王 銳，陸 鋮，葛 斌，袁繼勇，高慶劍，湯 浩△

1甘肅省人民醫(yī)院藥劑科，甘肅 蘭州 730000；2寧夏醫(yī)科大學藥學院

HPLC-DAD法同時測定消乳增膠囊的三種活性成分*

王 銳1，2，陸 鋮1，2，葛 斌1，袁繼勇1，高慶劍1，2，湯 浩1△

1甘肅省人民醫(yī)院藥劑科，甘肅 蘭州 730000；2寧夏醫(yī)科大學藥學院

目的：建立HPLC-DAD法同時測定消乳增膠囊中的多種活性成分。方法：采用DAD全波長掃描，色譜柱為Gemini C18(250mmx4.60mm,5μm)，流動相為乙腈，甲醇為10：90(A)-0.5%冰醋酸水溶液(B)梯度洗脫，流速為0.8mL/min；檢測波長為280 nm。結果：甘草苷線性范圍為1.25～40μg/mL，平均回收率為98.51%，RSD為0.81%；橙皮苷線性范圍為2.5～80μg/mL，平均回收率為98.10%，RSD為1.32%；歐前胡素線性范圍為5～160μg/mL，平均回收率為98.92%，RSD為0.76%。結論：該HPLC-DAD方法能有效測定消乳增膠囊中甘草苷、橙皮苷及歐前胡素的主要活性成分含量，且快速、準確。

HPLC-DAD；“消乳增”膠囊；橙皮苷；甘草苷；歐前胡素

消乳增膠囊由甘肅省人民醫(yī)院自主研發(fā)，臨床應用10余載，由甘草、青皮、陳皮、白芷等17味中藥組成，具有行氣解瘀、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌失調(diào)的功能，常用于治療乳癰、乳腺增生癥等。經(jīng)多年臨床使用，現(xiàn)已在處方改進方面積累了經(jīng)驗，鑒于僅對白芍有效成分芍藥苷建立了H P L C測定方法［1］，已不能滿足制劑改進后的全面質(zhì)控和藥效學機制深入研究的要求，本研究采用H P L C-D A D法優(yōu)選色譜條件，最終選取以甘草苷、橙皮苷、歐前胡素為指標的多種活性成分色譜同時定量方法，為該制劑的進一步改進及質(zhì)量控制等方面提供方法學支持。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 美國A g il e n t公司1100系列高效液相色譜儀(配置G1312A二元梯度泵、G1313A自動進樣系統(tǒng)、G1315B二極管陣列檢測器及A g il e n t C h e m S tat i o n f or L C 3D R e v A.10.02色譜工作站)；電子分析天平［梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司］；超聲清洗儀(上?？茖в邢薰?。

1.2 試劑 消乳增膠囊(甘肅省人民醫(yī)院自制，批號：20101108)；橙皮苷對照品(批號：110721-201014)、甘草苷對照品(批號：111610-201057)、歐前胡素對照品(批號：110826-201013)均購自中國食品藥品檢定研究院；三蒸水為自制；甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱G e m ini C18(250mm×4.60mm，5μm)柱；流動相為乙腈；甲醇=10∶90(A)-0.5%冰醋酸水溶液(B)，梯度洗脫，20%A(0～5m in)，20%～40%A(5～10 m in)，40%A(10～15 m in)，40%～60%A (15～20m in)。60%A(20～50m in)；流速為0.8m L/m in；檢測波長為280 n m；柱溫為室溫，見圖1。

圖1 消乳增三種指標成分同時測定色譜圖

2.2 對照品溶液的制備 精密秤取甘草苷、歐前胡素各20m g置于10m L容量瓶中，取橙皮苷20m g置于100m L容量瓶中，分別用甲醇溶解并定容至刻度，得單一對照品溶液。分別取0.1m L甘草苷對照品溶液，2m L橙皮苷對照品溶液，0.4m L歐前胡素對照品溶液，置于5m L容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得混合對照品溶液。

2.3 樣品溶液的制備 取20粒消乳增膠囊內(nèi)容物，混合均勻，精密秤取粉末0.5 g置于5m L容量瓶中，用甲醇超聲30分鐘溶解，待溶液放冷，用甲醇定容至刻度，濾紙過濾，進樣前用0.45μm濾膜過濾，既得樣品溶液。

2.4 陰性對照溶液的制備 按消乳增膠囊處方量取無甘草、青皮、陳皮、白芷的藥材，按消乳增膠囊制備方法制備陰性樣品，再按“2.3”項下樣品溶液制備方法制備陰性對照溶液。

2.5 線性關系考察 取混合對照品溶液作為“1號”對照溶液，采用倍比稀釋法，精密吸取“1號”對照溶液1m L于2m L容量瓶中，加甲醇定容至刻度得到“2號”混合對照溶液，依次配出“3號”“4號”“5號”“6號”混合對照溶液。精密吸取各混合對照溶液20μL進樣，進行色譜測定，按“2.1”項下色譜條件進行色譜分析，以進樣量(Y，μg/m L)對峰面積(X，A)進行線性回歸，分別得甘草苷回歸方程為y=54.205x+14.396，r=0.999 5，n=6，線性范圍為1.25～40μg/m L；橙皮苷回歸方程為y=34.593x+72.438，r=0.999 4，n=6，線性范圍為2.5～80μg/m L；歐前胡素的 回歸方程為y=28.895x+147.77，r=0.9992，n=6，線性范圍為5～160μg/m L。

2.6 穩(wěn)定性實驗 取同一樣品，按“2.3”項制備樣品溶液，依“2.1”項的色譜條件進樣，分別在0、4、8、12、16、24小時進樣，測定峰面積。結果：甘草苷峰面積的RS D=0.78%；橙皮苷峰面積的RS D=1.09%；歐前胡素峰面積的RS D=2.38%。

2.7 精密度實驗 精密吸取同一濃度混合對照溶液，按“2.1”項色譜條件，重復進樣5次，測定峰面積，結果甘草苷峰面積的RS D=1.67%；橙皮苷峰面積的RS D=2.42%；歐前胡素峰面積的RS D=1.28%。

2.8 重現(xiàn)性實驗 取同一批次樣品6份，按“2.3”項制備樣品溶液，依“2.1”項色譜條件進樣，測定峰面積，結果甘草苷峰面積的RS D=1.47%；橙皮苷峰面積的RS D=0.69%；歐前胡素峰面積的RS D=2.15%。

2.9 加樣回收實驗 精密秤取干燥至恒重的消乳增膠囊粉末0.5g精確加入一定量的對照溶液，按“2.3”項下制備方法制備樣品溶液，依“2.1”項下色譜條件進樣20μL，結果見表1—3。

表1 甘草苷的回收率

表2 橙皮苷的回收率

表3 歐前胡素的回收率

2.10 樣品含量測定 精密秤取3批消乳增膠囊各3份，每份0.5 g，按“2.3”項下制備方法制備樣品溶液，依“2.1”項下色譜條件進樣20μL，計算甘草苷、橙皮苷、歐前胡素的含量，結果見表4。

表4 樣品含量測定結果(n=3)

3 討論

消乳增膠囊在我院臨床應用多年，發(fā)揮了特色中藥制劑的優(yōu)良品質(zhì)，彌補了西醫(yī)治療乳腺增生療效的不足。依成方組分特點，甘草具有補脾益氣，清熱解毒，緩急止痛，調(diào)和諸藥的作用，其活性成分甘草苷具有解痙和抗腫瘤作用［2-3］；陳皮具有降氣寬中，健脾溫胃的功效，其活性成分橙皮苷有神經(jīng)保護和抗纖維化作用［4-5］；白芷具有祛風除濕，通竅止痛，消腫排膿的功效，其活性成分歐前胡素具有血管舒張、抗腫瘤及緩解痛經(jīng)的作用［6-8］。本研究采用H P L C法同時對3種君藥有效成分甘草苷、橙皮苷、歐前胡素的含量進行測定，所建方法快捷、準確，有利于“消乳增”膠囊的質(zhì)量控制及組方改進后藥效物質(zhì)基礎的進一步研究。

在實驗中參考相關文獻［8-14］，以優(yōu)化橙皮苷和甘草苷的分離度，考察了多種流動相體系，如甲醇∶水系統(tǒng)，乙腈∶水系統(tǒng)，甲醇∶冰醋酸∶水系統(tǒng)，乙腈∶冰醋酸∶水系統(tǒng)，乙腈∶甲醇∶冰醋酸∶水系統(tǒng)等，比較各個組分的保留時間和分離度，結果顯示在乙腈∶甲醇=10∶90(A)-0.5%冰醋酸水溶液(B)條件下最好。以基線分離為原則，對不同梯度洗脫程序進行優(yōu)化。確定最終洗脫程序為20%A(0～5m in)，20%～40%A(5～10m in)，40%A(10～15m in)，40%～60% A(15～20m in)，60%A(20～50m in)；以上條件下消乳增膠囊能夠排除雜質(zhì)峰的干擾，達到基線分離，見圖2—3。

圖2 色譜流動相體系篩選

圖3 色譜流動相梯度篩選

本實驗利用D A D多波長掃描功能，對多種活性成分進行最大吸收波長的優(yōu)化，在280 n m時由于基線穩(wěn)定、重復性高，故選其為檢測波長。該方法同時能對復方中藥的3種活性成分進行定量，定量指標更全面，結果準確、可靠，更具參考意義。

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Determ ination of Three Active Com ponents in XiaoRuZeng Capsulesby HPLC-DAD M ethod

WANG Rui1,2,LU Cheng1,2,GE Bin1,Yuan Jiyong1,GAO Qingjian1,2,TANG Hao1△
1 Pharnacy Departmentof Gansu People′s Hospital,Lanzhou 730000,China; 2 Pharmacy College of Ningxia Medical University

Objective:To determine themulti-active components in XiaoRuZeng capsules by a HPLC-DAD method.Methods:W ith DAD fullwavelength scan,the determ ined conditionswere follows:chromatographic column:Gem iniC18(250mm×4.60mm);mobile phase:acetonitrite/methanol(10:90)(A)and 0.5%acetic acid(B) w ith gradientelution;flow rate:0.8m L/min;detection wavelength:280 nm.Results:The results revealed that the linear range of liquiritin was 1.25～40μg/m L,the average recovery 98.51%aswell as RSD 0.81%,the linear range ofhesperidinwas2.5～80μg/m L,the average recovery 98.10%aswellas RSD 1.32%and the linear range of imperatorin was 5～160μg/m,the average recovery 98.92%aswellas RSD 0.76%.Conclusion:The HPLC-DAD method isaccurate and easy in determining themain componentsof XiaoRuZeng capsules like hesperidin,liquiritin and imperatorin.

HPLC-DAD;XiaoRuZeng capsules;hesperidin;liquiritin;imperatorin

R285

A

1004-6852(2015)03-0025-04

2014-08-28

甘肅省中醫(yī)藥科研立項課題(編號GZK-2010-4)；甘肅省省自然科學研究基金計劃項目(編號1107RJZA130)。

王銳(1990—)，男，在讀碩士研究生。研究方向：中藥藥效物質(zhì)基礎研究。

△通訊作者：湯浩(1975—)，女，博士學位，碩士研究生導師，副主任藥師。研究方向：醫(yī)院藥學和中藥新藥開發(fā)。