張秋艷 孫 琳 李珍珍 潘玉瑾 王 青 趙 強(qiáng)

(四川大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，成都610065)

CdTe量子點(diǎn)DNA熒光納米探針的合成及表征

張秋艷 孫 琳 李珍珍 潘玉瑾 王 青 趙 強(qiáng)＊

(四川大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，成都610065)

采用水相合成法合成了巰基乙酸(TGA)修飾的水溶性CdTe量子點(diǎn)，通過反相微乳液法制備了二氧化硅及殼聚糖修飾的核殼型復(fù)合熒光納米粒子，將其與DNA吸附連接，得到CdTe量子點(diǎn)DNA熒光納米探針。用掃描電鏡、透射電鏡、熒光光譜、紅外光譜、紫外光譜、ζ電位等測試方法對產(chǎn)物的理化性質(zhì)進(jìn)行了分析表征。結(jié)果表明制備了表面富含氨基的復(fù)合熒光納米粒子，其對DNA具有良好的吸附作用。

CdTe量子點(diǎn)；氨基化；熒光；納米探針；DNA

近年來，采用化學(xué)方法合成半導(dǎo)體納米晶即量子點(diǎn)(Quantum Dots)[1]熒光納米材料已成為化學(xué)和材料領(lǐng)域中的研究熱點(diǎn)之一。由于量子點(diǎn)比傳統(tǒng)有機(jī)熒光染料等具有更好的熒光特性[2]，如較強(qiáng)的量子尺寸效應(yīng)、較高的熒光量子產(chǎn)率、發(fā)射譜線窄和激發(fā)譜線寬等優(yōu)點(diǎn)，其作為一種新型的熒光標(biāo)記物已在生物分子探針[3-4]、生物傳感器[5]、生物顯像[6]及診斷[7]、生物分子相互作用[8-9]等研究中顯示出了很好的應(yīng)用前景。

量子點(diǎn)表面生物功能化后，便可與DNA、蛋白質(zhì)等生物分子特異性結(jié)合，用于熒光探針標(biāo)記[10]。本研究中所采用的DNA富含G堿基，與人體端粒DNA末端重復(fù)序列5′-TTAGGG-3′類似，經(jīng)誘導(dǎo)可形成G-四鏈體結(jié)構(gòu)。G-四鏈體DNA的形成能夠有效地抑制端粒酶活性以及端粒的延長，進(jìn)而遏制腫瘤細(xì)胞的大量增殖[11]。因而，富G堿基DNA熒光納米探針的研究具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

雖然各種功能基團(tuán)修飾的量子點(diǎn)在生物領(lǐng)域已得到廣泛應(yīng)用[12]，但采用二氧化硅與殼聚糖交聯(lián)氨基化改性量子點(diǎn)形成核殼型的熒光復(fù)合納米粒子，并研究其對DNA的吸附性能則鮮有報(bào)道。目前有研究工作者采用巰基乙胺[13]或APTES(3-氨丙基三乙氧基硅烷)[14]修飾量子點(diǎn)，但采用這些方法合成的量子點(diǎn)不穩(wěn)定并且?guī)в幸欢ǖ亩拘訹15]，不便與DNA連接進(jìn)行后續(xù)研究。殼聚糖因?yàn)榫哂辛己玫纳锵嗳菪?、無毒、可生物降解等優(yōu)點(diǎn)[16]，目前已被廣泛用于DNA研究領(lǐng)域[17]。作為一種天然高分子化合物，殼聚糖結(jié)構(gòu)中含有大量的-OH和-NH2，可通過靜電吸附作用與帶負(fù)電荷的DNA產(chǎn)生相互作用，形成熒光納米探針。為此，本工作以巰基乙酸(TGA)為穩(wěn)定劑在水相中制備了穩(wěn)定的CdTe量子點(diǎn)，再采用反相微乳液法制備表面氨基改性的熒光復(fù)合納米粒子，并研究其對DNA的吸附性能。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

硼氫化鈉NaBH4(化學(xué)純CP，天津海納川)；碲粉Te(＞99%，Alfa Aesar)；氯化鎘CdCl2·2.5H2O(＞99%，Acros organics)；巰基乙酸TGA(98%，Acros organics)；正硅酸乙酯TEOS(＞96%，TCI Chemicals)；曲拉通X-100(化學(xué)純CP，成都科龍)；三羥甲基氨基甲烷(生物試劑BR，成都科龍)；環(huán)己烷、正己醇、氨水、丙酮(分析純AR，成都科龍)；1%殼聚糖(chitosan，CS，脫乙酰度不低于90%)溶液：準(zhǔn)確稱取1.000 g殼聚糖溶于100 mL 1%HOAc溶液中；DNA樣品：S12-DNA 5′-TTAGGGTTAGGG-3′(OPC純化，寶生物工程(TaKaRa)(大連)有限公司)。

1.2 水相合成TGA修飾的CdTe量子點(diǎn)

按照相關(guān)文獻(xiàn)[18]水相合成TGA修飾的CdTe量子點(diǎn)。

1.3 CdTe@SiO2@CS復(fù)合熒光納米粒子的合成

采用反相微乳液法[19]制備核殼型CdTe@SiO2@CS復(fù)合熒光納米粒子，合成過程如圖1所示。將7.5 mL環(huán)己烷、1.8 mL TritonX-100、1.8 mL正己醇加入50 mL圓底燒瓶中，混合均勻，磁力攪拌至澄清透明，接著加入500 μL CdTe水溶液(0.2 μg·mL-1)、250 μL 25%的氨水和500 μL的1%殼聚糖溶液，攪拌30 min，隨后在劇烈攪拌下加入150 μL TEOS，密封避光反應(yīng)24 h。反應(yīng)結(jié)束之后，加入10 mL丙酮破乳，在10 000 r·min-1下高速離心15 min，棄去上清液，得到的產(chǎn)物分別用超純水和乙醇反復(fù)清洗多次，50℃真空干燥備用。

CdTe@SiO2納米粒子的制備方法同上，只是合成過程中不加入殼聚糖。

1.4 CdTe@SiO2@CS復(fù)合熒光納米粒子對DNA的吸附作用

將DNA樣品高速離心后(12 000 r·min-1)溶于Tris-HCl緩沖液(1 mol·L-1，pH=7.4)中配制成100 μmol·L-1貯備液。反應(yīng)液總體積10 mL，固定DNA溶液濃度(10 μmol·L-1)，依次增加CdTe@SiO2@CS復(fù)合熒光納米粒子量(5 mg、10 mg、20 mg、30 mg…)，混合后磁力攪拌反應(yīng)至DNA被完全吸附。反應(yīng)結(jié)束后，將產(chǎn)物在10 000 r·min-1下高速離心，收集上清液，紫外測試DNA殘留含量。

1.5 表征測試

圖1 熒光納米探針的合成示意圖Fig.1 Schematic illustration of the preparation of fluorescent nanoprobes

用FEI公司TecnaiG2F20S-TWIN型透射電鏡及FEI公司INSPECT F型掃描電鏡表征樣品的形貌。紅外光譜分析采用Nicolet公司NEXUS 670型傅立葉變換紅外光譜儀，KBr壓片測定。紫外及熒光光譜的測定分別采用紫外-可見分光光度計(jì)(TU-1901，北京普析通用儀器)和熒光分光光度計(jì)(F-4500型，Hitachi日立)。ζ電位的測定采用Malvern公司ZEN 3690型ζ電位分析儀。

2 結(jié)果與討論

2.1 CdTe量子點(diǎn)及復(fù)合熒光納米粒子的形貌表征

透射電鏡(TEM)和掃描電鏡(SEM)是研究納米粒子的形貌、尺寸及粒徑分布的有效手段。本研究中CdTe量子點(diǎn)的透射電鏡圖如圖2(a)所示，由圖可以看出CdTe納米晶呈球狀，粒徑在3 nm左右，分布較為集中，分散性良好。CdTe@SiO2及CdTe@SiO2@CS復(fù)合熒光納米粒子的掃描電鏡圖如圖2(b)(c)所示，由圖可看出粒子呈規(guī)則圓球形且尺寸分布較集中(平均粒徑分別為73、66 nm)。圖3為由圖2(c)得到的粒徑分布圖。

2.2 CdTe量子點(diǎn)的紫外和熒光光譜分析

如圖4所示，從CdTe量子點(diǎn)的紫外-可見吸收光譜圖得出我們合成的量子點(diǎn)最大吸收波長值為541 nm，可以采取彭氏經(jīng)驗(yàn)公式對CdTe量子點(diǎn)的粒徑進(jìn)行推算[20]，有D=(9.812 7×10-7)λmax3-(1.714 7× 10-3)λmax2+1.006 4λmax-194.84，上式中，λmax為量子點(diǎn)的最大吸收波長值。用上述經(jīng)驗(yàn)公式計(jì)算出量子點(diǎn)的尺寸約為3.14 nm。與圖2(a)TEM統(tǒng)計(jì)算出的粒徑大小基本吻合。

圖2 CdTe量子點(diǎn)(a)的透射電鏡圖,CdTe@SiO2(b)及CdTe@SiO2@CS(c)復(fù)合熒光納米粒子的掃描電鏡圖Fig.2 TEM image of CdTe QDs and SEM images of CdTe@SiO2(b)and CdTe@SiO2@CS(c)

圖3 CdTe@SiO2@CS復(fù)合熒光納米粒子的粒徑分布圖Fig.3 Particle size distribution of CdTe@SiO2@CS

由CdTe量子點(diǎn)的激發(fā)光譜圖可看出CdTe納米晶體具有很寬的激發(fā)范圍，從250～600 nm都可以激發(fā)。從發(fā)射光譜可看出CdTe量子點(diǎn)在600 nm具有最大發(fā)射峰，且熒光發(fā)射峰對稱性很好，并未出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象。

圖4 CdTe量子點(diǎn)的紫外-可見吸收光譜和熒光光譜圖(激發(fā)譜發(fā)射波長為600 nm，發(fā)射譜激發(fā)波長為350 nm)Fig.4 UV-Vis absorption spectra and fluorescence spectra(λem=600 nm，λex=350 nm)of CdTe QDs

2.3 復(fù)合熒光納米粒子與DNA連接前后熒光性能

圖5 CdTe@SiO2、CdTe@SiO2@CS及CdTe@SiO2@CS -DNA復(fù)合熒光納米粒子熒光發(fā)射光譜圖Fig.5 Fluorescence emission spectra of CdTe@SiO2、CdTe@SiO2@CS and CdTe@SiO2@CS-DNA

本研究中所制備的復(fù)合熒光納米粒子均具有較高的熒光強(qiáng)度、半峰寬窄、發(fā)光性能良好，如圖5所示，分別為CdTe@SiO2、CdTe@SiO2@CS及CdTe@ SiO2@CS-DNA(濃度均為1 mg·mL-1)在激發(fā)波長為300 nm下的熒光發(fā)射光譜圖。與殼聚糖交聯(lián)引入氨基-NH2后，熒光強(qiáng)度有所下降，但與DNA連接前后，仍具有較強(qiáng)的熒光性能。由圖可知，連接DNA后，熒光半峰寬有所加大，這可能是由于復(fù)合熒光納米粒子與DNA結(jié)合后粒徑增大，表面結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，DNA共軛結(jié)構(gòu)引起粒子表面電荷發(fā)生變化所導(dǎo)致的。

2.4 CdTe量子點(diǎn)及復(fù)合熒光納米粒子的紅外分析

圖6(a)是CdTe量子點(diǎn)的紅外光譜圖。3 000～3 500 cm-1間寬峰為羧酸官能團(tuán)中的-OH伸縮振動峰，圖中在2 565 cm-1附近無-SH的特征峰，說明在量子點(diǎn)合成中，巰基乙酸的-SH與CdTe量子點(diǎn)表面Cd2+發(fā)生了配位，形成巰基乙酸穩(wěn)定的CdTe量子點(diǎn)。

圖6 CdTe量子點(diǎn)(a)、CdTe@SiO2(b)及CdTe@SiO2@CS (c)復(fù)合熒光納米粒子的紅外光譜圖Fig.6 FTIR spectra of CdTe QDs(a)、CdTe@SiO2(b)and CdTe@SiO2@CS(c)

圖6 (b)和(c)分別為接氨基前后復(fù)合熒光納米粒子的紅外光譜圖，由圖可知1 099、799、468 cm-1特征峰表明了量子點(diǎn)表面SiO2殼層的形成[21]，其中1 099 cm-1對應(yīng)Si-O-Si反對稱伸縮振動，468 cm-1對應(yīng)Si-O-Si彎曲振動。與圖(b)相比，圖(c)在2 924、1 538 cm-1處出現(xiàn)了新的吸收峰，應(yīng)為殼聚糖的-CH2伸縮振動峰和-NH2彎曲振動峰。結(jié)果表明，殼聚糖已成功包裹在量子點(diǎn)外層，使粒子表面帶有氨基基團(tuán)。

2.5 CdTe量子點(diǎn)及復(fù)合熒光納米粒子的ζ電位分析

CdTe@SiO2@CS復(fù)合熒光納米粒子如與DNA之間是通過靜電作用進(jìn)行吸附的，殼聚糖結(jié)構(gòu)中大量的-NH2使之帶正電，粒子理論上應(yīng)具有與殼聚糖一致的正電性。ζ電位測量中，CdTe量子點(diǎn)濃度為0.2 μg·mL-1，CdTe@SiO2及CdTe@SiO2@CS粒子濃度為1 mg·mL-1，緩沖液(buffer)為Tris-HCl溶液(1 mol·L-1，pH=7.4)。測定粒子表面電荷結(jié)果如表1所示，CdTe量子點(diǎn)及CdTe@SiO2的ζ電位值為負(fù)值，而包覆了殼聚糖的CdTe@SiO2@CS的ζ電位為正值。由此可看出，CdTe@SiO2@CS復(fù)合熒光納米粒子表面已接上氨基基團(tuán)且電位為正值，從而可以通過靜電作用與DNA進(jìn)行吸附。

表1 CdTe量子點(diǎn)、CdTe@SiO2及CdTe@SiO2@CS復(fù)合納米粒子ζ電位值Table1 ζ Potential of CdTe QDs、CdTe@SiO2and CdTe@SiO2@CS

2.6 復(fù)合熒光納米粒子對DNA吸附性能

CdTe@SiO2及CdTe@SiO2@CS復(fù)合熒光納米粒子與DNA進(jìn)行靜電吸附作用后產(chǎn)物離心分離，通過測定上清液紫外吸收可得到不同粒子加入量對應(yīng)的吸附DNA量，如圖7所示。由圖可看出，隨著粒子加入量增加，CdTe@SiO2對DNA幾乎沒有吸附作用，而CdTe@SiO2@CS所吸附的DNA量隨之增加，當(dāng)粒子加入量達(dá)到60 mg時(shí)，所加入DNA被完全吸附，達(dá)到吸附平衡，因而可計(jì)算出CdTe@SiO2@CS復(fù)合熒光納米粒子的吸附能力為Qmax=16.67 nmol·mg-1。由此可見，氨基修飾后的CdTe@SiO2@CS復(fù)合熒光納米粒子對DNA具有良好的吸附作用。

圖7 CdTe@SiO2及CdTe@SiO2@CS復(fù)合熒光納米粒子加入量對DNA的吸附量Fig.7 Adsorption quantity of CdTe@SiO2and CdTe@SiO2@CS

3 結(jié)論

通過水相合成法合成了具有高熒光強(qiáng)度的CdTe量子點(diǎn)并通過反相微乳液法成功制備了表面氨基化、粒徑均一的CdTe@SiO2@CS核殼型復(fù)合熒光納米粒子。結(jié)果表明，復(fù)合熒光納米粒子在Tris-HCl緩沖液中對DNA具有良好的吸附作用。富含G堿基DNA熒光納米探針的成功制備對G-四鏈體結(jié)構(gòu)在腫瘤治療和抗腫瘤藥物設(shè)計(jì)開發(fā)研究中具有潛在應(yīng)用價(jià)值。與此同時(shí)，本研究中所制備的表面富含氨基的復(fù)合熒光納米粒子也可與其他DNA、蛋白質(zhì)等生物活性分子特異性結(jié)合，在生物探針、載藥系統(tǒng)及基因診斷等生物醫(yī)藥領(lǐng)域顯示出廣闊的應(yīng)用前景。

[1]Ron G,Maya Z,Itamar W.Angew.Chem.Int.Ed.,2008,47: 7602-7625

[2]Dong K Y,Tamil S,et al.J.Am.Chem.Soc.,2005,127: 4990-4991

[3]Zhao Y,Hao C L,Ma W,et al.J.Phys.Chem.C,2011, 115:20134-20140

[4]Igor L M,Lorenzo B,Thomas P,et al.Nano Lett.,2007,7(6): 1741-1748

[5]Aditya S,Chandra M P,Gajjala S,et al.Biosens.Bioelectron., 2012,38:107-113

[6]Weng J F,Song X T,Li L,et al.Talanta,2006,70:397-402

[7]Wang X,Lou X H,Guo Q C,et al.Biosens.Bioelectron., 2010,25:1934-1940

[8]LIN Zhang-Bi(林章碧),SU Xing-Guang(蘇星光),ZHANG Hao(張皓),et al.Chem.J.Chinese Universities(高等學(xué)校化學(xué)學(xué)報(bào)),2003,24(2):216-220

[9]Han M Y,Gao X H,Su Jack Z,et al.Nat.Biotechnol., 2001,19:631-635

[10]Manuela F F,Nikos C.Anal.Bioanal.Chem.,2010,396: 229-240

[11]Gary N P,Michael P H L,Stephen N.Nature,2002,417: 876-880

[12]Akiyoshi H,Kouki F,Taisuke O,et al.Nano Lett.,2004,4 (11):2163-2169

[13]YANG Wei-Hai(楊衛(wèi)海),LI Wan-Wan(李萬萬),SUN Kang (孫康).Chem.J.Chinese Universities(高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào)), 2008,29(4):681-685

[14]ZHANG Bing-Bo(張兵波),GONG Xiao-Qun(宮曉群),LIN Ting-Ting(林婷婷),et al.Chem.J.Chinese Universities(高等學(xué)校化學(xué)學(xué)報(bào)),2009,30(2):246-249

[15]Li Y B,Zhang H X,Guo C X,et al.Chem.Res.Chinese Univ.,2012,28(2):276-281

[16]Felippe J P,Luciano C,Osvaldo N O.Biomacromolecules, 2010,11:1897-1908

[17]Liu W G,Sun S J,Cao Z Q,et al.Biomaterials,2005,26: 2705-2711

[18]ZHANG Xue-Lian(張雪蓮),LI Ya-Ru(李亞茹),PAN Yuan-Yuan(潘園園),et al.Chem.Res.Appl.(化學(xué)應(yīng)用與研究), 2012,24(5):666-671

[19]Yang Y H,Gao M Y.Adv.Mater.,2005,17:2354-2357

[20]Yu W W,Qu L H,Guo W Z,et al.Chem.Mater.,2003,15: 2854-2860

[21]Wang Z Q,Zhou Y M,Yao Q Z,et al.Appl.Surf.Sci., 2009,256:1404-1408

Preparation and Characterization of CdTe QDs-DNA Fluorescent Nanoprobes

ZHANG Qiu-YanSUN LinLI Zhen-ZhenPAN Yu-JinWANG QingZHAO Qiang＊
(College of Chemical Engineering,Sichuan University,Chengdu 610065,China)

The water-soluble CdTe quantum dots were synthesized with Thioglycolicacid(TGA)as stabilizer in the aqueous solution,and the ammonified core/shell nanoparticles coated with TEOS and chitosan were synthesized with reverse microemulsion method.The nanocomposites were connected with DNA by electrostatic adsorption. The property and morphology of these particles were characterized by SEM,TEM,FL,IR,UV and Zeta Potential. The results showed that the amino-modified nanocomposites were synthesized successfully and had high adsorption capacity for DNA.

CdTe Quantum Dots;ammonification;fluorescence;nanoprobe;DNA

O657.3

A

1001-4861(2015)03-0543-05

10.11862/CJIC.2015.093

2014-11-24。收修改稿日期：2015-01-07。

國家自然科學(xué)基金(No.20975072)資助項(xiàng)目。

＊通訊聯(lián)系人。E-mail：zhaoqiang@scu.edu.cn