敖啟燕，胡玲玲，羅師紅，趙永超，王 振，劉若余

(貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院/貴州大學(xué)高原山地動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025)

不同毛色貴州水牛MC1R、TYR基因SNP研究

敖啟燕，胡玲玲，羅師紅，趙永超，王 振，劉若余

(貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院/貴州大學(xué)高原山地動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025)

[目的]為促進(jìn)貴州白水牛資源保護(hù)與開(kāi)發(fā)的科學(xué)性，同時(shí)為品種選育提供更加充分的科學(xué)依據(jù)。[方法]本實(shí)驗(yàn)以貴州水牛(灰色)為對(duì)照組，以貴州白水牛為實(shí)驗(yàn)組分別構(gòu)建DNA池，對(duì)不同毛色貴州水牛的MC1R基因和TYR基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增并確定SNP位點(diǎn)，并利用生物信息學(xué)軟件分析突變位點(diǎn)對(duì)RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)，蛋白質(zhì)的二、三級(jí)結(jié)構(gòu)的影響。[結(jié)果]在貴州水牛(灰色)和貴州白水牛擴(kuò)增的MC1R基因中共同篩選到錯(cuò)義突變exon1-T843C，導(dǎo)致纈氨酸(Val)變成丙氨酸(Ala)，還在貴州水牛(灰色)中篩選到exon1-C1228T(同義)、exon1-G1330A兩個(gè)突變位點(diǎn)。在兩種水牛擴(kuò)增的TYR基因共同篩選到2個(gè)錯(cuò)義突變exon1-G826A、exon5-T70C，分別導(dǎo)精氨酸(Arg)突變?yōu)榻M氨酸(His)、亮氨酸(Leu)突變?yōu)楫惲涟彼?Ile)；1個(gè)同義突變exon3-A83G。

貴州水牛;MC1R基因;TYR基因;SNPs

1 前言

水牛(Bubalus babulis)主要分布在亞洲地區(qū)，是熱帶、亞熱帶地區(qū)獨(dú)具特色的一個(gè)物種[1]。根據(jù)亞洲水牛的外形、用途和生活習(xí)性將其分為河流型(B.bubalus arnee)水牛和沼澤型(B.bubalus carabanesis)水牛兩種水牛類型[2]?！顿F州省畜禽品種志》中記載到貴州的水牛歸屬為沼澤型水牛，毛色大多數(shù)為灰色，占總數(shù)的73.19%，少部分為白色，占總數(shù)的5.7%[3]。羅在仁等通過(guò)統(tǒng)計(jì)研究表明，沼澤型水牛白色和灰色交配的F1代全部為白色，而F2代中白色和灰色的比例約為3∶1，白色對(duì)灰色完全顯性，灰色為隱性純合[4]。貴州白水牛主要分布在遵義市鳳岡縣，因毛色具有十分明顯的白色而出名，是貴州少有的品種。貴州白水牛肉用性能較好，潛力較大[5]。

哺乳動(dòng)物的毛發(fā)顏色主要是由黑色素的數(shù)量、性質(zhì)與分布決定的[6]。黑色素根據(jù)性質(zhì)不同可分為2種類型：一種是褐黑色素，另一種是真黑色素[7]。哺乳動(dòng)物黑色素合成的調(diào)控系統(tǒng)復(fù)雜，在黑素細(xì)胞的每一個(gè)發(fā)育水平都有不同的基因調(diào)控。黑色素皮質(zhì)素受體 1(melanocortin receptor1,MC1R)基因是一種調(diào)節(jié)黑素細(xì)胞合成褐黑色素與真黑色素的關(guān)鍵受體, 現(xiàn)有的資料證實(shí)MC1R對(duì)很多物種的色素沉著發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。MC1R基因是由Extension基因座編碼的，并在黑色素細(xì)胞中得到表達(dá)[6]。

Marklund L研究表明牛的MC1R基因位于第18號(hào)染色體，長(zhǎng)954 bp[8]。Shinyi等用 PCR- RFLP分析了日本黑牛、褐色牛和朝鮮牛M C1R基因型的頻率，結(jié)果顯示朝鮮牛的e/e 基因型頻率遠(yuǎn)大于褐色牛的e/e基因型頻率，但是這兩種牛的毛色卻十分的接近。所以他們推測(cè)牛毛色的紅色和褐色還有其他的基因決定。甘海云等對(duì)中國(guó)荷斯坦黑白花牛、中國(guó)荷斯坦紅白花牛、魯西黃牛與渤海黑牛的MC1R基因做了生物信息學(xué)分析，在所檢測(cè)的品種牛MC1R基因內(nèi)篩選到一個(gè)新的SNP位點(diǎn)，此位點(diǎn)對(duì)毛色遺傳的影響需要進(jìn)一步研究[9]。苗永旺等采用 DNA 序列分析技術(shù)對(duì)水牛MC1R基因多態(tài)性進(jìn)行了檢測(cè)，并且分析了其是否與毛色性狀遺傳相關(guān)聯(lián)，結(jié)果顯示白色和灰色沼澤型水牛的基因型皆為EBS/EBS，這表明 MC1R 基因與水牛的白色和灰色毛色性狀可能無(wú)關(guān)[10]。

酪氨酸酶(TYR)基因在黑色素的生物合成的調(diào)控中有著不可替代的作用，酪氨酸酶為黑色素合成的限速酶，具有多巴氧化酶和酪氨酸羥化酶活性，它的活性強(qiáng)弱決定黑色素的合成，高活性導(dǎo)致產(chǎn)生真黑色素[11]。研究發(fā)現(xiàn)通常是在受到短波(紫外光)刺激時(shí)，TYR活躍性能增加會(huì)導(dǎo)致黑色素合成加快。刑思遠(yuǎn)以水貂為研究對(duì)象，對(duì)水貂TYR基因進(jìn)行生物學(xué)分析，結(jié)果表明TYR基因變異和水貂毛色呈現(xiàn)顯著相關(guān)，因此TYR基因可作為研究水貂毛色的候選基因[12]。孟浩浩通過(guò)PCR-SSCP 和測(cè)序技術(shù)檢測(cè)毛色不同的中國(guó)美利奴羊(軍墾型)、阿勒泰羊TYR基因多態(tài)性，結(jié)果表明TYR基因 5'-UTR處G→C轉(zhuǎn)換(g.683bp)和阿勒泰羊毛色極顯著相關(guān)(\%P\%<0.01)，可將TYR基因作為阿勒泰羊毛色相關(guān)的標(biāo)記基因[13]。Schmidtz等選擇加拿大肉牛作為連鎖定位的參考家系，將牛TYR基因定位29號(hào)染色體上[14]。牛TYR基因一直被認(rèn)為是決定毛色的位點(diǎn)之一，但是國(guó)內(nèi)外對(duì)于?？苿?dòng)物特別是水牛的TYR基因?qū)γ绊懙难芯肯鄬?duì)較少。

本實(shí)驗(yàn)以不同毛色貴州水牛為研究對(duì)象，采用PCR技術(shù)檢測(cè)貴州水牛MC1R和TYR基因序列多態(tài)性，以分析貴州水牛毛色遺傳的分子機(jī)制，從而為貴州水牛的保種選育及利用提供科學(xué)依據(jù)。

2 材料與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)在各品種飼養(yǎng)管理?xiàng)l件基本相同的情況下采用成年健康無(wú)病的水牛為實(shí)驗(yàn)樣本。貴州水牛(灰色)的耳部肌肉組織30頭采自貴州省遵義市鳳崗縣農(nóng)戶，貴州白水牛的血樣15頭采用隨機(jī)抽樣方法從貴州省遵義市鳳崗縣石徑鄉(xiāng)白水牛保種場(chǎng)采集白水牛血樣。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 提取DNA和構(gòu)建DNA池 分別采用柱式基因組DNA抽提試劑盒(血液)、磁珠法動(dòng)物組織基因組DNA抽提試劑盒提取貴州白水牛的血液、貴州水牛(灰色)的耳部肌肉組織DNA，采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的提取效果，使用紫外分光光度計(jì)來(lái)測(cè)定DNA樣品濃度。將貴州水牛(灰色)及貴州白水牛DNA樣品的濃度分別調(diào)整至100 ng/μL，從15頭貴州白水牛的血液DNA中各取5 μL混合在一起構(gòu)建貴州白水牛的DNA池，同時(shí)也從貴州水牛(灰色)的耳部肌肉組織DNA中各取5 μL混合在一起構(gòu)建貴州水牛(灰色)的DNA池。

2.2.2 引物的設(shè)計(jì)及 DNA的擴(kuò)增 在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中找到水牛MC1R基因DNA序列(GenBank登錄號(hào)：AC_000175.1)，利用Primer-BLAST 5.0軟件設(shè)計(jì)2對(duì)特異性引物。詳見(jiàn)表1。

在從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中找到水牛TYR基因座編碼基因DNA序列(GenBank登錄號(hào)：AC_000186.1)，利用NCBI在線軟件Primer-BLAST設(shè)計(jì)5對(duì)特異性引物。詳見(jiàn)表2。

表1 引物序列、退火溫度及目的片段長(zhǎng)度

表2 引物序列、退火溫度及目的片段長(zhǎng)度

以貴州水牛(灰色)和貴州白水牛分別構(gòu)建的DNA池作為DNA模板進(jìn)行特定部分PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增采用鼎國(guó)生物公司生產(chǎn)的Mix，反應(yīng)體系總體積為20 μL，各對(duì)引物最適退火溫度見(jiàn)表1，2。利用1%瓊脂糖凝膠電泳來(lái)檢測(cè)PCR產(chǎn)物，凝膠成像儀來(lái)觀察電泳的結(jié)果。

2.2.3 序列測(cè)序與分析 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送交上海英駿生物技術(shù)有限公司純化后進(jìn)行雙向測(cè)序。利用DNAstar軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行校正比對(duì)，結(jié)合BLAST分析確定SNPs位點(diǎn)。

2.2.4 測(cè)量序列測(cè)序圖峰高和估算等位基因頻率 利用DNAStar軟件中的SeqMan軟件查看測(cè)序結(jié)果，并利用MWSnap軟件中的直尺測(cè)量測(cè)序結(jié)果圖上各多態(tài)位點(diǎn)等位基因相對(duì)應(yīng)的峰高高度。利用下列公式來(lái)估算各多態(tài)位點(diǎn)等位基因頻率。$$Ay=By/(Ba+Bb),y=a,b$$ 公式中的Ay表示在多態(tài)性位點(diǎn)上某等位基因頻率，Ba和Bb分別表示測(cè)序結(jié)果圖上該多態(tài)性位點(diǎn)等位基因a和b的峰高高度。

2.2.5 MC1R基因和TYR基因的RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)與蛋白結(jié)構(gòu)分析

(1)RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的在線分析軟件：

(http://www.genebee.msu/services/rna2_reduced.html)

(2)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的在線分析軟件：

(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_server.html)

(3)蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的在線分析軟件：

(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index)

3 結(jié)果與分析

3.1 PCR產(chǎn)物及測(cè)序結(jié)果

本試驗(yàn)以貴州水牛(灰色)和貴州白水牛為研究對(duì)象，以MC1R基因?yàn)槟康幕?，設(shè)計(jì)2對(duì)特異性引物擴(kuò)增水牛MC1R基因目的序列，以TYR基因?yàn)槟康幕?，設(shè)計(jì)5對(duì)特異性引物擴(kuò)增水牛TYR基因目的序列。利用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，擴(kuò)增結(jié)果詳見(jiàn)圖1和圖2。

圖1 貴州水牛(灰色)和貴州白水牛MC1R基因第1外顯子擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果

圖2 貴州水牛(灰色)和貴州白水牛TYR基因第1外顯子擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果

將兩個(gè)基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送交上海英駿生物技術(shù)有限公司純化后進(jìn)行雙向測(cè)序，測(cè)序得到的結(jié)果與從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得的水牛MC1R基因DNA序列(GenBank登錄號(hào)：AC_000175.1)基本上符合，所以可以確定實(shí)驗(yàn)中經(jīng)過(guò)測(cè)序得到的結(jié)果即為水牛MC1R基因序列。通過(guò)利用BLAST軟件進(jìn)行測(cè)序結(jié)果分析共發(fā)現(xiàn)貴州水牛(灰色)有4個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，貴州白水牛有2個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，以MC1R基因第1外顯子第1位堿基計(jì)數(shù)為1，貴州水牛(灰色)的SNPs位點(diǎn)分別為：exon1-G617A、exon1-T843C、exon1-C1228T、exon1-G1330A，貴州白水牛的SNPs位點(diǎn)分別為：exon1-G617A、exon1-T843C，詳見(jiàn)圖3。同時(shí)將測(cè)序結(jié)果與貴州水牛(灰色)TYR基因DNA序列進(jìn)行對(duì)比(GenBank登錄號(hào)：AC_000186.1)DNA序列基本吻合，可以確定為貴州白水牛TYR基因序列。BLAST分析共發(fā)現(xiàn)4個(gè)SNPs，以TYR基因每1外顯子第1位堿基計(jì)數(shù)為1，SNPs位點(diǎn)分別為： exon1-G826A、exon3-A83G、exon5-T70C和exon4-C170A，詳見(jiàn)圖4。這些多態(tài)性位點(diǎn)可能在不同水牛品種中普遍存在，所以還需要擴(kuò)大不同品種不同毛色的水牛個(gè)體數(shù)更進(jìn)一步的研究。同時(shí)MC1R基因和TYR基因的多態(tài)性位點(diǎn)是否造成水牛的毛色個(gè)體差異也需要進(jìn)一步的深入研究。

圖3 貴州水牛(灰色)、白水牛MC1R基因DNA池的PCR產(chǎn)物檢測(cè)及BLAST分析結(jié)果

圖4 貴州水牛(灰色)、白水牛TYR基因DNA池的PCR產(chǎn)物測(cè)及BLAST分析結(jié)果

3.2 估算SNPs等位基因頻率

利用MWSnap軟件中的標(biāo)尺測(cè)量貴州白水牛MC1R基因和TYR基因各SNP等位基因相對(duì)應(yīng)的峰高高度并根據(jù)公式估算各SNPs等位基因頻率。MC1R基因各SNP等位基因頻率詳見(jiàn)表3。TYR基因各SNP等位基因頻率詳見(jiàn)表4。由表3和表4都可看出，同一突變位點(diǎn)，不同毛色貴州水牛突變頻率差異較大。

3.3 分析MC1R基因和TYR基因的RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)

根據(jù)MC1R基因和TYR基因各SNP位點(diǎn)突變前與突變后基因RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)結(jié)果可以看出，兩個(gè)基因多態(tài)性位點(diǎn)均會(huì)造成各自基因RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的最小自由能發(fā)生改變。詳見(jiàn)表5和表6。

表3 MC1R基因SNPs等位基因頻率估算結(jié)果

表4 TYR基因SNPs等位基因頻率估算結(jié)果

表5 MC1R基因SNP位點(diǎn)突變前后RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)最小自由能

表6 TYR基因SNP位點(diǎn)突變前后RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)最小自由能

根據(jù)最小自由能原理MC1R基因和TYR基因的RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)最小自由能發(fā)生變化的同時(shí)可能會(huì)影響到RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，同時(shí)還有可能會(huì)影響到后續(xù)蛋白質(zhì)的翻譯過(guò)程以及后續(xù)蛋白質(zhì)的相關(guān)功能。

3.4 分析突變前后MC1R和TYR的蛋白二級(jí)與三級(jí)結(jié)構(gòu)

利用在線軟件預(yù)測(cè)貴州水牛(灰色)和貴州白水牛MC1R基因及TYR基因突變前后蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，詳見(jiàn)表7，8。

表7 突變前后MC1R蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果

表8 突變前后TYR蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果

通過(guò)在線軟件對(duì)MC1R基因和TYR基因蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)和突變分析，能夠幫助我們更好的理解MC1R基因和TYR基因蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能。通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析可以看出多態(tài)性位點(diǎn)(SNP)會(huì)造成蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，可能會(huì)影響蛋白質(zhì)的功能。

4 討論與結(jié)論

目前MC1R基因是一個(gè)針對(duì)控制動(dòng)物毛色的主要研究范圍,根據(jù)不同的原因,人們普遍認(rèn)為牛的毛色是判定牛品種的重要標(biāo)志，認(rèn)為牛的毛色與乳和肉等方面的生產(chǎn)性能有著直接的關(guān)系，很多人都非常重視牛的毛色。結(jié)合國(guó)內(nèi)和國(guó)外已有的研究顯示，MClR基因是調(diào)控牛毛色的最主要基因,牛的毛色之所以存在差異，是因?yàn)樗鼈儞碛胁煌腗ClR基因型。在很早的時(shí)候就發(fā)現(xiàn)牛MCIR基因有ED，E+，e三種基因型，F(xiàn)rancois等在2000年通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)引物-PCR(COP-PCR)方法檢測(cè)到牛MC1R的基因型除了有ED,E+,e三種基因型之外，還有一種基因型E1[15]。

在黑色素生成過(guò)程中酪氨酸酶(TYR)是形成的關(guān)鍵酶，黑色素生成的速度和產(chǎn)量也是取決與其表達(dá)量和活性。黑色素是多巴醌、吲哚-5，6醌和多巴色素的聚合物，然而酪氨酸酶正是把酪氨酸轉(zhuǎn)化成多巴的中介，多巴又被氧化成多巴醌，有進(jìn)一步轉(zhuǎn)變?yōu)楦鞣N衍生物組合構(gòu)成黑色素。由于酪氨酸酶在毛色性狀上的重要性，編碼酪氨酸酶的TYR基因也被列為黑色素性狀和毛色形成的重要研究基因之一。

本試驗(yàn)在貴州水牛(灰色)和貴州白水牛擴(kuò)增的MC1R基因中共同篩選到錯(cuò)義突變exon1-T843C，導(dǎo)致纈氨酸(Val)變成丙氨酸(Ala)，還在貴州水牛(灰色)中篩選到exon1-C1228T(同義)、exon1-G1330A兩個(gè)突變位點(diǎn)。在兩種水牛擴(kuò)增的TYR基因共同篩選到2個(gè)錯(cuò)義突變exon1-G826A、exon5-T70C，分別導(dǎo)精氨酸(Arg)突變?yōu)榻M氨酸(His)、亮氨酸(Leu)突變?yōu)楫惲涟彼?Ile)；1個(gè)同義突變exon3-A83G。分別比較MC1R基因和TYR基因的多態(tài)性位點(diǎn)等位基因頻率，均發(fā)現(xiàn)不同突變位點(diǎn)突變頻率存在顯著差異，這一發(fā)現(xiàn)是否在其他白水牛中也有所不同，需要加大水牛的品種及數(shù)量進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分析；突變前后MC1R基因和TYR基因RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)均發(fā)生改變，并影響到蛋白質(zhì)二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)。下一步工作會(huì)增大研究水牛數(shù)量，并分析MC1R基因和TYR基因不同位點(diǎn)與貴州白水牛毛色上的遺傳多樣性，探究MC1R基因和TYR基因?qū)Π姿Ｃ南嚓P(guān)性，從而為貴州特有品種白水牛來(lái)源以及整個(gè)水牛品種毛色遺傳多樣性的研究奠定基礎(chǔ)，同時(shí)為白水牛的選育工作提供科學(xué)的理論依據(jù)。

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Study on Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) of the MC1R and TYR genes in Guizhou buffalo with different hair color

Ao Qi-yan1,Hu Ling-ling1,Luo Shi-hong1,Zhao Yong-chao1,Wang Zhen1,Liu Ruo-yu1

(1.CollegeofAnimalSciences,GuizhouUniversityKeyLaboratoryofAnimalGenetics,BreedingandReproductioninthePlateauMountainousRegion(GuizhouUniversity),MinistryofEducation,Guiyang, 550025,China)

【Objective】 To promote the scientific protection and exploitation of the buffalo resources in Guizhou, and to provide more scientific basis for breeding. 【Method】In this experiment, the Guizhou grey water buffalo was used as the contrast group, while the Guizhou white water buffalo was used as the experimental group. All DNA samples from the above groups were used to construct the DNA pool, respectively. The MC1R and TYR genes of Guizhou buffalo with different hair color ware used to carry out PCR amplification and scanning single nucleotide polymorphisms (SNPs). Bioinformatics software analysis was used to analyze SNPs loci and their effect of RNA secondary structure and the secondary and tertiary structure of proteins. 【Result】 In the MC1R gene amplification of Guizhou gray buffalo and Guizhou White Buffalo, a missense mutation in exon 1 (T843C), leading valine (Val) to alanine (Ala) was founded, as well as two mutations in exon 1 (C1228T) (synonymous mutation) and exon1 (G1330A) were screened in the buffalo (gray) in Guizhou. In two buffaloes, SNPs identification of TYR gene showed two missense mutations in exon 1 (G826A) and exon5 (T70C), respectively, which resulting arginine (ARG) to histidine (His), leucine (Leu) to isoleucine (ILE), respectively. Besides, a synonymous SNP in exon3 (A83G) was founed.

Guizhou buffalo; MC1R gene; TYR gene; SNPs

2015-02-16 修改日期:2015-03-08

貴州大學(xué)“SRT計(jì)劃”項(xiàng)目

敖啟燕(1993- )，女，貴州福泉人，在讀本科生，專業(yè)方向：動(dòng)物科學(xué)，E-mail：1225998062@qq.com

劉若余(1963- )，男，湖南邵東人，博士，教授，主要從事分子遺傳與動(dòng)物育種研究工作，E-mail：liury04@163.com

S823.2

A

1001-9111(2015)04-0012-06