按土壤質(zhì)量(g)與發(fā)酵液體積(mL)比為35∶1進(jìn)行灌根。溫室下管理55 d后，測定馬鈴薯根長與株高、干濕重、莖直徑及葉綠素a、b含量，并計算根冠比。

1.6田間防病促生測定

本試驗于甘肅定西市岷縣麻子川鄉(xiāng)完成，試驗地共設(shè)9個小區(qū)，四周無保護(hù)行，每小區(qū)20 m2。將ZA1發(fā)酵液稀釋20倍后與新大坪進(jìn)行拌種，25%嘧菌酯1800倍液藥劑對照，清水為空白對照。于2013年4月15日播種，8月29日進(jìn)行病害調(diào)查并測產(chǎn)。每小區(qū)按“Z”字型五點取樣，每點調(diào)查2株，每株取上中下共20片葉，對地上部晚疫病進(jìn)行分級并計算病情指數(shù)和防效。測產(chǎn)時，每小區(qū)選中心5 m2，測其產(chǎn)量，并根據(jù)大小情況對其分類，得出商品薯和每hm2的增產(chǎn)率。

晚疫病分級標(biāo)準(zhǔn)：0級，無病斑；1級，病斑面積占整片葉面積的5%以下；3級，病斑面積占整片葉面積的6%～10%。5級，病斑面積占整片葉面積的11%～20%；7級，病斑面積占整片葉面積的21%～50%；9級，病斑面積占整片葉面積的50%以上。

1.7ZA1對馬鈴薯植株體內(nèi)幾種酶活性的影響

1.7.1接種與取樣方法 活化ZA1 24 h后，將其發(fā)酵液(CFU=3.8×108)稀釋20倍，采用噴霧法分別將發(fā)酵液均勻噴于生長60 d后的馬鈴薯盆栽苗子上。每隔6 h在植株上、中、下分別取2片葉子，于-20℃保存。

1.7.2粗酶提取 將處理葉片剪碎，放入預(yù)冷研缽中，加入 3.0 mL 硼酸緩沖液(0.1 mol/L pH 8.8 內(nèi)含0.2% PVP 1 mmol/L EDTA-Na2)冰浴條件下研磨成勻漿，轉(zhuǎn)入2.0 mL 離心管，l0000 r/min、4℃離心 20 min，上清液即為所需的酶粗提取液，于-20℃保存。

1.7.3酶活測定 參考文獻(xiàn)[24]的方法對馬鈴薯的過氧化物酶(peroxidase, POD)、多酚氧化酶(polyphenol oxidase, PPO)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、過氧化氫酶(catalase, CAT)和苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonialyase, PAL)進(jìn)行酶活測定，以各酶的相對活性(處理酶活減去對照酶活)衡量ZA1對馬鈴薯的誘導(dǎo)抗性。

1.7.4可溶性蛋白含量測定 采用考馬斯亮藍(lán)G-250 法，用牛血清蛋白配制成0～1000 μg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液，595 nm 比色制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，吸取各樣品提取液0.1 mL，加入考馬斯亮藍(lán)5 mL，振蕩器充分混勻、放置2 min后在595 nm下比色，記錄吸光值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算各樣品蛋白質(zhì)的含量。

1.8統(tǒng)計分析

采用Excel軟件處理數(shù)據(jù)，并使用SPSS 16.0軟件的新復(fù)極差法(Duncan)進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1ZA1產(chǎn)IAA、溶磷和固氮能力測定

2.1.1IAA的定性測定 結(jié)果表明，含100 mg/L色氨酸的培養(yǎng)液在比色反應(yīng)中呈紅色，與對照差異顯著(圖1)，說明在King培養(yǎng)基中加入100 mg/L的色氨酸能夠促進(jìn)ZA1合成IAA。

2.1.2IAA的定量測定 結(jié)果表明，不含色氨酸的King培養(yǎng)液中分泌IAA的濃度為9.75 mg/L；含100 mg/L色氨酸的King培養(yǎng)液中分泌IAA的濃度為12.17 mg/L，后者IAA的合成量是前者的1.25倍，說明色氨酸的存在能較明顯地增加ZA1合成IAA的量，即外源色氨酸可以作為ZA1合成IAA的前體物質(zhì)。

2.1.3溶磷能力的定性測定 結(jié)果表明，ZA1在PKO無機(jī)磷培養(yǎng)基和蒙金娜培養(yǎng)基上(有機(jī)磷培養(yǎng)基)分別培養(yǎng)沒有溶磷圈出現(xiàn)，說明ZA1沒有溶解有機(jī)磷和無機(jī)磷的能力。

2.1.4固氮能力的定性測定 結(jié)果表明，ZA1點接于阿須貝培養(yǎng)基后，在第3天時形成菌落，第5天時形成明顯的菌落；接種于液體培養(yǎng)基后，5 d后培養(yǎng)液變渾。連續(xù)培養(yǎng)3代后，ZA1在第5天時同樣能形成菌落并能使培養(yǎng)液變渾，說明ZA1具有固氮能力。

2.2抑菌酶類的定性測定

ZA1接種于培養(yǎng)基上培養(yǎng)后，幾丁質(zhì)培養(yǎng)基與葡聚糖培養(yǎng)基上無透明圈產(chǎn)生，蛋白酶培養(yǎng)基上有透明圈產(chǎn)生(圖2)，直徑為3.2 cm，說明ZA1不能分泌幾丁質(zhì)酶和葡聚糖酶，但能夠分泌胞外蛋白酶，且胞外蛋白酶的作用效果明顯。

圖1 ZA1比色反應(yīng)

圖2 ZA1分泌胞外蛋白酶

2.3室內(nèi)貯藏期藥效試驗

貯藏期接種P.foveata后，對照病情指數(shù)為37.87%，75%肟菌·戊唑醇4000倍液和25%嘧菌酯1800倍液處理后病情指數(shù)分別為7.83%和8.33%，ZA1發(fā)酵液稀釋10，20和30倍處理后，病情指數(shù)依次為4.80%,8.12%和11.44%。ZA1發(fā)酵液稀釋隨著稀釋倍數(shù)的增加，防效依次下降，當(dāng)稀釋20倍時，其防效與75%肟菌·戊唑醇4000倍液和25%嘧菌酯1800倍液的防效差異不顯著(圖3)，說明菌株ZA1在馬鈴薯貯藏期對馬鈴薯壞疽病具有較好的防效，可以替代化學(xué)藥劑在貯藏期對馬鈴薯壞疽病進(jìn)行防治。

2.4盆栽促生能力測定

2.4.1馬鈴薯生物量測定 ZA1發(fā)酵液拌種馬鈴薯塊莖后，10，20，30倍液處理依次出苗，均先于對照出苗，說明ZA1具有促進(jìn)馬鈴薯塊莖發(fā)芽的作用。55 d后在10，20，30倍液處理的根部可明顯觀察到較小的馬鈴薯塊莖，但對照沒有發(fā)現(xiàn)；不同處理下，根的長度分別增加8.00，5.20和0.34 cm，根的干重分別增加0.72，0.50和0.34 g，根的濕重分別增加5.07，2.81和1.62 g，株高分別增加2.74，3.40和2.74 cm，莖的干重分別增加0.52，0.47和0.25 g，莖的濕重分別增加5.73，2.10和1.03 g，莖直徑分別增加0.17，0.11和0.10 cm(表1)；且馬鈴薯的根冠比與對照相比有明顯的增加(圖4)，說明ZA1對馬鈴薯的促生作用明顯。

表1 馬鈴薯的生物量測定Table 1 The determination of biomass of potato

注：不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。

Note:The different capital letters mean the significant difference atP<0.01, the different small letters mean the significant difference atP<0.05.The same below.

圖3 ZA1貯藏期防效

圖4 馬鈴薯苗期根冠比

嘧菌酯：Azoxystrobin； 肟菌·戊唑醇：Oxime bacteria·tebuconazole.不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。The different capital letters mean the significant differences atP<0.01, the different small letters mean the significant differences atP<0.05，the same below.

2.4.2馬鈴薯葉片葉綠素含量測定 經(jīng)不同稀釋倍數(shù)的ZA1拌種后，葉綠素含量分別增加0.54，0.26和0.13 mg/g，葉綠素a與葉綠素b分別有不同程度的增加(表2)，但隨稀釋倍數(shù)的增加，葉綠素含量呈下降趨勢，說明高濃度ZA1可促進(jìn)馬鈴薯的光合作用。

2.5田間防病促生測定

經(jīng)ZA1拌種后，對馬鈴薯生長期的晚疫病防效為26.56%，商品薯率高于對照，且商品薯的增產(chǎn)率達(dá)到36.29%，折合每hm2產(chǎn)量 (包括商品薯及非商品薯)增產(chǎn)率可達(dá)33.88%，其商品薯及每hm2增產(chǎn)率均比25%嘧菌酯高，說明拮抗菌ZA1拌種馬鈴薯后在田間具有防病促生效果(表3)。

2.6ZA1對馬鈴薯防御酶的影響

2.6.1馬鈴薯葉片防御酶活性測定 與對照相比，經(jīng)20倍ZA1發(fā)酵液誘導(dǎo)后，馬鈴薯葉片防御酶中，CAT、SOD和POD整體變化趨勢為先增后減，但是活性變化與對照相比較??；PAL和PPO活性變化最大，其中PPO于接種ZA1 6 h后活性小于對照，隨后開始增加，于36 h時達(dá)到最大值后開始減小，PAL活性在36 h達(dá)到最大值后也開始減小，但后期有所增加(圖5)。說明拮抗菌ZA1誘導(dǎo)馬鈴薯后，可以使馬鈴薯防御酶活性增加，有利于馬鈴薯抵抗病原菌的侵染。

2.6.2馬鈴薯葉片可溶性蛋白含量測定 經(jīng)ZA1誘導(dǎo)后，馬鈴薯葉片可溶性蛋白含量與對照相比有所增加，接種ZA1 48 h后，可溶性蛋白達(dá)到最大量(圖6)。說明ZA1能夠使馬鈴薯葉片的可溶性蛋白含量增加，可以使馬鈴薯起到防病的作用。

表2 馬鈴薯葉片葉綠素含量測定Table 2 The determination of chlorophyll content in potato leaf mg/g

表3 ZA1田間防病促生測定Table 3 The determination of control and growth promotion of ZA1 in the fields %

圖5 馬鈴薯葉片防御酶的相對活性變化

圖6 馬鈴薯葉片蛋白質(zhì)含量的變化

3 討論

內(nèi)生菌可通過分泌IAA、解溶磷和聯(lián)合固氮作用對植物達(dá)到促生的作用[6-12]，其中分泌IAA可以促進(jìn)植物種子的發(fā)芽[25]。珠芽蓼內(nèi)生菌ZA1具有分泌IAA和固氮的能力，但無解溶磷能力，經(jīng)盆栽促生測定表明，馬鈴薯塊莖拌種ZA1后，其出苗速度快于對照，說明ZA1分泌IAA后可促進(jìn)馬鈴薯塊莖的發(fā)芽，這與前人報道一致。ZA1對馬鈴薯的促生作用不僅體現(xiàn)在促進(jìn)發(fā)芽上，經(jīng)其拌種后，馬鈴薯根、莖的長度及干、濕重均高于對照，根冠比和葉綠素含量也比對照高，說明ZA1對馬鈴薯具有促生作用。田間拌種ZA1后，馬鈴薯的商品薯增產(chǎn)率與每hm2產(chǎn)量增產(chǎn)率比對照高出36.29%和33.88%，表明ZA1對馬鈴薯在田間的增產(chǎn)作用極其明顯。目前，還沒有測定ZA1對其他植物有無促生作用及其促生機(jī)制，對此有待于進(jìn)一步研究。

邢介帥等[15]報道生防菌T2產(chǎn)生的胞外蛋白酶具有抑菌能力，通過與T2產(chǎn)生的胞外蛋白酶的性質(zhì)對比，ZA1產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)與T2產(chǎn)生的胞外蛋白酶在耐酸堿及耐高溫等部分性質(zhì)上不符合，說明ZA1產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)除胞外蛋白酶之外，還可能具有其他類型的抑菌物質(zhì)，如耐酸耐堿耐高溫的抗菌肽，且室內(nèi)抑菌能力測定結(jié)果表明ZA1對馬鈴薯貯藏期病害如馬鈴薯壞疽病、炭疽病及褐腐病均具有良好的抑制效果[20]，加之馬鈴薯貯藏期病害不方便化學(xué)農(nóng)藥的防治，因此本項目組篩選得到的拮抗菌ZA1對馬鈴薯貯藏期的病害進(jìn)行生物防治具有一定的意義。本試驗經(jīng)貯藏期防效測定，10倍ZA1發(fā)酵液對馬鈴薯壞疽病的防效可達(dá)85.9%，顯著高于75%肟菌·戊唑醇4000倍液和25%嘧菌酯1800倍液的防效，表明ZA1是馬鈴薯壞疽病的有效生防菌。張鵬等[26]報道藥劑對馬鈴薯晚疫病的防效均在79%以上，雖然ZA1對田間晚疫病的防效僅為26.56%，但與25%嘧菌酯1800倍液的防效差異不顯著，由于馬鈴薯晚疫病屬氣傳病害，僅在播種時進(jìn)行拌種，而未在馬鈴薯苗期噴霧可能是造成其防效較差的原因，因此ZA1對馬鈴薯晚疫病及它病害的防效試驗還需進(jìn)一步研究。

拮抗菌能誘導(dǎo)植物產(chǎn)生病程相關(guān)的苯丙氨酸解氨酶、多酚氧化酶、過氧化氫酶、超氧化物歧化酶與過氧化物酶的活性發(fā)生變化[18,27-29]，可使植物的抗性增加。本研究中，于馬鈴薯葉片噴施20倍ZA1后，使得5種防御酶的活性均有增加，整體表現(xiàn)出先增后減的趨勢，與文獻(xiàn)[18,27-29]報道一致； PAL與PPO的活性變化與文獻(xiàn)報道的略有差別，這可能與處理時間僅為72 h有關(guān)，由于每次取樣對植株可能造成不同程度的損傷，可能是導(dǎo)致其部分酶活變化與文獻(xiàn)[18,27-29]中酶活變化趨勢不一致的原因，具體原因還有待于進(jìn)一步研究。植物的可溶性蛋白也可作為衡量抗性的指標(biāo)[30]，本試驗中馬鈴薯經(jīng)ZA1誘導(dǎo)后，60 h內(nèi)蛋白含量均高于對照，說明噴施ZA1后可誘導(dǎo)提高馬鈴薯抗性。經(jīng)室內(nèi)和大田防試驗研究，證明珠芽蓼內(nèi)生菌ZA1對馬鈴薯壞疽病具有較強(qiáng)的抑制作用，并對馬鈴薯具有較好的防病促生能力，同時，可誘導(dǎo)馬鈴薯獲得抗性。因此，ZA1可開發(fā)成為高效的微生物農(nóng)藥及菌肥。

[1] Lodewyckx C, Mergeay M, Vangronsveld J,etal.Isolation, characterization, and identification of bacteria associated with the zinc hyperaccumulatorThlaspicaerulescenssub sp.Calaminaria.International Journal of Phytoremediation, 2002, 4:101-115.

[2] Cho K M, Young S H, Mi L S,etal.Endophytic bacterial communities in ginseng and their antifungal activity against pathogens.Microbial Ecology, 2007, 54:341-351.

[3] Islam S M A, Math R K, Kim J M,etal.Effect of plant age on endophytic bacterial diversity of balloon flower (Platycodongrandiflorum) root and their antimicrobial activities.Current Microbiology, 2010, 61:346-356.

[4] Ramesh R, Joshi A A, Ghanekar M P.Pseudomonads, major antagonistic endophytic bacteria to suppress bacterial wilt pathogen,Ralstoniasolanacearumin the eggplant (SolanummelongenaL.).World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2009, 25:47-55.

[5] Forchetti G, Masciarelli O, Izaguirre M,etal.Endophytic bacteria improve seedling growth of sunflower under water stress, produce salicylic acid, and inhibit growth of pathogenic fungi.Current Microbiology, 2010, 61:485-493.

[6] Li C H, Zhao M W, Tang C M,etal.Population dynamics and identification of endophytic bacteria antagonistic toward plant-pathogenic fungi in cotton root.Microbial Ecology, 2010, 59:344-356.

[7] Wang Y, Zhan R L, He H,etal.Antibiotic substances produced by mangrove endophytic bacteria Kc-38 and biocontrol efficacy on anthracnose of postharvest mangoes.Chinese Journal of Biological Control, 2012, 27(1):82-87.

[8] Wang F, Ji M S, Gu Z M,etal.Effect of antifungal substances from endophytic bacteria B36 onFulriafulva.Chinese Journal of Biological Control, 2009, 25(3):250-254.

[9] Chang T, Wang H Q, Yang C D,etal.Identification and evaluation of biological control potential of B-401 endophytic bacteria in grasses on alpine grasslands.Acta Prataculturae Sinica, 2014, 23(3):282-289.

[10] Hou X J, Li Z N, Han D Y,etal.Presence of indigenous endophytic bacteria in jujube seedlings germinated from seedsinvitro.Frontiers of Agriculture in China, 2010, 4(4):443-448.

[11] Wang C Y, Chen X R, Yang C D,etal.Identification of an endophytic phosphate-solubilizing bacteria isolated fromKobresiacapillifolia.Journal of Gansu Agricultural University, 2011, 46(3):99-103.

[12] Oliveira A L M, Urquiaga S, D?bereiner J,etal.The effect of inoculating endophytic N2-fixing bacteria on micropropagated sugarcane plants.Plant and Soil, 2002, 242:205-215.

[13] Liu J L, Fang F, Shi X H,etal.Isolation and characterization of PGPR from the rhizosphere of theAvenasativain saline-alkali soil.Acta Prataculturae Sinica, 2013, 22(2):132-139.

[14] Liu X, Mu C Q, Jiang X L,etal.Research progress of the metabolic substances produced byBacillussubtillisand their application on biocontrol of plant disease.Chinese Journal of Biological Control, 2006, 10, 22(Supplement):179-184.

[15] Xie J S, Li R, Zhao L,etal.Purification, characterization and antagonism of an extracellular protease fromBacillussubtilisstrain T2.Acta Phytopathologica Sinica, 2008, 38(4):377-381.

[16] Gao F, Ma L P, Qiao X W,etal.Purification of antifungal peptide produced by antagonisticBacilluscereusBC98-I againstFusariumoxysporum.Acta Phytopathologica Sinica, 2007, 37(4):403-409.

[17] Zhai R H, Shang Y K, Liu F,etal.Characteristics and inhibitory action of antifungal protein produced byBacillussubtilisstrain G8.Journal of Plant Protection, 2007, 34(6):592-596.

[18] Sun J B, Wang Y G, Zhao P J,etal.Colonization of biocontrol strain XB16 againstFusariumwilt pathogen of banana and its effect on defense-related enzymes.Chinese Journal of Tropical Crops, 2012, 31(2):212-216.

[19] Yang H L, Sun X L, Song W.Current development on induced resistance by plant growth promoting and endophytic bacteria.Acta Phytopathologica Sinica, 2000, 30(2):106-110.

[20] Chang T, Wang H Q, Yang C D,etal.Screening and identification of antagonist bacteria againstPhomafoveataon potato.Chinese Journal of Biological Control, 2014, 30(2):247-252.

[21] Fang Z D.Research Method of Plant Pathology(Third Edition)[M].Beijing:Chinese Agriculture Press, 1997.

[22] Gulpiye, Huang L L, Kang Z S.Study on a strain of high chitinase producing bacteria against plant pathogens.Acta Agriculturae Boreali-occidentalls Sinica, 2006, 15(6):189-191.

[23] Tang Z Y, Wang H, Xiong S B,etal.Studies on the screening of β-1,3-glucanase producing strains and enzyme producing condition.Journal of Hunan Agricultural University (Natural Sciences), 2006, 32(5):552-556.

[24] Gao W.The Biocontrol Mechanism of Bacillus marinus B-9987[D].Qingdao:Qingdao University of Science and Technology, 2009.

[25] Armando C F D, Francisco E C C, Fernando D A,etal.Isolation of micropropagated strawberry endophytic bacteria and assessment of their potential for plant growth promotion.World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2009, 25:189-195.

[26] Zhang P, Wang W Q, Huang Q L,etal.Development of 40% fluopicolide·pyraclostrobin suspension concentrate and its controlling efficacy to potato late blight in the field.Scientia Agricultura Sinica, 2013, 46(15):3142-3150.

[27] Qin G Z, Tian S P, Liu H B,etal.Polyphenol oxidase, peroxidase and phenylalanine ammonium lyase in postharvest peach fruits induced by inoculation with pichia membranefaciens or rhizopus stolonifer.Scientia Agricultura Sinica, 2003, 36(1):89-93.

[28] Zhuang J H, Gao Z G, Yang C C,etal.Biocontrol ofFusariumwilt and induction of defense enzyme activities on cucumber byTrichodermaviridestrain T23.Acta Phytopathologica Sinica, 2005, 35(2):179-183.

[29] Yan Y H, Wang H K, Xiao R F,etal.Bio-control effects of a lactic acid bacteria on tomatoBotrytisblight and its induction on defense-related enzymes.Microbiology, 2011, 38(12):1801-1806.

[30] Tai L M, Liang W L, Zuo Y H,etal.Changes of defensive enzymes activity in different resistant potato varieties after inoculated withAlternariasolani.Plant Physiology Journal, 2010, 46(11):1147-1150.

參考文獻(xiàn)：

[7] 汪遠(yuǎn), 詹儒林, 何紅, 等.紅樹內(nèi)生細(xì)菌菌株Kc-38的抗菌物質(zhì)及對采后芒果炭疽病的防效.中國生物防治學(xué)報, 2012, 27(1):82-87.

[8] 王芳, 紀(jì)明山, 谷祖敏, 等.苦參內(nèi)生枯草芽孢桿菌B36抗菌物質(zhì)對番茄葉霉病菌的作用機(jī)制.中國生物防治, 2009, 25(3):250-254.

[9] 暢濤, 王涵琦, 楊成德, 等.高寒草地禾草內(nèi)生細(xì)菌B-401的鑒定及生物防治潛力評價.草業(yè)學(xué)報, 2014, 23(3):282-289.

[11] 王辰月, 陳秀蓉, 楊成德, 等.線葉嵩草內(nèi)生細(xì)菌的鑒定及溶磷效果的初步研究.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2011, 46(3):99-103.

[13] 劉佳莉, 方芳, 史煦涵, 等.2株鹽堿地燕麥根際促生菌的篩選及其促生作用研究.草業(yè)學(xué)報, 2013, 22(2):132-139.

[14] 劉雪, 穆常青, 蔣細(xì)良,等.枯草芽孢桿菌代謝物質(zhì)的研究進(jìn)展及其在植病生防中的應(yīng)用.中國生物防治, 2006, 10, 22(增刊):179-184.

[15] 邢介帥, 李然, 趙蕾, 等.生防芽孢桿菌T2胞外蛋白酶的純化及其抗真菌作用.植物病理學(xué)報, 2008, 38(4):377-381.

[16] 高芬, 馬利平, 喬雄梧, 等.枯萎菌拮抗芽孢桿菌BC98-I抗菌多肽的純化.植物病理學(xué)報, 2007, 37(4):403-409.

[17] 翟茹環(huán), 尚玉珂, 劉峰, 等.枯草芽孢桿菌G8抗菌蛋白的理化性質(zhì)和抑菌作用.植物保護(hù)學(xué)報, 2007, 34(6):592-596.

[18] 孫建波, 王宇光, 趙平娟, 等.拮抗菌XB16在香蕉體內(nèi)的定殖及對抗病相關(guān)酶活性的影響.熱帶作物學(xué)報, 2012, 31(2):212-216.

[19] 楊海蓮, 孫曉璐, 宋未.植物根際促生細(xì)菌和內(nèi)生細(xì)菌的誘導(dǎo)抗病性的研究進(jìn)展.植物病理學(xué)報, 2000, 30(2):106-110.

[20] 暢濤, 王涵琦, 楊成德, 等.馬鈴薯壞疽病Phomafoveata生防菌的篩選及鑒定.中國生物防治學(xué)報, 2014, 30(2):247-252.

[21] 方中達(dá).植病研究方法(第三版)[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社, 1997.

[22] 古麗皮艷, 黃麗麗, 康振生.一株高產(chǎn)幾丁質(zhì)酶細(xì)菌對植物病原真菌的抑制作用研究.西北農(nóng)學(xué)報, 2006, 15(6):189-191.

[23] 唐治玉, 王淮, 熊善柏, 等.β-1，3-葡聚糖酶產(chǎn)生菌的篩選及其產(chǎn)酶條件.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版), 2006, 32(5):552-556.

[24] 高偉.海洋芽孢桿菌 B-9987 生物防治機(jī)制研究[D].青島, 青島科技大學(xué), 2009.

[26] 張鵬, 王文橋, 黃啟良, 等.40%氟菌·唑醚懸浮劑的研制及其對馬鈴薯晚疫病田間防治效果.中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2013, 46(15):3142-3150.

[27] 秦國政, 田世平, 劉海波, 等.拮抗菌與病原菌處理對采后桃果實多酚氧化酶、過氧化物酶及苯丙氨酸解氨酶的誘導(dǎo).中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2003, 36(1):89-93.

[28] 莊敬華, 高增貴, 楊長城, 等.綠色木霉菌T23對黃瓜枯萎病防治效果及其幾種防御酶活性的影響.植物病理學(xué)報, 2005, 35(2):179-183.

[29] 閆艷華, 王海寬, 肖瑞峰, 等.一株乳酸菌對番茄灰霉病的防效及對幾種防御酶活性的影響.微生物學(xué)通報, 2011, 38(12):1801-1806.

[30] 臺蓮梅，梁偉伶，左豫虎，等.馬鈴薯不同品種感染早疫病菌后防御酶活性變化.植物生理學(xué)通訊，2010, 46(11):1147-1150.

Effects of disease control and growth promotion ofPolygonumviviparumendophytic bacteriaBacillusmojavensison potato

CHANG Tao, YANG Cheng-De*, XUE Li, YANG Xiao-Li, FENG Zhong-Hong, HAO Rong-Rong, ZHANG Zhen-Fen, CHEN Xiu-Rong

KeyLaboratoryofGrasslandEcosystem,GansuAgriculturalUniversity,MinistryofEducation,CollegeofPrataculturalScience,GansuAgriculturalUniversity,PrataculturalEngineeringLaboratoryofGansuProvince,Sino-U.S.CenterforGrazinglandEcosystemSustainability,Lanzhou730070,China

This research was to study the effects of disease prevention, growth promotion and defense enzymes induction ofBacillusmojavensisZA1 on potato, and provide a theoretical basis for microbial fungicide and fertilizer use.The abilities of IAA secretion, nitrogen fixation, phosphate solubilization and inhibition enzyme production of ZA1 have been researched qualitatively by general methods.The effects of controlling disease and growth promotion of ZA1 on potatoes were studied under the condition of indoors and fields.The concentration of IAA secreted by ZA1 in the King medium with and without tryptophan were 12.17 and 9.75 mg/L.ZA1 possessed the capacity of nitrogen fixation and extracellular proteases, chitinase and glucanase production, but without the ability of phosphate solubilization.The control efficiency of ZA1 was 85.9% by spraying 10 times diluting fermentation broth on potato tubes in storage-period against potato gangrene, and was 26.56% by seed dressing fermentation broth with diluting for 20 times on potato tubes under field condition against potato late blight.In field condition, the production ratios of commodity potato were increased by 36.29% and 33.88% per hectare, respectively.Pot experiments with the seed dressing potatoes showed that the content of roots, stems and chlorophyll were higher than the control group.After treatment by ZA1 20 times fermentation broth on potato tubes, the length of the root and wet and dry weight were increased by 8 cm, 0.75 g and 5.07 g, respectively.In the same time, the plant height, stem diameter, stem wet and dry weight and the content of chlorophyll were increased by 2.74 cm, 0.27 cm, 0.52 g, 5.73 g and 0.54 mg/g, respectively.The root-shoot ratios of wet and dry weight were increased by 0.214 and 0.094, respectively.When spraying diluting fermentation broth of ZA1 on potato leaves, the results indicated that the activity of catalase (CAT), polyphenol oxidase (PPO), phenylalanine ammonialyase (PAL), SOD and POD of potatoes were increased.ZA1 possessed the biological function of disease prevention and growth promotion under indoor and field conditions obviously, which showed that ZA1 had the potential to become microbial fungicide and fertilizer.

Bacillusmojavensis; potatoes; disease control and growth promotion; defense enzymes

10.11686/cyxb2014233

http://cyxb.lzu.edu.cn

2014-05-09；改回日期：2014-08-15

國家自然科學(xué)基金(No.31160122)和盛彤笙基金(GASU-STS-1418)資助。

暢濤(1986-), 男, 甘肅白銀人, 在讀碩士。E-mail:changt1986@126.com

*通信作者Corresponding author.E-mail:yangcd@gsau.edu.cn

暢濤, 楊成德, 薛莉, 楊小利, 馮中紅, 郝蓉蓉, 張振粉, 陳秀蓉.珠芽蓼內(nèi)生菌ZA1對馬鈴薯的防病促生研究.草業(yè)學(xué)報, 2015, 24(12):83-91.

CHANG Tao, YANG Cheng-De, XUE Li, YANG Xiao-Li, FENG Zhong-Hong, HAO Rong-Rong, ZHANG Zhen-Fen, CHEN Xiu-Rong.Effects of disease control and growth promotion ofPolygonumviviparumendophytic bacteriaBacillusmojavensison potato.Acta Prataculturae Sinica, 2015, 24(12):83-91.