汪元符

（南昌市食品藥品檢驗(yàn)所，江西 南昌 330038）

抗炎抗風(fēng)濕功效中成藥中非法添加非甾體抗炎藥及激素類成分的檢測(cè)

汪元符

（南昌市食品藥品檢驗(yàn)所，江西 南昌 330038）

目的：針對(duì)抗炎抗風(fēng)濕功效類中成藥，建立可能非法添加的對(duì)乙酰氨基酚等10種非甾體抗炎藥成分及地塞米松等3種糖皮質(zhì)激素成分的高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的檢測(cè)方法。方法：色譜柱為PHenomenex Luna C18（2）100A（150 mm×2.00 mm，3 μm）；柱溫為40℃；流動(dòng)相為10 mmol/L甲酸銨（以甲酸調(diào)節(jié)pH值至3.0）及乙腈，梯度洗脫；流速為0.2 mL/min；以優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)采集信號(hào)。結(jié)果：各成分檢出限濃度為0.1～2 ng/mL；定量限濃度為0.5～ 5 ng/mL；線性范圍為各成分定量限～100 ng/mL；在線性范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)均在0.99以上；平均加樣回收率為93.0%～ 102.7%。結(jié)論：本方法簡(jiǎn)便，快速，準(zhǔn)確，靈敏度高，專屬性好；能用于抗炎抗風(fēng)濕功效類中成藥中非法添加的快速檢測(cè)。

高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用；抗炎抗風(fēng)濕功效類中成藥；非甾體抗炎藥；糖皮質(zhì)激素

在食品藥品監(jiān)督管理部門日常的監(jiān)督抽檢、風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)及投訴舉報(bào)受理的工作中，抗炎抗風(fēng)濕功效類中成藥非法添加非甾體抗炎藥及激素的情況時(shí)有發(fā)生，嚴(yán)重危害著人民群眾的用藥安全?，F(xiàn)行法規(guī)標(biāo)準(zhǔn)在檢測(cè)此類非法添加時(shí)，方法繁瑣，需經(jīng)3個(gè)不同色譜系統(tǒng)?；谔岣吖ぷ餍?，增加非法添加可篩查成分，提高檢測(cè)方法的靈敏度、準(zhǔn)確度、精確度的原因，本實(shí)驗(yàn)室建立了以下有效的高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法，以一種色譜系統(tǒng)，電噴霧離子源正、負(fù)離子同時(shí)監(jiān)測(cè)，可同時(shí)檢測(cè)多種非甾體抗炎藥及激素，能夠滿足平時(shí)的監(jiān)督檢驗(yàn)需要。

1 儀器、試劑與材料

AB Sciex 4000 Qtrap質(zhì)譜，ekspert ultraLC100高效液相色譜儀，METTLER TOLEDO ME204E電子分析天平，METTLER TOLEDO XS105電子分析天平，昆山KQ-300DB型數(shù)控超聲波清洗器，TG16-WS臺(tái)式高速離心機(jī)（湘儀離心機(jī)），Millipore超純水系統(tǒng)。

甲醇（色譜純，Merck），乙腈（色譜純，Merck），甲酸（色譜純，天津科密歐），甲酸銨（色譜純，武漢偉琪博星）。

對(duì)照品：對(duì)乙酰氨基酚（100018-200408）、布洛芬（100179-201105）、萘普生（100198-201205）、氨基比林（100503-200301）、甲氧芐啶（100031-200304）、雙氯芬酸鈉（100334-200302）、尼美舒利（100555-200501）、保泰松（100481-200601）、吡羅昔康（100177-200603）、吲哚美辛（100258-200904）、氫化可的松（100152-200206）、地塞米松（100129-201105）、醋酸潑尼松（100012-200706），均為中國(guó)食品藥品檢定研究院提供。

樣品：購(gòu)自流通企業(yè)或醫(yī)療機(jī)構(gòu)。舒筋健腰丸（規(guī)格：45 g/瓶，批號(hào)：130701），追風(fēng)透骨丸（規(guī)格：36 g/瓶，批號(hào)：131102），木瓜丸（規(guī)格：0.18 g× 240丸 /瓶，批號(hào)：140722），活絡(luò)消痛片（規(guī)格：0.35 g/片，批號(hào)：140301），復(fù)方夏天無(wú)片（規(guī)格：0.3 g/片，批號(hào)：140710），尪痹片（規(guī)格：0.5 g/片，批號(hào)：140302），腰息痛膠囊（規(guī)格：0.3 g/粒，批號(hào)：141016），野木瓜膠囊（規(guī)格：0.45 g/粒，批號(hào)：131207），痹祺膠囊（規(guī)格：0.3 g/粒，批號(hào)：131015），祛風(fēng)止痛膠囊（規(guī)格：0.3 g/粒，批號(hào)：140105）。

2 方法與結(jié)果

2.1 高效液相色譜分析條件

分析柱：PHenomenexLunaC18（2）100A（150 mm× 2.00 mm，3 μm）；柱溫：40℃；流速：0.2 mL/min；進(jìn)樣量：5 μL；流動(dòng)相：A為10 mmol/L甲酸銨（以甲酸調(diào)節(jié)pH值至3.0），B為乙腈。按表1進(jìn)行梯度洗脫。

表1 梯度洗脫程序

2.2 質(zhì)譜分析條件

電噴霧離子源（ESI）：正離子模式（ESI+）、負(fù)離子模式（ESI-）；掃描模式：MRM；掃描范圍：50～600 Da；Curtain Gas（CUR）：25；Collision Gas（CAD）：Medium。IonSpray Vottage（IS）：正5 500，負(fù)4 500；Temperature（TEM）：500；Ion Source Gas1（GS1）：55；Ion Source Gas2（GS2）：50；Interface Heater（ihe）：on。離子對(duì)選擇（MRM Ion Pairs）見(jiàn)表2。

2.3 對(duì)照品溶液的配制

取對(duì)乙酰氨基酚、布洛芬、萘普生、氨基比林、甲氧芐啶、雙氯芬酸鈉、尼美舒利、保泰松、吡羅昔康、吲哚美辛、氫化可的松、地塞米松、醋酸潑尼松對(duì)照品各約10 mg，精密稱定，以甲醇制成每1 mL中各含 1 mg的溶液作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備溶液 1 mL，以 50%甲醇，制成各含200 ng/mL的溶液，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。對(duì)照品儲(chǔ)備液以50%甲醇等比稀釋，可得到各含 0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，10.0，20.0，30.0，40.0，50.0，100.0 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。

表2 質(zhì)譜分析

2.4 供試品溶液的配制

將10批分別為丸劑、片劑、膠囊劑（取內(nèi)容物）的樣品研細(xì)，各取約 0.50 g，精密稱定，置100 mL量瓶中，加入50%甲醇約80 mL，超聲處理20 min，放冷至室溫，以 50%甲醇定容，搖勻，以 10 000 r/min離心 10 min后，取上清液，以50%甲醇溶液稀釋10～ 100倍，用0.2 μm的濾頭濾過(guò)，取續(xù)濾液測(cè)定。

2.5 對(duì)照品定量離子對(duì)（50 ng/mL）提取質(zhì)譜圖

見(jiàn)圖1～13。

2.6 定性確認(rèn)

圖1 甲氧芐啶：292.1/231.1提取質(zhì)譜圖注：ESI+，tR為1.69 min

圖2 對(duì)乙酰氨基酚：152.1/110.3提取質(zhì)譜圖注：ESI+，tR為3.05 min

采用保留時(shí)間與對(duì)照品相一致，且定性與定量離子對(duì)相對(duì)離子豐度比應(yīng)滿足表3要求，判為檢出。

圖3 氨基比林：232.0/113.3提取質(zhì)譜圖注：ESI+，tR為3.73 min

圖4 氫化可的松：363.2/121.3提取質(zhì)譜圖注：ESI+，tR為10.45 min

圖5 地塞米松：391.3/361.3提取質(zhì)譜圖注：ESI-，tR為11.11 min

圖6 吡羅昔康：329.9/146.1提取質(zhì)譜圖注：ESI-，tR為11.57 min

圖7 醋酸潑尼松：399.2/339.3提取質(zhì)譜圖注：ESI-，tR為11.92 min

圖8 萘普生：228.9/169.8提取質(zhì)譜圖注：ESI-，tR為12.27 min

圖9 尼美舒利：308.0/229.9提取質(zhì)譜圖注：ESI-，tR為13.09 min

圖10 吲哚美辛：356.2/312.1提取質(zhì)譜圖注：ESI-，tR為14.12 min

圖11 雙氯芬酸鈉：294.0/250.0提取質(zhì)譜圖注：ESI-，tR為14.15 min

圖12 布洛芬：205.1/160.9提取質(zhì)譜圖注：ESI-，tR為14.85 min

各對(duì)照品試驗(yàn)結(jié)果如表4所示。

圖13 保泰松：308.2/280.0提取質(zhì)譜圖注：ESI-，tR為15.30 min

表3 定性與定量離子對(duì)相對(duì)離子豐度比 （%）

表4 對(duì)照品試驗(yàn)結(jié)果

2.7 線性關(guān)系及檢出限、定量限考察

采用“2.1”項(xiàng)下的色譜條件，“2.2”項(xiàng)下的質(zhì)譜條件，以“2.3”項(xiàng)下的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液進(jìn)樣檢測(cè)。以檢測(cè)所得峰面積為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)系列溶液濃度（ng/mL）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性擬合。以定性離子對(duì)和定量離子對(duì)提取的質(zhì)譜圖信噪比均大于3時(shí)的濃度（ng/mL）為檢出限。以定性離子對(duì)提取的質(zhì)譜圖信噪比大于3，定量離子對(duì)提取的質(zhì)譜圖信噪比大于10時(shí)的濃度（ng/mL）為定量限。以在一定濃度范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)大于 0.99，為線性范圍。結(jié)果表5。

2.8 精密度試驗(yàn)

選用標(biāo)準(zhǔn)系列溶液中各成分濃度為10.0 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，連續(xù)進(jìn)樣6針，以提取的定量離子對(duì)質(zhì)譜圖峰面積計(jì)算。結(jié)果見(jiàn)表6，各組分RSD值均在0.32%～ 0.84%之間。

表5 線性關(guān)系及檢出限、定量限考察結(jié)果

表6 精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn)

選用標(biāo)準(zhǔn)系列溶液中各成分濃度為10.0 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在0，1，2，4，8，12，24 h分別進(jìn)樣，以提取的定量離子對(duì)質(zhì)譜圖峰面積計(jì)算。結(jié)果如表7，各組分RSD值均在0.79%～ 1.58%之間。

表7 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.10 回收率試驗(yàn)

取丸劑（舒筋健腰丸）、片劑（活絡(luò)消痛片）、膠囊劑（腰息痛膠囊）各1份，如“2.4”項(xiàng)下平行稱樣各3份，分別加入50，200，500 μL每1 mL中各含1 mg的對(duì)照品儲(chǔ)備液，置 100 mL量瓶中，加入50%甲醇約 80 mL，超聲處理 20 min，放冷至室溫，以50%甲醇定容，搖勻，以10 000 r/min離心10 min后，取上清液，以 50%甲醇溶液稀釋 100倍，用0.2 μm的濾頭濾過(guò)，取續(xù)濾液測(cè)定。則丸劑、片劑、膠囊劑的3份平行樣最終加標(biāo)濃度分別為5，20，50 ng/mL。以5次平行測(cè)定結(jié)果的均值與加標(biāo)濃度相比較，回收率結(jié)果見(jiàn)表8，不同劑型各組分高、中、低3個(gè)濃度的回收率均在93.0%～102.7%之間。

2.11 樣品測(cè)定結(jié)果

檢測(cè)了10批抗炎抗風(fēng)濕中成藥，結(jié)果均為陰性。

3 討論

3.1 流動(dòng)相的選擇

試用了不同種類、比例、pH值的流動(dòng)相，如：水-甲醇、水-乙腈、0.2%甲酸水-甲醇、0.2%甲酸水-乙腈、10 mmol/L甲酸銨-乙腈、10 mmol/L乙酸銨-乙腈、10 mmol/L乙酸銨-乙腈-四氫呋喃。試用了不同梯度洗脫方式。以本法所選用的流動(dòng)相：A（10 mmol/L甲酸銨以甲酸調(diào)節(jié)pH值至3.0）-B（乙腈）采用的洗脫方式，13種成分檢測(cè)靈敏度均能達(dá)到滿意。

3.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

13種成分均同時(shí)采用ESI+及ESI-檢測(cè)，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，選用靈敏度高的一種方法。選用靈敏度最高的一組離子對(duì)作為定量離子對(duì)，再選擇靈敏度次高的一組離子對(duì)作為定性離子對(duì)。

3.3 供試品提取方法選擇

試驗(yàn)表明，以甲醇或50%甲醇超聲提取，沒(méi)有明顯區(qū)別，考慮到溶液強(qiáng)度及在色譜中的擴(kuò)散，采用50%甲醇比較有利；超聲15 min即可有效提取所測(cè)組分，采用20 min較穩(wěn)妥。

表8 回收率試驗(yàn)結(jié)果

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（收稿日期：2015-06-16）

Detection of Non-steroidal Anti-inflammatory Drug and Glucocorticoid Added Illegally in Anti-inflammatory and Antirheumatic Traditional Chinese Medicine

Wang Yuanfu （Nanchang Institute for Food and Drug Control，Jiangxi Nanchang 330038，China）

Objective：To establish a HPLC-MS/MS method for the detection of acetaminophen，dexamethasone and other 10 kinds of non-steroidal anti-inflammatory drugs and 3 kinds of glucocorticoid in anti-inflammatory and antirheumatic traditional Chinese medicines.Methods：PHenomenex Luna C18（2）100A column（150 mm×2.00 mm，3 μm）was used，the column temperature was at 40℃，the mobile phase was 10 mmol/L ammonium formate（pH 3.0）-acetonitrile，using gradient elution method，the flow rate was 0.2 mL/min and optimization MS/MS method was adopted.Results：The detection limit of this method was 0.1～ 2 ng/mL，the limit of quantitation was 0.5～5 ng/mL and the linear range was the limit of quantitation～ 100 ng/mL.The test results showed the related coefficient in the linear range was more than 0.99.The average recovery of the method was 93.0% ～ 102.7%. Conclusion：This method is simple，rapid and accurate with a high sensitivity and specificity.It can be used for the quick detection of illegally added materials in anti-inflammatory and antirheumatic traditional Chinese medicines.

HPLC-MS/MS；Anti-inflammatory and Antirheumatic Traditional Chinese Medicines；Non-steroidal Anti-inflammatory Drug；Glucocorticoid

10.3969/j.issn.1672-5433.2015.11.005

2015-06-28）

表5 兩組患者的療效比較

注：治療組與對(duì)照組比較P=0.036 1

?

3 討論

汪元符，男，主管藥師。研究方向：中藥理論、藥物檢測(cè)及食品安全。E-mail：wanngel@126.com

目前，國(guó)內(nèi)的中醫(yī)藥治療糖尿病足依然缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)、統(tǒng)一操作規(guī)程以及缺乏截肢率、潰瘍的發(fā)生率、醫(yī)療費(fèi)用等大樣本流行病學(xué)資料支持中醫(yī)藥治療糖尿病足的效果分析。本實(shí)驗(yàn)以中藥藥敏的方法研究黃連液最佳使用濃度和麝香的最佳使用劑量，可以作為解決中醫(yī)藥對(duì)糖尿病足治療在藥物選擇、劑量確定缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)現(xiàn)狀下的方法之一。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，黃連液聯(lián)合麝香比原組方的抑菌作用明顯增強(qiáng)，對(duì)于那些抗菌藥物無(wú)效的多重耐藥菌，黃連液和麝香能起到明顯的殺菌和抑菌作用，中藥將成為控制糖尿病足細(xì)菌感染的另一最佳的選擇，為臨床治療糖尿病足提供了一種新的有效方法。