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4個Y-miniSTR基因座熒光標(biāo)記復(fù)合擴(kuò)增體系的建立

王惠1，白小剛1，夏昱1，李慶慶1，何望2，梁偉波2

(1.成都市公安局刑偵局，四川成都610081;2.四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院法醫(yī)物證學(xué)教研室，四川成都610041)

【摘要】目的:構(gòu)建DYS456，DYS392，DYS439，Y-GATA-H4等4個Y-miniSTR基因座復(fù)合擴(kuò)增體系，評價其檢測敏感度、數(shù)據(jù)庫兼容性和對降解檢材的分型能力。方法:設(shè)計4個Y-miniSTR的引物，用FAM、JOE、ROX、TAMRA分別標(biāo)記其上游引物，構(gòu)建復(fù)合擴(kuò)增體系。利用本體系的引物擴(kuò)增稀釋過的Y23試劑盒的ladder，制備等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物。比較該體系與Promega PowerPlex?Y23試劑盒在普通檢材、降解檢材的分型能力、敏感度和分型結(jié)果。結(jié)果:同一樣本體系分型結(jié)果和商業(yè)化試劑盒Y23 STR分型結(jié)果相同，4個Y-miniSTR復(fù)合擴(kuò)增體系和對降解檢材的分型成功率更高，敏感度一致，具有數(shù)據(jù)庫兼容性。結(jié)論:本研究中的4個Y-miniSTR復(fù)合擴(kuò)增體系對降解檢材的檢測具有應(yīng)用價值，敏感性較好，具有數(shù)據(jù)庫兼容性，可以作為對降解檢材分型時商業(yè)化試劑盒的補充。

【關(guān)鍵詞】法醫(yī)物證學(xué);復(fù)合擴(kuò)增體系; miniSTR; Y染色體;降解DNA;低模版DNA

短串聯(lián)重復(fù)序列(short tandem repeats，STR)是廣泛存在于人類基因組中的一類具有長度多態(tài)性的DNA序列，由2～6 bp順序相同的重復(fù)序列單位首尾串聯(lián)重復(fù)排列組成。目前，STR分型是國內(nèi)外法醫(yī)個人識別和親權(quán)鑒定的最主要的手段。

Y染色體短串聯(lián)重復(fù)序列(Y-STR)由于其單倍型父系遺傳特點，在法醫(yī)學(xué)和群體遺傳學(xué)中具有重要而獨特的作用［1］。在法醫(yī)學(xué)個人識別、親權(quán)鑒定中，對于各種形式的混合斑如精液與陰道液，含有男性成分的體液斑等的檢驗中［2］，可直接檢測Y-STR確定男性個體;在假設(shè)父缺席時可借助男系的男性親屬對男性的子代進(jìn)行親權(quán)鑒定。因此Y-STR越來越受到法醫(yī)學(xué)工作者的重視［3］。

在實際檢案過程中，檢材所處環(huán)境復(fù)雜，不利于DNA的保存。在應(yīng)用商品化STR試劑盒進(jìn)行DNA分型時可能出現(xiàn)優(yōu)勢擴(kuò)增或者無效擴(kuò)增，無法獲得合格的分型結(jié)果，進(jìn)行高度降解的DNA的STR分型成為法醫(yī)檢驗的難點［4］。mini-STR技術(shù)即設(shè)計引物時盡量縮小擴(kuò)增子的長度［5］，在高降解檢材STR分型中逐漸受到研究者的重視［6］。

本研究旨在建立新型的4個Y-miniSTR基因座熒光標(biāo)記復(fù)合擴(kuò)增體系，并對其法醫(yī)學(xué)應(yīng)用進(jìn)行初步研究。

1　材料和方法

1.1DNA制備

12份中國漢族健康無關(guān)男性個體血液樣本來自四川大學(xué)華西法醫(yī)鑒定中心，其中3份使用酚氯仿法(試劑購于成都瑞信生物公司)提取DNA，剩余9份使用百泰克全血基因組DNA快速提取試劑盒提取DNA，使用Thermo Fisher NanoDrop1000紫外分光光度計對DNA進(jìn)行定量。

利用酚氯仿法提取的3份DNA進(jìn)行超聲波降解制作高降解DNA。使用寧波新芝JY92-Ⅱ超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，超聲10 s，間隔4 s，功率500 W，分別超聲100次，200次，300次，400次。

1.2引物設(shè)計及合成

引物序列來源于NIST網(wǎng)站(http://www.cstl.nist.gov/div831/strbase/)，由Invitrogen公司合成。引物序列等詳情見表1，表2。

表1　引物序列及熒光標(biāo)記

表2　擴(kuò)增子長度及引物濃度

1.3PCR擴(kuò)增體系及熱循環(huán)參數(shù)

本體系使用QIAGEN-Multiplex試劑盒進(jìn)行復(fù)合擴(kuò)增。擴(kuò)增體積10 μL，擴(kuò)增使用東勝EDC-810基因擴(kuò)增儀。DNA模版1 ng，混合引物(表2)2 μL，2x Master Mix 5 μL，PCR擴(kuò)增水補齊至10 μL。復(fù)合擴(kuò)增參數(shù):95℃預(yù)變性15 min: 30次循環(huán)(94℃30 s，60℃90 s，72℃60 s);60℃延伸30 min，4℃保存。

PowerPlex Y23擴(kuò)增條件為，擴(kuò)增體積10 μL，擴(kuò)增使用東勝EDC-810基因擴(kuò)增儀。DNA模版1 ng，5x Master Mix 2 μL，10x Primer Pair Mix 1 μL，PCR擴(kuò)增水補齊至10 μL。復(fù)合擴(kuò)增參數(shù): 96℃預(yù)變形2 min，30次循環(huán)(94℃10 s，61℃1 min，70℃30 s)，60℃延伸20 min，4℃保存。

1.4毛細(xì)管電泳分型

本體系PCR產(chǎn)物利用ABI3130遺傳分析儀檢測分析。本體系PCR產(chǎn)物1 μL，AGCU-SIZ500內(nèi)標(biāo)0.15 μL，Hi-Di formamide 8.85 μL，混勻編號，95℃變性后放入自動進(jìn)樣盤。電進(jìn)樣15 KV、5 s，電泳28 min。Data Collection軟件收集數(shù)據(jù)，GeneMapper-ID V3.2軟件進(jìn)行分型。Y23試劑盒PCR產(chǎn)物按照說明書使用ABI3130進(jìn)行操作，GeneMapperID V3.2軟件進(jìn)行分型。

2　結(jié)果

2.1一致性分析

本實驗中12份人血DNA，2 800 M標(biāo)準(zhǔn)DNA 的STR分型結(jié)果和Y23試劑盒相同，本體系2 800 M標(biāo)準(zhǔn)DNA分型圖見圖1。

圖1　本體系2 800 M標(biāo)準(zhǔn)DNA分型結(jié)果

2.2低模版DNA分型結(jié)果

對不同濃度的2 800 M DNA進(jìn)行STR分型，Y23試劑盒最低可對模版量為50 pg的DNA成功分型;本體系最低可對模版量為50 pg的DNA成功分型，平均峰高比Y23試劑盒結(jié)果更高。出峰數(shù)、平均峰高等詳見表3。

表3　低模版DNA分型結(jié)果

2.3降解檢材分型結(jié)果

對超聲降解樣本進(jìn)行STR分型，Y23試劑盒在超聲100次及200次成功分型，超聲300次及400次的樣本時出現(xiàn)大片段等位基因丟失現(xiàn)象;本體系僅在一個樣本400次超聲降解DNA的DYS439出現(xiàn)等位基因丟失，其余都能成功分型，平均峰高比Y23試劑盒更高，出峰數(shù)、峰高等詳見表4，分型圖見圖2、圖3。

表4　超聲降解檢材分型結(jié)果

圖2　Y23-300次超聲分型結(jié)果

圖3　本體系-400次超聲分型結(jié)果

3　討論

mini-STR技術(shù)即設(shè)計引物時，使其盡可能結(jié)合在更靠近核心重復(fù)序列的側(cè)翼序列，使PCR擴(kuò)增產(chǎn)物盡可能縮短，對降解的DNA小片段分型成功率相對更高［7］。如果miniSTR基因座是商品化試劑盒中的STR基因座，這些miniSTR基因座具有一個很明顯的優(yōu)勢:數(shù)據(jù)庫兼容性。在法醫(yī)現(xiàn)場工作中收集到的降解DNA樣品，用miniSTR技術(shù)進(jìn)行DNA分型，結(jié)果可以與用商品化STR試劑盒做出的犯罪嫌疑人結(jié)果進(jìn)行比較，從而認(rèn)定罪犯。本研究著重于Y-STR位點，和常染色體STR位點相比，Y-STR位于Y染色體特異區(qū)，呈穩(wěn)定的父系遺傳，除突變外，父親的Y-STR特征將毫無變化地傳給兒子，使其在混合斑鑒定、父系親屬間親權(quán)鑒定和群體遺傳學(xué)中有重要作用。單獨檢測Y-STR，即可獲得混合斑中的男性成分的信息;利用Y染色體呈整體單倍型父子遺傳的特性進(jìn)行父子之間的親權(quán)鑒定，可大大提高親權(quán)指數(shù);由于Y染色體的特殊性，Y-STR多態(tài)分布具有顯著的人群、地域分布特征，不同種族、民族和不同地域甚至不同家族的Y-STR具有明顯差異性。通過對這種差異的分析，可直接反映出人群或種族父系歷史，可提示嫌疑人的群體來源背景。這種差異還有望用于涉及法律的移民問題和親緣關(guān)系的鑒定，以及不同種族、民族、不同區(qū)域人群的鑒定。

在本研究中，同一樣本本體系分型結(jié)果和商業(yè)化試劑盒Y23［8］STR分型結(jié)果相同，擴(kuò)增子長度符合理論計算，無非特異性擴(kuò)增，說明本體系引物設(shè)計正確;對低模版檢材進(jìn)行分型時，Y23試劑盒可對模版量最低為50 pg的樣本成功分型，本體系可對模版量最低為50 pg的樣本成功分型，說明本體系反應(yīng)條件優(yōu)化良好，對DNA模版量要求不高，有利于實際檢案的使用;對高降解檢材進(jìn)行分型時，Y23試劑盒在300次超聲及以上的DNA樣本無法成功分型，而本體系能對300次超聲的樣本成功分型，400次超聲的樣本僅在一個樣本中丟失一個位點，本體系對降解檢材的STR分型能力高于Y23試劑盒，在實際檢案面臨降解DNA時，本體系可作為對Y23試劑盒的補充，對Y23試劑盒不能成功分型的4個大片段STR位點進(jìn)行分型。目前商業(yè)化的miniSTR試劑盒有中德美聯(lián)AGCU + mini，Applied Biosystems AmpFlSTRminifiler。AGCU mini試劑盒包括Amelogenin，D19S253、Penta D、Penta E、D2S1338、D19S433、CSF1PO、D12S391、D6S1043等9個位點，AmpFlSTRminifiler包括Amelogenin、D13S317、D7S820、D2S1338、D21S11、D16S539、D18S51、CSF1PO、FGA。這兩個試劑盒都沒有包含Y-miniSTR位點。有研究認(rèn)為，AGCU mini和Mini-FIler在10 μL體系中能對40 pg以上的模版成功分型［9-10］，本研究中的Y-miniSTR體系可對模板量50 pg以上的樣本成功分型。法醫(yī)學(xué)者對常染色體和X染色體上的miniSTR進(jìn)行了大量研究，Israr等［11］進(jìn)行了12個X-miniSTR的研究，Wang等［12］進(jìn)行了常染色體STR的研究。Y-miniSTR的研究較少，位點集中在商業(yè)化試劑盒中未出現(xiàn)的位點，不具有數(shù)據(jù)庫兼容性，位點等位基因數(shù)少，多態(tài)信息量一般。本文中選取的位點是商業(yè)試劑盒中的位點，有良好的數(shù)據(jù)庫兼容性，位點等位基因數(shù)較多，多態(tài)信息量更好，研究者們進(jìn)行了大量群體遺傳學(xué)調(diào)查，在YHRD(Y Chromosome Haplotype Reference Database，www.yhrd.org)數(shù)據(jù)庫中有著大量Y23的群體遺傳學(xué)數(shù)據(jù)。

本文建立了新型的4個熒光標(biāo)記Y-miniSTR復(fù)合擴(kuò)增體系，4個位點為DYS456，DYS392，DYS439，Y-GATA-H4，都是存在于Y23試劑盒中的位點，擴(kuò)增產(chǎn)物在81～44 bp之間，并對其法醫(yī)學(xué)應(yīng)用進(jìn)行初步研究。通過和商業(yè)化試劑盒Y23同一樣本分型結(jié)果的對比，顯示分型結(jié)果一致;利用超聲降解制備降解DNA，在300次超聲及以上的降解DNA分型時，本體系和Y23試劑盒相比有著更好的分型成功率;在低模版DNA的STR分型時，本體系和Y23試劑盒檢測靈敏度一致。僅4個位點的復(fù)合體系還不足以進(jìn)行個人識別和親子鑒定，在以后的研究中，將增加位點數(shù)，使本體系能夠進(jìn)行個人識別和親子鑒定。本體系尚未建立MATRIX文件，綠色熒光對藍(lán)色和黃色熒光的影響較大，在后續(xù)研究中將建立MARIX文件，優(yōu)化反應(yīng)條件，提高檢測靈敏度、穩(wěn)定性和平衡性;并對本系統(tǒng)的多態(tài)性、各種法醫(yī)學(xué)參數(shù)、各種不同檢材的適用性進(jìn)行深入的研究。

參考文獻(xiàn)

［1］Ambers A，Gill-King H，Dirkmaat D，et al.Autosomal and Y-STR analysis of degraded DNA from the 120-year-old skeletal remains of Ezekiel Harper［J］，F(xiàn)orensic Sci Int Genet，2014，9:33-41.

［2］Barra GB，Santa Rita TH，Chianca CF，et al.Fetal male lineage determination by analysis of Y-chromosome STR haplotype in maternal plasma［J］.Forensic Sci Int Genet，2014，pii: S1872-4973 (14)00246-4.

［3］Purps J，Siegert S，Willuweit S，et al.A global analysis of Y-chromosomal haplotype diversity for 23 STR loci［J］.Forensic Sci Int Genet，2014，12:12-23.

［4］Alaeddini R，Walsh SJ，Abbas A.Forensic implications of genetic analyses from degraded DNA—a review［J］.Forensic Sci Int Genet，2010，4(3):148-157.

［5］Butler JM，Shen Y，McCord BR.The development of reduced size STR amplicons as tools for analysis of degraded DNA［J］.J Forensic Sci，2003，48(5):1054-1064.

［6］Coble MD.Capillary electrophoresis of miniSTR markers to genotype highly degraded DNA samples［J］.Methods Mol Biol，2012，830:31-42.

［7］Odriozola A，Aznar JM，Celorrio D，et al.Recent advances and considerations for the future in forensic analysis of degraded DNA by autosomic miniSTR multiplex genotyping［J］.Recent Pat DNA Gene Seq，2011，5(2):110-116.

［8］Davis C，Ge J，Sprecher C，et al.Prototype PowerPlex?Y23 System: A concordance study［J］.Forensic Sci Int Genet，2013，7 (1):204-208.

［9］蘇艷佳，吳微微，郝宏蕾，等.AGCU Mini系統(tǒng)在法醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用［J］.中國法醫(yī)學(xué)雜志，2012，27(3):219-221.

［10］唐建平，吳丹，張晨，等.MiniFiler試劑盒運用于法醫(yī)微量物證的檢驗［J］.法醫(yī)學(xué)雜志，2007，23(4):304-306.

［11］Israr M，Shahid AA，Rahman Z，et al.Development and characterization of a new 12-plex ChrX miniSTR system［J］.Int J Legal Med，2014，128(4):595-598.

［12］Wang HD，Ruan JG，Shen CM，et al.Polymorphic distribution and forensic effectiveness study of eight miniSTR in Chinese Uyghur ethnic group［J］.Mol Biol Rep，2014，41(4):2371-2375.

網(wǎng)絡(luò)出版時間: 2015-3-5 12∶47網(wǎng)絡(luò)出版地址: http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20150305.1247.002.html

Development of a new quadruplex ChrY miniSTR system

WANG Hui1，BAI Xiao-gang1，XIA Yu1，LI Qing-qing1，HE Wang2，LIANG Wei-bo2

(1.Institute of Forensic Science，Chengdu Public Security Bureau，Chengdu 610081;2.Department of Forensic Biology，West China School of Preclinical and Forensic Medicine，Sichuan University，Chengdu 610041，Sichuan，China)

【Abstract】Objective: A quadruplex of primers aimed at 4 Y-chromosomal short tandem repeat(Y-STR)loci(DYS456，DYS392，DYS439，Y-GATA-H4)was built.The length of 4 amplicons was all shorter than 150bp which was called miniSTR.An examination was carried out for sensitivity，DNA database compatibility and degraded DNA typing ability of the quardplex.Methods: 4 primers of Y-STR(DYS456，DYS392，DYS439，Y-GATA-H4)were specially selected for short amplicons.The front primer of DYS456，DYS392，DYS439，Y-GATA-H4 was labeled with FAM，JOE，ROX，TAMRA separately.DNA samples were collected from forensic cases.And degraded samples were made by ultrasonic impact treatment.Ladder of the quadruplex was amplified from dilution of Y23 Ladder with the quadruplex primers.The quadruplex was compared to promega Y23 for sensitivity，DNA database compatibility and highly degraded DNA typing ability.Results: Sensitivity of the quardplex was the same as Y23 in both common samples and highly degraded samples.As a result of test on degraded DNA samples using the quadruplex systems，the systems proved to be an more effective tools for analyzing degraded DNAs than Y23.And there were no differences in DNA typing results which means great DNA database compatibility.Conclusion: The quadruplex of Y-miniSTR in addition to the commercial available Y-STR multiplex kits are highly useful for forensic practices of degraded DNA samples.

【Key words】Forensic Genetics; Multiplex kits; MiniSTR; Ychromosome; Degraded DNA; Low temple DNA

通訊作者:梁偉波，E-mail: liangweibo@scu.edu.cn

作者簡介:王惠(1968-)，女，四川古藺人，副主任法醫(yī)師，主要從事法醫(yī)物證學(xué)研究。

基金項目:國家自然科學(xué)基金項目(81471827，81202387);四川省公安廳重點攻關(guān)及應(yīng)用創(chuàng)新項目(201303)

收稿日期:2014-11-14

doi:10.3969/j.issn.1005-3697.2015.01.02

【文章編號】1005-3697(2015)01-0006-05

【中圖分類號】D919

【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A