武孔煥，吳文衛(wèi)，劉 昂，陳麗梅，李昆志

（1.云南高原湖泊流域污染過程與管理重點實驗室 （籌），云南省環(huán)境科學(xué)研究院，云南昆明，650034；2.昆明理工大學(xué)，云南昆明650500）

釩酸鹽預(yù)處理對美人蕉吸收農(nóng)田廢水中硝態(tài)氮效率的影響

武孔煥1，吳文衛(wèi)1，劉 昂2，陳麗梅2，李昆志2

（1.云南高原湖泊流域污染過程與管理重點實驗室 （籌），云南省環(huán)境科學(xué)研究院，云南昆明，650034；2.昆明理工大學(xué)，云南昆明650500）

以美人蕉為實驗材料，用質(zhì)膜H＋－ATPase活性抑制劑VA處理美人蕉，考察VA對美人蕉根部質(zhì)膜H＋－ATPase活性與吸收硝態(tài)氮效率的影響。研究結(jié)果表明：100μM VA預(yù)處理顯著降低美人蕉對農(nóng)田廢水中硝態(tài)氮的吸收，質(zhì)膜H＋－ATPase和H＋－泵活性也顯著降低。

農(nóng)田廢水處理；美人蕉；釩酸鹽預(yù)處理；硝態(tài)氮效率；預(yù)處理影響

杞麓湖是云南省九大高原湖泊之一，位于玉溪市通?？h的中北部，東經(jīng)102°33′48′′～102°52′36′′，北緯24°4′36′′～24°14′21′′。近年來，由于流域經(jīng)濟的發(fā)展、人口的不斷增加，部分污染物直接排入杞麓湖，使得湖體水質(zhì)受到嚴(yán)重污染。

在植物的不同器官中，根系發(fā)揮著重要的作用，包括各種營養(yǎng)物質(zhì)的吸收、運輸。根系不僅能吸收利用土壤的養(yǎng)分，還為植物的生長提供能量。植物的根系形態(tài)特征、生理特征都和根系對氮素的吸收有著密切關(guān)系。根系形態(tài)的發(fā)達(dá)與否，決定著其對氮素的吸收效率。植物根系吸收氮素最主要的形態(tài)之一是氮素的硝態(tài)氮形態(tài)，因為土壤膠體不易吸附硝態(tài)氮，所以硝態(tài)氮能被所有的植物吸收并加以利用［1］。

質(zhì)膜H＋－ATPase是一種膜蛋白，在多種植物質(zhì)膜和各種內(nèi)膜系統(tǒng)中都廣泛存在，在細(xì)胞的生物代謝過程中，發(fā)揮著重要作用，參與多種代謝反應(yīng)。14－3－3蛋白通過與質(zhì)膜上的主要靶結(jié)合位點質(zhì)膜H＋－ATPase結(jié)合，從而增加其活性，以啟動相應(yīng)的反應(yīng)。有研究表明，釩酸鹽 （VA）能夠競爭性抑制質(zhì)膜H＋－ATPase活性，從而影響植物吸收硝態(tài)氮的效率。本研究以美人蕉為實驗材料，用質(zhì)膜H＋－ATPase活性抑制劑VA處理美人蕉，考察抑制劑對美人蕉根部質(zhì)膜H＋－ATPase活性與吸收硝態(tài)氮效率的影響。

1 材料與方法

1.1 美人蕉的培養(yǎng)

農(nóng)田廢水的采樣點位于杞麓湖北岸，按照相關(guān)規(guī)定采集后的農(nóng)田廢水存放于4℃冷庫，保存?zhèn)溆谩?/p>

本研究所用實驗材料為美人蕉（Cana），將美人蕉幼苗培養(yǎng)在濕地中，當(dāng)其株高長至30～40cm的時候，小心挖出并注意保護(hù)根部的的完整性，用自來水清洗干凈根部，放于盛有5L自來水的容器中水培，并且每隔2d更換一次自來水，培養(yǎng)30d左右，可見美人蕉根部新根長出，該植株用于后續(xù)實驗。

1.2 農(nóng)田廢水成分的測定

1.2.1 農(nóng)田廢水pH的測定

用燒杯取100mL存放于4℃冷庫中保存?zhèn)溆玫霓r(nóng)田廢水樣品，室溫放置30min，使其溫度上升至室溫。使用成都瑞馳分析儀器有限公司PHS－2C型pH計測定水樣pH。

1.2.2 農(nóng)田廢水NO3－濃度的測定

NO3－的測定用酚二磺酸分光光度法［3］，單位：mg／L。

1.2.3 農(nóng)田廢水PO43－濃度的測定

PO43－的測定用鉬銻抗分光光度法［3］，單位：mg／L。

1.3 抑制劑VA預(yù)處理后美人蕉最適濃度的篩選

參照1.1方法培養(yǎng)美人蕉，分別用不同濃度的VA溶液（50μM、100μM、150μM）的VA預(yù)處理美人蕉12h，然后置于3L農(nóng)田廢水中處理6、12、24h（此組實驗作為實驗組）（VA）；經(jīng)農(nóng)田廢水處理后測定美人蕉對硝態(tài)氮的吸收效率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)100μM的VA預(yù)處理美人蕉對硝態(tài)氮的吸收效果增加較為顯著，因此選取VA的濃度100μM用于后續(xù)實驗。同時選取美人蕉外部形態(tài)大致相似的不經(jīng)過VA預(yù)處理的作為對照組（CK），但需同樣置于3L農(nóng)田廢水中處理6、12、24h。在農(nóng)田廢水處理的不同時間點收集美人蕉根部0.5g保存?zhèn)溆?，用于檢測美人蕉對硝態(tài)氮的吸收效率、H＋－ATPase活性、H＋－泵活性。

1.4 抑制劑VA預(yù)處理后美人蕉吸收硝酸鹽效率的測定

美人蕉對硝態(tài)氮的吸收效率的測定參照1.2.2。

1.5 抑制劑VA預(yù)處理后美人蕉根部質(zhì)膜H＋－ATPase活性的測定

農(nóng)田廢水處理（CK）和釩酸鹽（VA）處理24h后收集美人蕉的根部，每份樣品0.5g，液氮冷凍后置于－80℃冰箱保存?zhèn)溆?，質(zhì)膜的分離與純化采用Miller等［4］的方法，略有改動。

1.6 抑制劑VA預(yù)處理后美人蕉根部質(zhì)膜氫泵活性的測定

美人蕉根部氫泵活性的測定參照吖啶橙 （AO）A492處吸光值淬滅的方法［5］進(jìn)行，略有改動。

1.7 數(shù)據(jù)處理

生理生化指標(biāo)分析至少設(shè)置3次重復(fù)，用Excel統(tǒng)計學(xué)方法計算每組數(shù)據(jù)的平均值和相對誤差，用DPS數(shù)據(jù)系統(tǒng)對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性差異分析（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 農(nóng)田廢水成分分析

經(jīng)測定杞麓湖農(nóng)田廢水水樣pH為7.30，農(nóng)田廢水中NO3－的濃度為4.79 mg／L，約為《GB3838－2002》Ⅰ類水總氮上限值（TN：0.2mg／L）的24倍，農(nóng)田廢水PO43－的濃度為0.876mg／L，而《GB3838－2002》Ⅰ類水中總磷（TP）限值為0.02mg／L，農(nóng)田廢水中正磷酸根的濃度約為Ⅰ類水標(biāo)準(zhǔn)的44倍。由此可見，農(nóng)田廢水中N、P的濃度較高，過量使用化肥污染相當(dāng)嚴(yán)重，是杞麓湖湖水污染的主要污染源。

向農(nóng)田廢水中添加適量的硝酸鉀，使得農(nóng)田廢水中硝態(tài)氮的含量分別為9.58mg／L、14.37mg／L、18.27 mg／L，分別用三種不同硝態(tài)氮濃度的農(nóng)田廢水處理美人蕉并測定美人蕉對農(nóng)田廢水中硝態(tài)氮的吸收效率。實驗表明美人蕉在一天內(nèi)對硝態(tài)氮濃度為9.58mg／L的農(nóng)田廢水吸收效果最好，因此本研究選用硝態(tài)氮濃度為9.58mg／L的農(nóng)田廢水用于后續(xù)實驗。

2.2 VA的應(yīng)用對美人蕉植株吸收硝酸鹽效率的影響

從圖1可看出，隨著VA預(yù)處理（VA）和農(nóng)田廢水 （CK）處理時間的延長，農(nóng)田廢水的硝態(tài)氮濃度均呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢。其中，對照組（CK）在前6h農(nóng)田廢水中硝態(tài)氮的濃度下降得最為迅速，由最初的9.58 mg／L下降到5.26 mg／L，對硝態(tài)氮的吸收率為45.1%；在繼續(xù)處理的6～24h，美人蕉對硝態(tài)氮的吸收效率同樣呈明顯下降趨勢，在處理24h后，農(nóng)田廢水硝態(tài)氮的濃度由最初的9.58 mg／L下降到1.69 mg／L，吸收率為82.4%。在VA預(yù)處理組中（VA），在處理6h后，農(nóng)田廢水中硝態(tài)氮的濃度由最初的9.58 mg／L下降到7.02 mg／L，對硝態(tài)氮的吸收效率為26.7%；在處理24h后，農(nóng)田廢水硝態(tài)氮的濃度由最初的9.58 mg／L下降到3.12 mg／L，對硝態(tài)氮的吸收效率為67.4%。隨著VA和CK處理時間的延長，農(nóng)田廢水中的硝態(tài)氮濃度都呈下降趨勢，在處理24h后，CK中美人蕉對硝態(tài)氮的吸收率為82.4%，VA中美人蕉對硝態(tài)氮的吸收率為67.4%，并且每個取樣點VA處理農(nóng)田廢水中剩余硝態(tài)氮的濃度都顯著高于CK。說明VA預(yù)處理后，降低了美人蕉對農(nóng)田廢水硝態(tài)氮的吸收效率。

2.3 VA預(yù)處理對美人蕉質(zhì)膜H＋－ATPase活性和氫泵活性的影響

研究結(jié)果表明，美人蕉經(jīng)VA預(yù)處理后，對農(nóng)田廢水中硝態(tài)氮的吸收效率下降，為了進(jìn)一步了解美人蕉經(jīng)VA預(yù)處理后，吸收廢水中硝態(tài)氮效率下降是否與根部質(zhì)膜H＋－ATPase活性的變化有關(guān)，本研究檢測VA預(yù)處理和農(nóng)田廢水處理美人蕉后，其根中質(zhì)膜H＋－ATPase的活性。圖2A顯示，隨著農(nóng)田廢水處理時間的延長，CK和VA美人蕉根部質(zhì)膜H＋－ATPase的活性都逐漸增加，處理不同時間點的值都高于處理前，并且經(jīng)VA預(yù)處理的值始終低于同時間點的對照 （CK）。在農(nóng)田廢水處理之前（0h），對照組（CK）和VA預(yù)處理后，美人蕉根部質(zhì)膜H＋－ATPase的活性分別為1.36和1.15μmol／mg·min，CK中質(zhì)膜H＋－ATPase的活性是VA的1.18倍，表明在VA預(yù)處理后，美人蕉根部質(zhì)膜H＋－ATPase的活性在一定程度表現(xiàn)出下降趨勢。農(nóng)田廢水處理24h后，美人蕉根部質(zhì)膜H＋－ATPase活性CK和VA分別上升到2.31和 1.91μmol／mg·min，比放入農(nóng)田廢水處理前（0h），其H＋－ATPase活性分別顯著提高69.8%和66%，即經(jīng)VA處理后，質(zhì)膜H＋－ATPase的活性隨處理時間的延長也有所上升，但上升的趨勢較CK小?？梢娒廊私对谵r(nóng)田廢水中處理24h后，根部質(zhì)膜H＋－ATPase活性得到了明顯的提高，但VA預(yù)處理后，卻抑制H＋－ATPase活性的提高。

圖2B結(jié)果表明，美人蕉經(jīng)VA處理和CK處理后根部H＋－泵活性的變化趨勢表現(xiàn)出與H＋－ATPase相似的情況。在農(nóng)田廢水未處理之前（0h），經(jīng)VA預(yù)處理后美人蕉根部H＋－泵活性比CK低，大約低19%，說明VA的預(yù)處理之后，同樣降低了美人蕉根部H＋－泵活性。在農(nóng)田廢水處理的過程中，VA和CK美人蕉根部H＋－泵的活性都表現(xiàn)出上升趨勢，在農(nóng)田廢水處理24h時，VA的H＋－泵活性為處理前（0h）的1.61倍，CK的H＋－泵活性為處理前（0h）的1.75倍，同時還發(fā)現(xiàn)在農(nóng)田廢水處理的整個過程中，VA美人蕉根中H＋－泵的活性都要低于CK，在處理24h后，VA美人蕉根中H＋－泵的活性約占CK的74%。說明經(jīng)過VA預(yù)處理后，美人蕉根部質(zhì)膜氫泵的活性被明顯降低。

3 結(jié)論

植物根系對硝態(tài)氮的吸收和同化是一個非常復(fù)雜的過程，多種酶協(xié)同參與其反應(yīng)過程。在硝態(tài)氮的吸收階段，目前公認(rèn)的NO3－跨膜運輸方式［6］是依靠細(xì)胞膜H＋－ATPase提供能量的H＋／NO3－共運輸方式。質(zhì)膜是細(xì)胞與細(xì)胞間質(zhì)之間的一道通透性保護(hù)屏障，而定位于質(zhì)膜上的質(zhì)膜H＋－ATPase則是產(chǎn)生跨膜轉(zhuǎn)運動力的主體。植物根系吸收的硝態(tài)氮進(jìn)入植物體后，在不同類型的硝態(tài)氮轉(zhuǎn)運蛋白的作用下，被運輸?shù)街参锏牟煌M織，在植物的不同部位發(fā)生一系列的反應(yīng)從而被植物同化，以供植物吸收和利用，而多余的硝態(tài)氮則儲存在細(xì)胞液泡內(nèi)。

在農(nóng)田廢水處理下，美人蕉根部與氮素吸收相關(guān)的質(zhì)膜H＋－ATPase和H＋－泵活性隨處理時間的延長而升高，說明農(nóng)田廢水處理可以提高質(zhì)膜H＋－ATPase和H＋－泵活性；同時隨著農(nóng)田廢水處理時間的延長，美人蕉根部對硝態(tài)氮的吸收效率增加，可見美人蕉在吸收硝態(tài)氮方面發(fā)揮著重要作用，是人工濕地系統(tǒng)中常見植物之一。

VA是質(zhì)膜H＋－ATPase的特異抑制劑，通過VA處理美人蕉發(fā)現(xiàn)質(zhì)膜H＋－ATPase和H＋－泵活性隨VA的處理而降低，硝態(tài)氮吸收效率也相應(yīng)降低。

［1］Di T J（狄廷均），Zhu Y Y（朱毅勇），Chou M H（仇美華），et al.Response of plasma membrane H＋－ATPase of rice root to ammonium and nitratenutrition［J］.Chinese Journal of Rice Science（中國水稻科學(xué)），2007，21（4）：360－366.

［2］Grace JB，Wetzel R G.Habitat partitioning and competitive displacement in cattails（Typha）：experimental field studies［J］. American Naturalist，1981（118）：463－474.

［3］本書編委會.水和廢水監(jiān)測分析方法：第四版 ［M］.北京：中國環(huán)境科學(xué)出版社，2002：246－248，259－261.

［4］Miller G，Suzuki N，Ciftci－yilmaz S，et al.Reactive oxygen species homoestasis and signaling during and salinity stresses［J］. Plant Cell Environ，2010（33）：453-67.

［5］Apel K，Hirt H.Reactive oxygen species：metabolism，oxidative stress，and signal transduction［J］.Annual Review of Plant Biology，2004（55）：373－399.

［6］Ottova V，Balcarova J，Vymazal.Microbial characteristics of constructed wetlands［J］.Water Science and Technology，1997，35（5）：117－123.

Im pact of Pretreating Canna by Vanadate on Absorption Efficiency of Nitrate Nitrogen in Farm land W astewater

WU Kong－h(huán)uan1，WUWen－wei1，LIU Ang2，CHEN Li－mei2，LIKun－zhi2
（1.Yunnan Key Laboratory of Pollution Process and Management of Plateau Lake－Watershed（Prepare to Construct），Yunnan Institute of Environmental Science，Kunming Yunnan 650034，China）

Canna chosen as the target experimentalmaterial was pretreated using plasmamembrane H＋－ATPase activity inhibitor VA in order to investigate the influence of plasmamembrane H＋－ATPase activity in the canna roots on nitrate absorption efficiency.The results showed that the nitrate absorption efficiency dropped dramatically while adding 100 M VA.Meanwhile，the activities of plasmamembrane H＋－ATPase and H＋－pump were also significantly reduced.

farmland wastewater treatment；canna；vanadate pretreatment；nitrate；impact of

X52

：A

：1673－9655（2015）06－0039－04

2015－04－28