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硅藻COX-Ⅰ區(qū)種屬特異性PCR用于法醫(yī)學溺死診斷

鄧建強1，劉寶琴2，龍仁1，梁安文1，李文慧1，蔡繼峰3

(1.海南醫(yī)學院法醫(yī)鑒定中心;2.海南醫(yī)學院附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學中心，海南海口570102;3.中南大學湘雅醫(yī)學院法醫(yī)學系，湖南長沙410078)

【摘要】目的:對KEint2F和KEintR這一對COX-Ⅰ區(qū)特異性PCR引物應用于法醫(yī)學溺死診斷的有效性進行研究。方法:取12例溺死尸體和5例非水中尸體的肺、肝組織，以及取落水區(qū)域水樣及雙蒸水，通過硝酸消化鏡檢法(鏡檢法)和種屬特異性PCR檢驗法(PCR法)兩種方法進行硅藻檢驗，對其硅藻的檢出率進行對比。結果: PCR法比鏡檢法具有更高的硅藻檢出率。結論: KEint2F和KEintR可作為法醫(yī)學硅藻檢驗的特異性PCR引物用于法醫(yī)學溺死的診斷。

【關鍵詞】法醫(yī)病理學;溺水; COX-Ⅰ;聚合酶鏈反應;硝酸消化法;硅藻

在法醫(yī)學實踐中，判斷水中尸體是否為生前溺水死亡對案件的定性至關重要，但水中尸體發(fā)現(xiàn)時往往已經(jīng)高度腐敗，很多情況下，尸體現(xiàn)象、損傷的判斷往往難以準確進行，硅藻作為在大自然界水域中廣泛存在的單細胞生物，生前溺死的情況下往往隨著溺液進入人體并迅速分散到全身多個器官，并且由于其特殊結構而不受尸體腐敗的影響，即使尸體高度腐敗也能檢出，因而目前已經(jīng)成為法醫(yī)學溺死診斷的重要手段。目前廣泛采用的硅藻檢驗方法為經(jīng)過酸消化后離心、涂片觀察，其過程繁瑣、耗時、檢材需要量多、易于污染，且試驗中用到的試劑如硝酸具有高度腐蝕性因而具有安全隱患［1］，因此，近年藻類學科研究有使用PCR技術進行硅藻檢驗的報道，為法醫(yī)學硅藻通過分子生物學技術進行檢驗帶來了曙光［2］。本文在對國內(nèi)外相關硅藻大量研究文獻進行對比后，選擇其中被認為對硅藻檢驗種屬性較高COX-Ⅰ區(qū)的一對引物KEint2F和KEintR［3］，探討其應用于法醫(yī)學溺死硅藻檢驗的價值。

1　材料與方法

1.1實驗材料

12例水中尸體的肝、肺組織及落水區(qū)水樣;同時提取非水中尸體肝、肺組織5例。17例標本均來自海南醫(yī)學院法醫(yī)鑒定中心檢驗樣本，且按照規(guī)范程序提取器官組織和水樣，避免水質(zhì)污染。

1.2器官組織硅藻檢驗

各器官組織均分別采用以下兩種方法進行硅藻檢驗。

1.2.1硅藻硝酸消化鏡檢法(鏡檢法)取送檢的肺、肝邊緣組織各20 g，放入1 000 mL燒杯里剪碎，加入濃硝酸50 mL，加熱消化，過夜。以離心半徑10 cm，4 000 r/min，離心15 min，棄上清，加入蒸餾水，再重復前述離心步驟1次，棄上清，將沉淀液滴在載玻片上，烘干、樹脂封固鏡檢。取送檢現(xiàn)場水樣標本15 mL用上述同樣方法離心、鏡檢，以鏡下檢出硅藻為陽性。

1.2.2種屬特異性PCR檢驗法(PCR法)DNA提取:取落水區(qū)水樣60 mL，12 000 rpm離心10 min，留取管底2 mL待檢;肝、肺組織樣本各取1 g，剪碎備檢;同時取雙蒸水2 mL作為對照。使用Mo-Bio PowerSoilTMDNA Isolation強力土壤DNA提取試劑盒(深圳市安必勝科技有限公司)，按照試劑盒推薦步驟提取DNA，提取的DNA分別通過比色法進行純度測定、紫外光譜分析法進行定量，并通過2％瓊脂糖凝膠電泳分離后用Goldview顯色，紫外燈下攝像。

PCR擴增及及產(chǎn)物檢測:引物采用Katharine M.Evans等報道的序列，由北京諾賽基因有限公司合成，序列為: KEint2F: GAAGCWGGWGTWGGTACWGGWTG; KEintR: CAAATAAAATTRATWGCWCCTAA。

PCR反應總體積為10 μL，內(nèi)含0.2 mmol/L dNTPs，3 mmol /L MgCl2，兩條引物濃度均為10 μmol /L，0.1 U/μL Taq DNA聚合酶，10×PCR buffer，模板DNA 1 μL。PCR熱循環(huán)參數(shù): 94℃10 min;94℃30 s，53℃30 s，72℃45 s，共36個循環(huán);最后72℃延伸15 min。

擴增產(chǎn)物用2％瓊脂糖凝膠電泳分離后用Goldview顯色，紫外燈下以觀察到擴增產(chǎn)物為陽性(即樣本含硅藻成分)，紫外燈下攝像。

1.3數(shù)據(jù)分析

對兩種方法對硅藻的檢出率進行比較，對其可靠性進行評價。

2　結果

2.1DNA的提取效果

水樣、肺組織、肝組織提取的DNA OD值(260/280)為1.8～2.0，說明該DNA提取方法所獲得的DNA純度較高。三類樣本提取的DNA量以水樣較少，評價約為42.2 ng/μL左右;肝、肺組織DNA提取量在溺死尸體和非溺死尸體間無明顯差異，但肝組織的DNA提取量大于肺組織，分別平均為48.4 ng/μL、34.6 ng/μL左右。三類樣品的瓊脂糖凝膠電泳，見圖1。

圖1　不同樣本提取總DNA瓊脂糖凝膠電泳結果

2.2硅藻特異性PCR擴增結果

水樣、溺死尸體肝、肺組織三類樣本提取的DNA均成功擴增出硅藻特異性PCR產(chǎn)物，片段大小約為600 bp，但三類樣本硅藻DNA擴增產(chǎn)物的量存在差異，總體上其檢出量從高到低依次為水樣、肺組織、肝組織(圖2)。

圖2　不同樣本PCR擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結果

2.3硝酸消化鏡檢法(鏡檢法)和種屬特異性PCR檢驗法(PCR法)硅藻的檢出率

在對非溺死尸體的肝、肺組織進行硅藻檢驗中，無論鏡檢法還是PCR法均未檢出硅藻成分，說明兩種方法在嚴格操作程序的情況下，可以避免假陽性;對于落水區(qū)水樣的硅藻檢驗，兩種方法均可成功檢出硅藻;對于溺死尸體的肝、肺組織，PCR法的檢出率高于鏡檢法;其結果比較，見表1。

表1　溺死尸體肝、肺組織兩種方法硅藻檢出率比較(％)

3　討論

據(jù)統(tǒng)計，每年全世界有14萬人溺死(death by drowning)［1］，而在我國，沿海、沿江地區(qū)溺死的案件也很多，僅以我校法醫(yī)鑒定中心每年鑒定的法醫(yī)病理學案例來看，水中尸體約占法醫(yī)尸體檢驗總數(shù)的三分之一。水中尸體由于意外落水或者自殺多見(即屬于溺水死亡)，但被害致死后拋尸入水偽造意外溺水身亡的案例亦不少見。因此，水中發(fā)現(xiàn)的尸體未必一定是溺水死亡，有可能與刑事案件相關，必須通過法醫(yī)學鑒定。正確鑒定和區(qū)分水中尸體是否屬溺水死亡是法醫(yī)病理學工作的重要任務之一。

在法醫(yī)學的實際工作中，對于新鮮的水中發(fā)現(xiàn)的尸體，可通過體表改變、內(nèi)部器官征象、組織病理學檢驗以及左右心腔內(nèi)血液成份的不同等進行溺死鑒定。但大部分情況下，水中尸體發(fā)現(xiàn)時往往已高度腐敗，甚至白骨化，體表的損傷或者尸體征象已失去檢驗條件，法醫(yī)學最常用的憑借尸體表面損傷、溺死征象鑒定死亡性質(zhì)往往已不可能，因此其死因診斷是國際法醫(yī)學界公認的難題。因此，能否確定死者是否系生前溺水死亡也往往成為最關鍵、甚至唯一的案件定性希望，事關案件的處理程序［4-5］。

生前溺死往往伴隨水或其他液體經(jīng)呼吸道進入體內(nèi)及吸收入血的過程，而在大自然的河流、湖泊、大海等水樣中存在的大量浮游生物也會隨溺水過程而被吸入肺，并入血散播于全身多個器官(如肺、肝、腎等)，硅藻即是這些浮游生物的一種，其在大自然水系中廣泛存在，且其細胞壁含無結晶的不易被破壞的含水桂酸鹽(Si02、H20)，能夠對外界環(huán)境變化具有較強的抵抗力，進入人體內(nèi)的硅藻也較少受到腐敗等因素的影響，因此硅藻檢測成為診斷溺死的重要輔助手段之一。

硅藻的檢測方法有很多，主要包括:光學顯微鏡法，掃描電鏡法，原子力顯微鏡法。目前國內(nèi)外法醫(yī)學實驗室普遍采用的是通過光學顯微鏡檢測臟器組織內(nèi)的硅藻。這種方法的缺點主要表現(xiàn)在: (1)過程繁瑣，耗時，檢測勞動強度大; (2)檢驗中用到硝酸等具有強烈腐蝕性的化學試劑，存在操作安全隱患; (3)很多微型硅藻容易被漏檢或受放大倍數(shù)限制無法根據(jù)硅藻表面紋飾鑒別其種屬。盡管現(xiàn)有的硅藻檢驗在方法和標準上都已具有規(guī)范化標準，硅藻的檢出率也獲得了不斷的提高，特別是近年來出現(xiàn)的微波消解-掃描電鏡檢驗硅藻的發(fā)現(xiàn)，對于硅藻檢驗是一個革新，有效減少了硅藻損失，提高了硅藻檢出率，被認為是溺死診斷最有效的方法之一。但是這些檢驗方法還是依賴人的觀察和計數(shù)，存在一定的誤差，且存在工作量大的問題［6-14］。

近年來分子生物學的飛速發(fā)展為檢測臟器內(nèi)硅藻等浮游生物檢驗提供了新的思路，基于相關學科對單細胞-特別是藻類相關基因特征研究的不斷深入，使得通過基因水平的檢測對硅藻進行檢驗成為可能，國內(nèi)外在這方面開始有研究不斷被報道，顯示了通過分子水平的基因檢測進行硅藻檢驗的顯著優(yōu)勢，即高檢出率、低勞動強度及高靈敏度［7-15］。但就目前的研究來看，所有已報道的單一特異性PCR引物能夠達到對所有硅藻的成功檢出，由于不同水域硅藻種類的差異，往往需要不同的特異性PCR引物組合，才有可能達到對該水域硅藻的有效、可靠檢出，因此，探索不同的適合法醫(yī)學溺死檢驗需要的硅藻特異性PCR引物，建立法醫(yī)硅藻檢驗特異性PCR引物庫勢在必行，也是在一段時間內(nèi)急需的研究工作。

本文在查詢、對比海量國內(nèi)外硅藻分子生物學研究報道的基礎上，首次將在硅藻分類領域近年被認為具有高效特異性的硅藻PCR特異性引物—KEint2F和KEintR引物引入法醫(yī)學溺死檢驗［3］，對其檢出率進行研究，證實其同樣可以應用于法醫(yī)學溺水尸體組織器官的硅藻檢驗，相對傳統(tǒng)鏡檢法具有更高的檢出率，說明該對引物可以作為法醫(yī)硅藻檢驗的特異性引物。

在本研究中硅藻DNA的提取使用商業(yè)化的MoBio強力土壤DNA提取試劑盒，成功且高效的提取到了硅藻基因組DNA，且DNA純度高，可直接用于下游實驗。在對不同組織的總DNA提取中，三種樣本中肝組織提取的DNA濃度最高，但其硅藻特異性PCR產(chǎn)物卻最少，產(chǎn)生這一奇怪現(xiàn)象的原因在于提取的總DNA既包含了硅藻DNA，也同時包含了肝臟組織的DNA，屬于一種混合物，而特異性PCR則只能特異性地選擇硅藻DNA進行擴增，其產(chǎn)物量少說明其初始樣本中目標DNA，即硅藻DNA量較少，換句話說在三種不同類型的樣本中，肝組織中含有的硅藻成分最少，這也與已有的研究結果相符。這一現(xiàn)象也同時說明，在通過分子水平進行硅藻檢驗的實驗設計中，溺死器官組織提取到的總DNA的量并不能代表目標硅藻DNA的量，不能把總DNA量作為衡量硅藻DNA量的水平的一個指標。

總之，本研究結果的意義在于，可以通過KEint2F 和KEintR這對硅藻特異性引物來準確而高效地對水中尸體是否屬生前溺死做出鑒定，達到法醫(yī)學溺死檢驗的這一核心目標。但是，由于水域中的硅藻含有不同的種類，屬于混合物，通過這對引物尚難以對落水區(qū)域做出判斷和比較，就目前技術水平，尚缺乏簡單、有效的對含有大量不同類型硅藻的不同水域特征進行比對、鑒定的分子生物學方法，這也將是目前全世界范圍內(nèi)的研究難題，需要進一步的探索。

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網(wǎng)絡出版時間: 2015-3-5 12∶47網(wǎng)絡出版地址: http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20150305.1247.001.html

Drowning identified by primers specific PCR of COX-Ⅰdomain in diatom

DENG Jian-qiang1，LIU Bao-qin2，LONG Ren1，LIANG An-wen，LI Wen-hui1，CAI Ji-feng2

(1.Department of Forensic Medicine，Hainan Medical University，Haikou 570102，Hainan; 2.Center of Reproductive Medicine，Affiliated Hospital of Hainan Medical University，Haikou 570102，Hainan;3.Department of Forensic Medicine，Xiangya School of Medicine，Central South University，Changsha 410078，Hunan，China)

【Abstract】Objective: To develop and evaluate a method for identification of drowning death through detection of diatom COX-Ⅰgene by primers pair of KEint2F and KEintR.Methods: Tissues of livers and lungs of twelve drowning cases and five non-drowning cases，field water from each case and double distilled water were collected，tested and compared two methods: diatom nitric acid digestion method and species specific PCR method，respectively.Results: The detection rate of diatom by PCR method was much higher than diatom nitric acid digestion method.Conclusion: KEint2F and KEintR are suitable primer pairs of species specific PCR for diatom detection for drowning identification.

【Key words】Forensic pathology; Drowning; COX-Ⅰ; Polymerase chain reaction; Nitric acid digestion method; Diatoms

通訊作者:劉寶琴，E-mail: qinqin0508@126.com

作者簡介:鄧建強(1971-)，男，陜西千陽人，博士，主任法醫(yī)師，主要從事法醫(yī)DNA技術與法醫(yī)病理學研究。

基金項目:國家自然科學基金項目(81260465);海南醫(yī)學院科研培育基金(hy2012-012)

收稿日期:2014-11-12

doi:10.3969/j.issn.1005-3697.2015.01.01

【文章編號】1005-3697(2015)01-0002-04

【中圖分類號】D919

【文獻標志碼】A