陳建飛金先慶

新耐藥基因HA117在神經(jīng)母細胞瘤中的表達及臨床意義

陳建飛1金先慶2

HA117；基因；神經(jīng)母細胞瘤；MDR1；免疫組織化學

全反式維甲酸（ATRA）是我國學者首先使用的白血病化療藥物及實體瘤輔助化療藥物[1]。在肯定ATRA對惡性腫瘤的療效時，ATRA在使用后存在誘導腫瘤多藥耐藥的現(xiàn)象也同樣受到廣泛的關注[2-3]。本課題組在建立HL-60/ATRA耐藥株的基礎上成功篩選并發(fā)現(xiàn)一未知的耐藥新基因，并命名為HA117（Genebank Number：CB214920）。在前期研究[4]中，我們已成功構建攜帶HA117基因的重組腺病毒和其沉默質粒，并驗證了HA117具有明顯的多藥耐藥功能。在此基礎上，我們成功構建HA117多克隆抗體[5]，并檢測在結腸癌、肺癌、乳腺癌等組織中有較強的表達[6]。為進一步檢測HA117蛋白在兒童實體腫瘤中的表達，初步分析其耐藥機制，本研究應用S-P免疫組化法，檢測神經(jīng)母細胞瘤中HA117蛋白的表達情況，分析其臨床病理意義，并與MDR1基因做比較，初步分析其耐藥機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集重慶醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院2009年—2012年神經(jīng)母細胞瘤標本30例，男18例，女12例，年齡5個月～6歲，平均3.81歲。病理分型：預后良好型（FH型）16例，預后不良型（uFH）10例，其余4例由于標本原因未分型。明確有伴淋巴結及遠處轉移者11例。每例均由兩名重慶醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院資深病理科醫(yī)師做病理診斷。

1.2 試劑及儀器 HA117多克隆抗體（本實驗室保存）；MDR1單克隆抗體（南京博士德生物公司，2012090701）；KIT-9921即用型免疫組化（402141211），EliVision TM Super試劑盒（福州邁新生物技術開發(fā)有限公司，20120201）。組織包埋機，組織切片機，微波爐，4℃冰箱，顯微鏡等。

1.3 方 法

1.3.1 免疫組織化學檢測方法 所有標本均用10%福爾馬林溶液固定，石蠟包埋，厚5μm連續(xù)切片，貼附于經(jīng)多聚賴氨酸處理的切片，之后60℃烤片18h。切片經(jīng)脫蠟水化，用0.01mol檸檬酸緩沖液（pH6.0）進行微波加熱抗原修復，3%雙氧水滅活過氧化物酶，BSA封閉抗原，以1：100比例稀釋濃縮型第一抗體，滴加40μL一抗后4℃冰箱過夜。PBS沖洗后分別滴加生物素標記的二抗和SP復合物放大效應，DAB顯色，鏡下控制顯色時間并中止反應，蘇木素復染，脫水透明、封片。

1.3.2 結果判定 HA117表達呈棕黃色或棕褐色為陽性，每片觀察5個40倍光鏡下視野，用Image-Pro Plus 6.0軟件計算陽性細胞數(shù)，根據(jù)試劑公司提供的判斷標準：陽性細胞數(shù)少于10%腫瘤細胞的胞質呈棕黃色為陰性表達（-），10%~25%為低度表達（+），25%~75%為中度表達（++），>75%為高度表達（+++）；中高度表達為強陽性表達，表示腫瘤對該耐藥基因所介導的藥物具有耐受性；MDR1以相同方法判定。1.4 統(tǒng)計學方法 應用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料采用χ2檢驗，檢驗水準P=0.05。

2 結果

2.1 HA117蛋白表達 HA117蛋白主要在細胞胞漿中表達，呈棕黃色或棕褐色表達，陽性表達率70%，瘤旁正常組織的表達率為21%，兩者比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表1、圖1～2（封三）。

2.2 HA117蛋白表達與Shimada病理分期的關系按照Shimada病理分期法把神經(jīng)母細胞瘤分為FH型（Favorable Histology Group）和uFH型（UnfavorableHistology Group）兩種[7]。30例神經(jīng)母細胞瘤中有16例FH型，10例uFH型，其余4例因為標本原因未進行分期。其中FH型中有HA117蛋白表達8例，表達率50%，uFH型10例全部表達，表達率100%，兩者比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表2。

表1 HA117在神經(jīng)母細胞瘤及非瘤組織表達情況（例）

表2 HA117在神經(jīng)母細胞瘤不同病理分型表達情況（例）

2.3 HA117與MDR1蛋白在神經(jīng)母細胞瘤組織表達 30例神經(jīng)母細胞瘤組織HA117陽性表達率70%，MDR1表達率為60%，兩者比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。HA117主要在細胞胞漿表達，MDR1主要在細胞胞膜表達。見表3，圖3～4（封三）。

表3 HA117與MDR1蛋白在神經(jīng)母細胞瘤表達（例）

3 討 論

神經(jīng)母細胞瘤是兒童中最常見的顱外實體瘤，多發(fā)生于腎上腺、盆腔和頭頸部，預后極差[7]?；熓巧窠?jīng)母細胞瘤綜合治療中的重要方法。但在神經(jīng)母細胞瘤化療當中，耐藥問題突出，因此也越來越引起重視。有研究[8]表明神經(jīng)母細胞瘤的耐藥機制并非單一機制引起，可能是MDR1、GST-π等多種基因協(xié)同作用的結果。有研究表明，神經(jīng)母細胞瘤中，MDR1、GST-π存在高表達，說明神經(jīng)母細胞瘤存在耐藥性，并且耐藥機制可能存在多種機制。

新耐藥基因HA117作為近幾年新發(fā)現(xiàn)的耐藥基因，對于腫瘤耐藥基因譜是一個補充。HA117基因已經(jīng)被證明在多種實體腫瘤與非實體腫瘤中存在不同程度的表達，并證明參與腫瘤的多藥耐藥[9-11]。但在神經(jīng)母細胞瘤中的表達及耐藥機制未被研究。

本研究結果顯示，神經(jīng)母細胞瘤中，HA117的表達明顯高于癌旁正常組織，結果差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），說明神經(jīng)母細胞瘤存在多藥耐藥。神經(jīng)母細胞瘤Shimada分型分為FH型和uFH型。有研究表明，MDR1、TopoII、LRP在uFH中表達比FH顯著增強，提示uFH型神經(jīng)母細胞瘤對化療藥物耐藥性更為顯著，本研究發(fā)現(xiàn)，uFH型神經(jīng)母細胞瘤中HA117表達明顯增高FH型，結果有顯著差異性。表明uFH型神經(jīng)母細胞瘤更具有耐藥性，可以考慮在化療前進行ATRA誘導，以取得更好的化療效果。HA117基因在神經(jīng)母細胞瘤中的表達與經(jīng)典耐藥基因MDR1無顯著差異，但從表達部位看，HA117主要表達在細胞胞漿，MDR1主要存在在細胞胞膜。目前研究表明，MDR1的主要作用機制是通過膜蛋白將細胞內(nèi)的藥物泵出細胞，從而引起腫瘤耐藥，HA117主要表達在細胞胞漿，推測作用機制可能是通過細胞內(nèi)的代謝機制降低胞內(nèi)的藥物濃度，從而引起腫瘤耐藥。HA117蛋白的高表達，是相繼MDR1、GST-π、TopoII后，對于神經(jīng)母細胞瘤耐藥原因的重要補充。為選擇腫瘤敏感藥物時，是否選擇ATRA進行誘導提供依據(jù)。

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［5］陳建飛，金先慶，丁雄輝，等.新耐藥基因HA117多克隆抗體的制備與鑒定［J］.第三軍醫(yī)大學學報，2011，33（11）：1128-1131.

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（收稿：2015-01-28 修回：2015-05-05）

1浙江省嘉興市婦幼保健院新生兒重癥監(jiān)護病房（嘉興314000）；2重慶醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院普外科（重慶 410000）

金先慶，Tel：15105731339；