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6個線粒體DNA SNP的微測序技術(shù)檢測及群體遺傳學(xué)研究

杜冰1，杜宏2，周斌3，張林4

(1.川北醫(yī)學(xué)院法醫(yī)系，四川南充637000;2.四川省公安廳刑偵局技術(shù)處; 3.四川大學(xué)華西第二醫(yī)院; 4.四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院，四川成都610041)

【摘要】目的:應(yīng)用SNaPshot技術(shù)建立一個檢測6個線粒體DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)的復(fù)合檢測系統(tǒng)，并利用其對四川地區(qū)140名漢族無血緣關(guān)系個體進行群體遺傳學(xué)研究。方法:選擇mtDNA上709、6455、10398、12705、14569和15043等6個SNP位點進行復(fù)合擴增，利用熒光標(biāo)記單堿基延伸技術(shù)(SNaP-shot kit)結(jié)合毛細(xì)管電泳技術(shù)對SNP進行檢測。結(jié)果: 6個SNP位點均具有遺傳多態(tài)性，在140名個體中檢測到12種單體型，單體型多樣性為0.763 8。結(jié)論:該復(fù)合檢測系統(tǒng)能快速而準(zhǔn)確的對樣本進行分型，在法醫(yī)學(xué)實踐中具有應(yīng)用價值。

【關(guān)鍵詞】單核苷酸多態(tài)性(SNP);線粒體DNA;復(fù)合擴增;微測序;毛細(xì)管電泳

線粒體DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)是唯一分布于細(xì)胞核外的遺傳物質(zhì)，幾乎存在于人體所有的組織、細(xì)胞中。mtDNA具有突變率高、母系遺傳、細(xì)胞內(nèi)拷貝數(shù)多等特點，對于因微量、降解、腐敗等原因?qū)е潞薉NA無法檢測的樣本及母系親緣關(guān)系鑒定，mtDNA檢測分析在法醫(yī)學(xué)鑒定中起著重要作用［1-2］。

單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)是繼限制性片段長度多態(tài)性和短串聯(lián)重復(fù)序列外的第三代DNA遺傳標(biāo)記，具有遺傳穩(wěn)定、數(shù)量多、檢測片段短、可以高通量、自動化檢測等特點，廣泛應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)、醫(yī)學(xué)遺傳等領(lǐng)域［3-5］。微測序法可對SNP進行快速、準(zhǔn)確的檢測［6］。本研究采用微測序法結(jié)合毛細(xì)管電泳技術(shù)，建立了一個檢測6個mtDNA SNP位點的復(fù)合檢測系統(tǒng)，并將其用于四川地區(qū)140名漢族無血緣關(guān)系個體的線粒體SNP位點的群體遺傳學(xué)調(diào)查。

1　材料和方法

1.1樣本DNA

從四川漢族人群中隨機抽取140名無親緣關(guān)系的健康個體外周靜脈血樣，EDTA抗凝，-20℃保存。

1.2DNA提取

采用酚/氯仿法提取DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3SNP位點的選擇及引物設(shè)計

檢索rCRS(http://www.mitomap.org)，獲得完整線粒體DNA序列信息，選擇了線粒體DNA編碼區(qū)上709、6455、10398、12705、14569和15043等6 個SNP位點進行研究。采用Primer5.0和Oligo 6.0軟件自行設(shè)計PCR引物和微測序引物。在部分微測序引物5'末端添加不同長度的polyC和poly (GACT)。引物由上海Invitrogen公司合成，PCR引物序列、微測序引物序列分別見表1和表2。

表1　6個線粒體SNP位點及PCR引物序列

1.4單位點SNP PCR擴增體系的建立及檢測

6個線粒體SNP位點分別對DNA樣本進行單獨擴增以驗證其正確性。PCR反應(yīng)體系為37.5 μL，其中包括10x PCR buffer 3.75 μL，25 mmol MgCl22.25 μL，200 μmol dNTP 4 μL，上、下游引物各為10 pmol，5 U/μL DNA聚合酶0.3 μL，1～10 ng模板DNA。PCR熱循環(huán)參數(shù): 94℃4 min; 94℃30 s，60℃45 s，72℃60 s，循環(huán)34次;最后72℃延伸15 min。PCR擴增產(chǎn)物采用7％非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，銀染檢測。

1.5單位點SNP單堿基延伸反應(yīng)及檢測

1.5.1PCR產(chǎn)物純化采用Exonuklease 1(20 U/μL)，SAP(1 U/μL)試劑對PCR產(chǎn)物進行純化處理。純化體系為10 μL:其中含PCR產(chǎn)物2 μL，Exo/SAP 3 μL。37℃孵育60 min，80℃15 min滅活酶活性。

1.5.2單堿基延伸反應(yīng)及產(chǎn)物純化使用SNaP-shot (ABI，美國)試劑盒進行單堿基延伸反應(yīng):反應(yīng)體系為7 μL:其中含EXO/SAP純化后PCR產(chǎn)物1 μL，微測序引物濃度為0.2 μmol，SNaPshot試劑2 μL。循環(huán)參數(shù): 96℃10 s，50℃5 s，60℃30 s，循環(huán)25次。微測序產(chǎn)物中加入0.7 μL SAP(1 U/μL)，37℃孵育60 min，80℃15 min滅活酶活性。1.5.3單堿基延伸產(chǎn)物檢測取1.5 μL SNP單堿基延伸產(chǎn)物、10 μL甲酰胺和0.5 μL的內(nèi)標(biāo)Liz 120，混勻后上樣于ABI-310遺傳分析儀進行電泳分析。

表2　6個線粒體SNP位點的微測序引物序列

1.6SNP復(fù)合擴增體系的建立及檢測

PCR復(fù)合擴增反應(yīng)體系為25 μL，其中含上、下游引物各為10 pmol，1～10 ng DNA模板，10x PCR buffer 3.75 μL，200 μmol dNTP 4 μL，25 mmol MgCl22.25 μL，5 U/μL DNA聚合酶0.3 μL。PCR熱循環(huán)參數(shù): 94℃5 min，94℃60 s，58℃60 s，72℃60 s，循環(huán)36次，最后72℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物檢測同1.4。

1.7復(fù)合引物單堿基延伸及檢測

PCR復(fù)合擴增產(chǎn)物純化后，將各單堿基延伸引物混合(引物濃度均為0.2 μm)，進行復(fù)合引物單堿基延伸反應(yīng)，延伸產(chǎn)物純化后在ABI-310遺傳分析儀上進行電泳分析，方法同1.5。

1.8統(tǒng)計學(xué)分析

采用直接計數(shù)法計算SNP位點的等位基因頻率及單體型頻率。按文獻［7］計算基因變異度、單體型多樣性、偶合概率等遺傳參數(shù)。

2　結(jié)果

2.17％非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果

6個線粒體SNP位點成功地進行了單獨擴增，PCR產(chǎn)物片段大小范圍為99～225 bp。擴增產(chǎn)物采用7％非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，銀染檢測，結(jié)果見圖1。

圖1　6個線粒體SNP擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果

2.2單位點微測序檢測結(jié)果

采用微測序技術(shù)分別檢測6個線粒體SNP位點，單堿基延伸反應(yīng)產(chǎn)物的片段大小在27～58 bp，各位點的檢測峰均為單峰，所有位點均能準(zhǔn)確分型。

2.3復(fù)合微測序反應(yīng)檢測結(jié)果

包含6個線粒體SNP位點的復(fù)合擴增產(chǎn)物采用7％非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，各SNP位點復(fù)合擴增成功，見圖1。復(fù)合引物單堿基延伸反應(yīng)產(chǎn)物采用ABI-310遺傳分析儀進行檢測，6個SNP位點均能成功檢出，準(zhǔn)確分型。熒光檢測結(jié)果，見圖2。

圖2　6個線粒體SNP位點復(fù)合擴增后微測序反應(yīng)的檢測結(jié)果

2.46個線粒體SNP的遺傳多態(tài)性

對四川漢族群體140個無關(guān)個體血液樣本進行上述6個線粒體SNP位點檢測后得到群體遺傳學(xué)數(shù)據(jù)。結(jié)果顯示，709、6455、10398、12705、14569和15043等6個線粒體SNP位點在四川漢族群體均存在多態(tài)性，6個SNP位點的等位基因頻率和變異度結(jié)果見表3。此外，我們觀察到12種單體型，其中2種單體型在我們研究的樣本中是唯一的，單體型多樣性為0.763 8，偶合概率為0.333 6。單體型分布及頻率見表4。

表3　6個線粒體SNP位點的群體遺傳學(xué)數(shù)據(jù)

表4　6個線粒體SNP位點在四川漢族群體的單體型分布

3　討論

線粒體DNA在個體識別、母系親緣關(guān)系認(rèn)定等法醫(yī)學(xué)鑒定中具有重要作用。傳統(tǒng)的線粒體DNA檢測方法主要采用直接測序法，檢測線粒體DNA堿基變異相對集中的控制區(qū)。僅檢測控制區(qū)，mtDNA的個體識別能力非常有限［8-9］。由于mtDNA中約三分之一的堿基替換突變率比較高，因此法科學(xué)DNA檢驗不僅可對控制區(qū)的堿基變異進行檢測，也可對包括編碼區(qū)在內(nèi)的SNP進行檢測，從而更大程度地提高線粒體DNA在個體識別鑒定中的排除能力［10］。

SNP是基因組內(nèi)單個核苷酸變異引起的DNA序列多態(tài)性，能反映群體遺傳結(jié)構(gòu)和個體間的遺傳差異。目前已建立的SNP檢測方法有MALDI-TOF技術(shù)、焦磷酸測序技術(shù)、TaqMan探針、SNaPshot微測序技術(shù)等方法［11-13］。不同的檢測方法有各自的優(yōu)勢和特點，往往需要根據(jù)實驗室平臺和檢驗?zāi)康倪M行選擇。微測序技術(shù)又稱為單堿基延伸法，它利用商品化SNaPshot試劑盒，以熒光標(biāo)記的ddNTP進行等位基因特異性引物延伸，且僅延伸一個堿基，然后可通過毛細(xì)管電泳等方法進行檢測。此方法在目前現(xiàn)有的法醫(yī)學(xué)DNA實驗室平臺即可完成，操作簡單，費時短，易于普及。

本研究采用SNaPshot試劑盒，利用熒光電泳檢測手段，通過微測序技術(shù)，對線粒體編碼區(qū)6個SNP進行了快速、準(zhǔn)確的檢測。在四川漢族群體140個無關(guān)個體的6個SNP位點檢測中，我們在709、6455、10398、12705、14569和15043等6個位點均觀察到多態(tài)性，呈現(xiàn)變異較多的SNP位點為12705、10398、15043和7094個SNP位點，其堿基變異頻率分別為57.1％、57.9％、44.3％和22.9％。檢測的6 個SNP位點的堿基變異均為轉(zhuǎn)換，且轉(zhuǎn)換類型主要是嘌呤之間的轉(zhuǎn)換，嘧啶之間的轉(zhuǎn)換較少。此外，觀察到12種單體型，其中2種單體型在我們研究的樣本中是唯一的，單體型多樣性為0.763 8，偶合概率為0.333 6，這6個線粒體編碼區(qū)SNP位點具有較好的法醫(yī)學(xué)應(yīng)用價值。

綜上所述，我們成功建立了一個采用微測序技術(shù)檢測6個線粒體SNP位點的復(fù)合檢測系統(tǒng)，能在現(xiàn)有法醫(yī)學(xué)DNA實驗室平臺上對SNP進行快速而準(zhǔn)確的分型，在法醫(yī)學(xué)實踐中具有應(yīng)用價值，后續(xù)研究將進行法醫(yī)學(xué)可行性研究，探討其在法醫(yī)學(xué)實踐中的實用價值。

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網(wǎng)絡(luò)出版時間: 2015-3-5 12∶47網(wǎng)絡(luò)出版地址: http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20150305.1247.004.html

A minisequencing technique for genotyping 6 SNP loci on mitochondrial DNA and its genetic polymorphisms

DU Bing1，DU Hong2，ZHOU Bin3，ZHANG Lin4

(1.Department of Forensic Medicine，North Sichuan Medical College，Nanchong 637000; 2.Department of Criminal Technique，Sichuan Public Security Bureau，Chengdu 610041;3.West China Second University Hospital，Sichuan University，Chengdu 610041; 4.West China School of Preclinical and Forensic Medicine，Sichuan University，Chengdu 610041，Sichuan，China)

【Abstract】Objective: To establish a multiplex genotyping system of mtDNA SNP using SNaPshot kit and to obtain the population genetic data in Sichuan Han population.Methods: A total of 6 mtDNA SNP loci，including 709，6455，10398，12705，14569 and 15043，were multiple amplified and then used as templates for the minisequencing reaction with SNaPshot kit.The products of minisequencing reaction were detected by capillary electrophoresis.Results: All of the mtDNA SNP are polymorphic in Chinese.A total of 12 haplotypes were found，the haplotype diversity was calculated to be 0.990 7.Conclusion: The mtDNA SNP co-amplification system is efficient and appears to be suitable for forensic science.

【Key words】SNP; Mitochondrial DNA; Co-amplification; Minisequencing; Capillary electrophoresis

通訊作者:張林，E-mail: zhanglin@scu.edu.cn

作者簡介:杜冰(1968-)，女，四川南充人，博士，教授，主要從事法醫(yī)物證學(xué)研究。

基金項目:四川省教育廳支撐計劃(11ZA2123)

收稿日期:2014-11-12

doi:10.3969/j.issn.1005-3697.2015.01.04

【文章編號】1005-3697(2015)01-0015-05

【中圖分類號】R394.5; R446

【文獻標(biāo)志碼】A