曹焜，荊瑞勇，王光華，郭永霞

(1.中國科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所黑土區(qū)農(nóng)業(yè)生態(tài)重點實驗室，黑龍江哈爾濱150081; 2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，黑龍江大慶163319)

藍藻遺傳多樣性的分子生物學(xué)研究進展

曹焜1，2，荊瑞勇1，2，王光華1，郭永霞2

(1.中國科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所黑土區(qū)農(nóng)業(yè)生態(tài)重點實驗室，黑龍江哈爾濱150081; 2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，黑龍江大慶163319)

藍藻是一類能光合產(chǎn)氧的原核微生物，廣泛存在于海洋、湖泊、稻田、沙漠甚至各種極端環(huán)境中。研究藍藻的遺傳多樣性對了解物種進化和物種資源開發(fā)與利用等方面具有重要意義。文章綜述了海洋、湖泊和稻田中藍藻遺傳多樣性分子生物學(xué)研究進展，闡述了不同自然環(huán)境中都存在著獨特的藍藻類群及其藍藻的分布規(guī)律，討論了環(huán)境因子對藍藻遺傳多樣性的影響，并提出了環(huán)境中藍藻多樣性研究中的存在問題及未來研究趨勢。圖1，表1，參52。

藍藻多樣性;海洋;湖泊;稻田;分子生物學(xué)技術(shù)

0 引言

藍藻也稱藍細菌，因其含藻青蛋白而呈現(xiàn)藍綠色，也被稱為藍綠藻［1］。藍藻屬革蘭氏陰性、光合產(chǎn)氧原核微生物，藍藻細胞比一般細菌大，作為生物圈的初級生產(chǎn)者，大約27億年前出現(xiàn)在地球上［2-3］。全球藍藻生物量高達10億t［4］，是生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分［5］。藍藻在地球從無氧到有氧環(huán)境的轉(zhuǎn)變過程中起到重要作用［1］。

藍藻在進化過程中逐步分化成具有固氮作用的異形胞和抗逆性強的原垣孢子［2］，使其能夠在水生和陸生環(huán)境中廣泛存在，如海洋［6］、湖泊［7］、稻田［8］、沙漠［9］和極地［10］等。研究發(fā)現(xiàn)，不同生態(tài)系統(tǒng)中藍藻多樣性存在一定的差異，在同一生態(tài)系統(tǒng)中藍藻多樣性也會發(fā)生一定程度的時空變化［6-10］。研究藍藻多樣性常采用兩種方法，分別為形態(tài)特征的顯微觀察法和分子生物學(xué)方法。顯微觀察法對藍藻多樣性的研究相對粗略，有時，一些藍藻的鑒定仍需要結(jié)合分子生物學(xué)方法開展［11］。藍藻核糖體DNA以及一些功能基因已被廣泛用于不同環(huán)境中藍藻多樣性的研究，用于核糖體DNA以及一些功能基因PCR擴增的引物有很多，這些引物的擴增范圍和目的片段大小存在一定差異，見表1。近年來，采用分子生物學(xué)技術(shù)解析環(huán)境中藍藻遺傳多樣性已取得很多成果。為此，文章綜述了海洋、湖泊和稻田等環(huán)境中藍藻多樣性的研究進展，分析不同分子生物學(xué)方法的利弊，為促進藍藻分子生態(tài)學(xué)研究提供一些參考信息。

1 海洋環(huán)境中藍藻多樣性

海洋中的藍藻主要由原綠球藻(Prochlorococcus)和聚球藻(Synechococcus)組成。20世紀70和80年代末先后發(fā)現(xiàn)海洋中存在大量的聚球藻［12］和原綠球藻［13］，這兩類藍藻是海洋生態(tài)系統(tǒng)中重要的初級生產(chǎn)者［6］，其中原綠球藻被認為是地球上最多的光合產(chǎn)氧微生物［14］。兩類藍藻的生態(tài)功能、多樣性及時空分布等相關(guān)研究一直倍受科學(xué)界關(guān)注。

Moore等［15-16］和Partensky等［17］根據(jù)原綠球藻中葉綠素b與葉綠素a2的比值高低，將原綠球藻分成高含量型原綠球藻(High-B/A)和低含量型原綠球藻(Low-B/A)，在較強光照條件下，低含量型原綠球藻能生長，而高含量型原綠球藻則受到抑制［16］。West等［18］根據(jù)原綠球藻的16S rDNA序列和對光適應(yīng)能力，粗略的將原綠球藻分成弱光適應(yīng)型(Low-Light Adapted，LLA)和強光適應(yīng)型((High-Light Adapted，HLA)。LLA型與High-B/A型是同一類［19］，LLA型主要分布在深層海域，HLA分布在淺層海域，這一規(guī)律受到Huang等［20］的研究所證實。到目前為止，已發(fā)現(xiàn)海洋中原綠球藻HLA型和LLA型各有6個進化分枝，且HLA型和LLA型間可能存在過渡型，見圖1。原綠球藻的分布主要受到水體深度和緯度的影響，從全球范圍看主要分布在南緯48°和北緯45°之間［6］。

圖1 海洋中原綠球藻ITS區(qū)基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1Phylogenetic tree constructed with ITS sequences from Prochlorococcus in marine

海洋聚球藻遺傳多樣性較為復(fù)雜，Waterbury等［23］基于聚球藻的生境及G+C含量，將聚球藻分成6個分枝，隨后Fuller等［22］基于16S rDNA序列將海洋中的聚球藻分成10個進化簇(Clusters I-X)，其中，Cluster V的聚球藻遺傳多樣性很豐富［15］，且位于該簇內(nèi)的聚球藻表型較復(fù)雜。Rocap等［24］基于ITS區(qū)將分離純化且位于Cluster V中的25株聚球藻分成6個進化枝(Clades I-VI)，其中的三個進化枝與其表型相關(guān)，即Clade III與運動型聚球藻相關(guān)［25］，Clade I和III與顏色適應(yīng)型聚球藻相關(guān)［21］，Clade VI與缺乏藻尿膽素型聚球藻相關(guān)［24］。由于研究對象的范圍狹窄，致使對聚球藻的分析較片面。為了更好的揭示聚球藻的基因多樣性與其表型間的關(guān)系，學(xué)術(shù)界對Cluster V的內(nèi)部分類進行了深入的研究，將其重新界定為2個進化亞簇(subclusters 5.1和5.2)［26］。Huang等［20］于2012年在河口和沿海地區(qū)發(fā)現(xiàn)一些獨特的聚球藻菌群，它們主要分布在Cluster V中，進一步豐富了Cluster V中的亞簇分型，即3個進化亞簇(subclusters 5.1、5.2和5.3)，并將Cluster V中的聚球藻分為27個進化分枝(Clades I～XVI，CB1～CB5，5.3 -I～5.3-VI)。聚球藻分布范圍比原綠球藻廣，主要分布在60°S～50°N之間［27］。在環(huán)境影響因素中，溫度和光照對藍藻豐度的影響較大，赤道附近溫度高、光照強度大，抑制藍藻生長，降低藍藻豐度［27-28］，導(dǎo)致其分布呈向兩極移動的趨勢。

Flombaum等［27］利用海洋聚球藻和原綠球藻的分布情況建立了生態(tài)位模型。基于16S rDNA和ITS區(qū)分析海洋中藍藻的遺傳多樣性及藍藻進化地位，發(fā)現(xiàn)海洋藍藻可分成不同的進化分枝，這些進化分枝可以代表其對應(yīng)的生態(tài)單元。利用這些生態(tài)單元間藍藻分布與豐度等方面的差異來分析海洋藍藻與環(huán)境間的互作機制，為完善生態(tài)位模型奠定基礎(chǔ)。

海洋藍藻多樣性的研究不僅局限于原綠球藻和聚球藻，還有其它絲狀藍藻。Thacker等［29］采用引物CYA106F/CYA781Ra/b［30］發(fā)現(xiàn)熱帶海洋中存在林氏藻屬(Lyngbya)、束藻屬(Symploca)和一些未知的絲狀藍藻。Laamanen等［31］用引物16CITS/23CITS擴增部分間隔區(qū)序列(ITS1-S)，分析波羅的海中節(jié)球藻的多樣性，將其劃分為兩簇，即產(chǎn)節(jié)球藻素型和不產(chǎn)節(jié)球藻素型，見表1。以上研究表明在海洋生態(tài)系統(tǒng)中，除單細胞球狀藍藻外，還存在著人們關(guān)注度較少的絲狀藍藻。

表1 研究藍藻多樣性的PCR引物Tab.1Primer sets for study of cyanobacterial diversity

2 湖泊中藍藻多樣性

湖泊是陸地表面洼地積水形成的比較寬廣的水域。近年來，湖泊中藻類大量繁殖的一種自然生態(tài)現(xiàn)象(即“水華”)頻發(fā)，引起人們的重視。藍藻是引起“水華”的元兇之一，在不同湖泊中藍藻組成差異較大。如瑞士的蘇黎世湖(Lake Zurich)引起“水華”的主要藍藻有微囊藻(Microcystis)、魚腥藻(Ana-baena)和浮絲藻(Planktothrix)等［37］;加拿大的安大略湖(Lake Ontario)引起“水華”的主要藍藻有束絲藻(Aphanizomenon)、聚球藻(Synechococcus)和魚腥藻(Anabaena)等［38］;希臘的卡斯托里亞湖(Lakes Kastoria)引起“水華”的主要藍藻有微囊藻(Microcystis)、魚腥藻(Anabaena)、束絲藻(Aphanizomenon)和柱胞藻(Cylindrospermopsis)等［39］?？梢娨稹八A”現(xiàn)象中常見的絲狀藍藻是魚腥藻，球狀藍藻是微囊藻［37-39］，且它們呈現(xiàn)出時間上的規(guī)律變化［32，34］。Cai等［32］用引物CYA359F/CYA781Ra/b對巢湖“水華”中藍藻DNA進行PCR擴增，克隆測序發(fā)現(xiàn)魚腥藻和微囊藻是優(yōu)勢菌群，且隨溫度變化發(fā)生菌群的演替，7月-8月時，微囊藻是優(yōu)勢菌群;而3月、4月、5月和12月時，魚腥藻是優(yōu)勢菌群。Liu等［34］用引物ana-its/ULR對太湖浮游性魚腥藻(Dolichospermum)DNA進行PCR擴增并進行了序列測定，發(fā)現(xiàn)浮游魚腥藻的L型和W型是其優(yōu)勢基因型，W型浮游性魚腥藻在4月-9月豐度較大，且隨溫度發(fā)生從W型到L型的演替。微囊藻素合成酶基因(mcy)是功能基因，可用于分析產(chǎn)毒藍藻(微囊藻、浮絲藻和魚腥藻)的多樣性，該基因分為10個基因型(mcyA-mcyJ)，其中mcyA、mcyD、mcyG和mcyJ是關(guān)鍵基因型［40］。Rinta-Kanto等［36］用引物mcyA-Cd 1R/mcyA-Cd 1F對伊利湖(Lake Erie)中藍藻DNA進行PCR擴增，克隆測序發(fā)現(xiàn)微囊藻和浮絲藻具有空間上的分布差異，并發(fā)現(xiàn)一些新的產(chǎn)毒藍藻。

湖泊中藍藻除魚腥藻和微囊藻外，還有一些具有地域特色的藍藻類群。Taton等［10］用變性梯度凝膠電泳(DGGE)和克隆測序技術(shù)解析了南極的弗里克塞爾湖(Lake Fryxell)中藍藻遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)念珠藻(Nostoc)、節(jié)球藻(Nodularia)、顫藻(Oscillatoria)和席藻(Phormidium)是優(yōu)勢藍藻菌群，其中頂突顫藻(Oscillatoria cf.subproboscidea)是該地區(qū)特有的藍藻;Dorador等［41］用PCR-DGGE和克隆測序技術(shù)研究智利高原上的鹽湖(Salar de Huasco)中藍藻遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)顫藻目(Oscillatoriales)、念珠藻目(Nostocales)和色球藻目(Chroococcales)是優(yōu)勢菌群;Rastogi等［42］用直接測序法研究印度王舍城(Rajgir)的溫泉中藍藻遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)藍桿藻(Cyanothece)、念珠藻(Nostoc)、偽枝藻(Scytonema)和膠須藻(Rivularia)是優(yōu)勢菌群。以上研究表明，在不同湖泊環(huán)境中都存在特有的藍藻類群，但總體來說湖泊中藍藻的優(yōu)勢菌群為絲狀藍藻，球狀藍藻相對較少［43］。

3 稻田中藍藻多樣性

藍藻是稻田生態(tài)系統(tǒng)中一類重要的微生物類群［33］，主要以絲狀多細胞態(tài)藍藻為主［8］，如念珠藻屬(Nostoc)和魚腥藻屬(Anabaena)約占稻田藍藻菌群的80%［44］。1939年De［45］報道了固氮藍藻在印度水稻田中繁殖并提供氮肥，在不施肥的情況下，能保證水稻連年保持較高的產(chǎn)量，稻谷增產(chǎn)10%～30%［46］，稻田藍藻的固氮作用受到人們的廣泛重視。研究發(fā)現(xiàn)念珠藻屬、筒孢藻屬(Cylindrospermum)等［47］藍藻具有固氮作用，是潛在的生物氮肥生產(chǎn)者。但藍藻過量繁殖，尤其是在泡田后30天之內(nèi)，會影響稻苗的生長，在一定程度上也會引起減產(chǎn)［48］。

在稻田生態(tài)系統(tǒng)中，藍藻種類受到很多因素的影響，如土壤理化性質(zhì)、水分、光照強度、化肥施用狀況及農(nóng)藥等。當土壤pH為中性至弱堿性［48］、稻田處于漬水條件下及光照強度弱時［33］，藍藻多樣性較豐富;反之藍藻多樣性會降低。肥料對藍藻的影響較復(fù)雜，在施肥與否的條件下，念珠藻和魚腥藻都是優(yōu)勢菌群;當施用肥料時，降低具有固氮作用的異形胞生長速率［49］。Kumari等［50］按照10 kg·hm-2～30 kg·hm-2量施用農(nóng)藥丁草胺時，發(fā)現(xiàn)低濃度時提高了藍藻多樣性，而高濃度處理降低了藍藻多樣性。

對稻田中藍藻多樣性的研究主要分兩部分，即稻田水體和稻田土壤。針對稻田水體中細菌群落結(jié)構(gòu)研究報道很多，但對藍藻及其多樣性進行調(diào)查還鮮有報道［51］。稻田土壤中藍藻多樣性的研究主要集中在中國福建省、日本及印度等水稻主產(chǎn)區(qū)。2005年Song等［33］用CYA359F/16S-1051R、CYA359F/CYA781R兩對引物對中國福建省稻田土壤中藍藻DNA進行半巢式PCR擴增，用DGGE技術(shù)檢測，發(fā)現(xiàn)在9月時藍藻多樣性達到峰值，且水稻生長季時土壤中藍藻多樣性高于水稻收獲后的時期。2008年Asari等［8］用引物CYA106F-GC/CYA781R(a)對日本稻田秸稈上藍藻菌群進行研究，發(fā)現(xiàn)測得的DGGE條帶序列歸分為5個進化分枝，絲狀藍藻主要分布在III和IV進化枝上。由于CYA781R(a)是絲狀藍藻的特異性引物，該研究未發(fā)現(xiàn)秸稈上存在球狀藍藻，進而可能降低了對藍藻多樣性的評估。最近，Wang等［52］對吉林大安堿地稻田單細胞藍藻16S-23S間ITS基因克隆測序分析發(fā)現(xiàn)，有50%左右的克隆與已知序列相似度介于50%～76%之間，并總結(jié)認為稻田中存在7個獨特單細胞藍藻類群，表明稻田中生存著一些迄今為止未知的單細胞藍藻微生物。

4 展望

利用藍藻的核糖體DNA以及一些功能基因等序列進行藍藻遺傳多樣性研究并取得了一定的進展。通過對比發(fā)現(xiàn):16S rDNA是一段耐受環(huán)境脅迫的保守序列，一般可鑒定到屬以上的分類單位;ITS區(qū)雖然存在保守性，與16S rDNA相比受環(huán)境脅迫影響相對較大，它能積累比16S rDNA更多的突變位點，可用于亞屬或種水平的鑒定;現(xiàn)有的23S rDNA數(shù)據(jù)庫較小，僅能鑒定到門或科［35］，只能用于傳統(tǒng)方法的補充說明;功能基因適用范圍較廣，不適合單獨用于藍藻多樣性的研究，可作為16S rDNA的補充信息或?qū)μ囟ㄋ{藻類群的分析，為精確的進行種屬鑒定作補充說明。

大量研究發(fā)現(xiàn)，不同生態(tài)系統(tǒng)中藍藻多樣性存在較大差異，各自都有特有的類群，這表明藍藻的分布與其所處的環(huán)境有一定的關(guān)系。上述研究均是基于從環(huán)境DNA(eDNA)中擴增出不同藍藻的基因來進行解析，但到目前為止，采用一些已報道的藍藻引物，都會擴增出一些非藍藻序列，所以完全依賴于分子生物學(xué)技術(shù)研究環(huán)境中的藍藻可能會高估其多樣性。故此，應(yīng)將傳統(tǒng)的分離純化、形態(tài)觀察和分子生物學(xué)的方法進行有效結(jié)合，才能更有效地解析環(huán)境中藍藻群落結(jié)構(gòu)組成。

海洋是一個復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)，面積大、分布廣、受多種因素影響，其中藍藻的分布問題更為復(fù)雜。盡管Flombaum等［27］已經(jīng)收集了近年來的一些聚球藻和原綠球藻的分布數(shù)據(jù)及相關(guān)的環(huán)境變量，建立了藍藻的生態(tài)位模型?？墒墙鼛资陙?，全球氣候變化日趨復(fù)雜，海洋中微生物的分布規(guī)律日漸模糊。因此，需要在不同地點進行長期定位試驗，綜合各點試驗數(shù)據(jù)，才能建立出海洋中微生物的生態(tài)位模型，為日后進一步預(yù)測海洋環(huán)境變化和研究生物地球化學(xué)循環(huán)奠定基礎(chǔ)。對湖泊生態(tài)系統(tǒng)中藍藻多樣性的研究較為深入，認為“水華”是藍藻及其相關(guān)微生物共同作用的結(jié)果。在湖泊中一些新的藍藻種屬不斷被發(fā)現(xiàn)，藍藻及其伴生細菌間相互作用關(guān)系仍未明確。因此，需將研究重點放在藍藻菌株分離純化及其生理特性等方面的研究上;在全球變暖的背景下，調(diào)查藍藻多樣性對各種溫室氣體疊加效應(yīng)的響應(yīng)機理。在稻田生態(tài)系統(tǒng)中一些有固氮作用的藍藻菌株不斷被發(fā)現(xiàn)，但是它的生理特性及其與周圍環(huán)境間的相互作用機理尚不明晰。因此，需將研究重點放在固氮藍藻的分離純化及其生理特性等方面的研究上，為將來開發(fā)生物氮肥奠定基礎(chǔ)。

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Molecular Biological Research Progress in Genetic Diversity of Cyanobacteria

CAO Kun1，2，JING Rui-yong1，2，WANG Guang-hua1，GUO Yong-xia2
(1.Key Laboratory of Mollisols Agroecology，Northeast Institute of Geography and Agroecology，CAS，Harbin 150081，China; 2.Heilongjiang BaYi Agricultural University，Daqing 163319，China)

Cyanobacteria are a kind of photosynthetic and oxygen-producing prokaryotic microorganisms which are widely spread in ocean，lake，paddy field，desert and even in some extremely adverse environments.Studying the genetic diversity of cyanobacteria is very important in understanding species evolution，exploitation and utilization of resources.In this paper，we reviewed the research progress on genetic diversity of cyanobacteria in marine，lake and paddy field based on molecular biological techniques.The distribution patterns of cyanobacteria and several unique cyanobacterial groups exist in different environments were summarized.Meanwhile，the effect of environmental factors on cyanobacterial diversity was discussed and several research problems and future research tendencies of cyanobacterial diversity study were proposed.

cyanobacterial diversity;marine;lake;paddy field;molecular biological technique

S182;Q-9

A

10.11689/j.issn.2095-2961.2015.04.007

2095-2961(2015)04-0183-07

2015-04-02;

2015-05-17.

國家自然科學(xué)基金(41271262，31300425);中國科學(xué)院"百人計劃"項目.

曹焜(1989-)，男，黑龍江鶴崗人，在讀碩士，研究方向為農(nóng)藥環(huán)境毒理.

王光華(1966-)，男，黑龍江海林人，博士，研究員，主要從事微生物生態(tài)研究.

郭永霞(1970-)，女，山東膠南人，博士，教授，主要從事植物保護教學(xué)及科研.