楊小四，劉曉利，宋先兵，張俊強(qiáng)，趙 歡，陳曉宇

β-catenin、DKK-1蛋白在出生前后雙酚A暴露的子鼠雄性生殖細(xì)胞中的表達(dá)

楊小四1，2，劉曉利1，宋先兵1，張俊強(qiáng)1，趙 歡1，陳曉宇1

目的探討Wnt／β-catenin信號(hào)通路主要蛋白（βcatenin、DKK-1）在出生前后雙酚A（BPA）暴露的成年子鼠雄性生殖細(xì)胞中的表達(dá)及意義。方法自受孕第0天（PGD0），ICR孕鼠飲水BPA染毒，隨機(jī)將孕鼠分為溶劑對(duì)照組、BPA低劑量（10 nmol／L）組、BPA中劑量（50 nmol／L）組、BPA高劑量（300 nmol／L）組，每組6只。雄性仔鼠出生后繼續(xù)飲水染毒，劑量同上，6周（PGD42）處死，取睪丸組織，計(jì)算睪丸系數(shù)；免疫組化和Western blot法檢測(cè)β-catenin、DKK-1蛋白的表達(dá)。結(jié)果BPA暴露組較溶劑對(duì)照組仔鼠睪丸臟器系數(shù)降低，β-catenin、DKK-1蛋白表達(dá)明顯增加；免疫組化顯示，β-catenin、DKK-1蛋白多位于睪丸間質(zhì)細(xì)胞和精原細(xì)胞中。結(jié)論β-catenin、DKK-1可能參與了出生前后BPA暴露對(duì)子鼠雄性生殖細(xì)胞發(fā)育的影響。

雙酚A；β-catenin蛋白；DKK-1蛋白；睪丸生殖細(xì)胞

雙酚A（bisphenol A，BPA）是現(xiàn)代生活中人們不可避免接觸到的一類酚類環(huán)境雌激素，廣泛存在于塑料制品中，通過(guò)食品包裝材料、醫(yī)療器械和染料等塑料工業(yè)，經(jīng)高溫水解或酸、堿作用釋放進(jìn)入機(jī)體，干擾機(jī)體自身激素的合成和分泌等，對(duì)機(jī)體具有潛在、長(zhǎng)期、破壞性的影響［1］。研究［2－3］證實(shí)孕期暴露BPA會(huì)影響子代雄鼠的生殖系統(tǒng)，但BPA影響機(jī)體的作用機(jī)制多樣。Wnt／β-連環(huán)蛋白（β-catenin）信號(hào)通路是一個(gè)關(guān)鍵信號(hào)通路，調(diào)節(jié)機(jī)體生長(zhǎng)和發(fā)育［4］。目前Wnt／β-catenin信號(hào)通路在生殖細(xì)胞方面的研究較少。該研究通過(guò)小鼠出生前后暴露BPA，研究BPA對(duì)雄性小鼠睪丸組織的影響機(jī)制是否與Wnt／β-catenin信號(hào)通路有關(guān)，探討出生前后接觸BPA的子鼠雄性生殖細(xì)胞形成過(guò)程中與Wnt／βcatenin信號(hào)通路的關(guān)系及其下游調(diào)控主要蛋白βcatenin、DKK-1表達(dá)，旨在為闡明Wnt／β-catenin信號(hào)通路在BPA暴露的致畸作用提供一定的分子機(jī)制，為制定相應(yīng)的防治措施提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器BPA（美國(guó)Sigma公司）；兔抗鼠多克隆抗體β-catenin、DKK-1、GAPDH（美國(guó)Santa Cruz公司）；羊抗兔免疫組化二抗試劑盒（福州邁新生物技術(shù)有限公司）；BCA蛋白定量試劑盒（海門碧云天公司）；PVDF膜（美國(guó)Bio-Rad公司）；Super Singal化學(xué)發(fā)光試劑盒（美國(guó)Pierce公司）；實(shí)驗(yàn)所需其他試劑均為分析純；TSJ-1A型自動(dòng)組織脫水機(jī)（天津天利航空機(jī)電有限公司）；RM2135型石蠟切片機(jī)（德國(guó)Leica公司）；BM-Ⅱ病理組織包埋機(jī)（安徽電力科學(xué)研究所）；80i生物顯微攝像和分析系統(tǒng)（日本Nikon公司）；BS210S型電子天平（北京賽多利斯天平有限公司）；SZ-97自動(dòng)三重純水蒸餾器（上海亞榮生化儀器廠）；BPA采用少量DMSO溶解配成1 mg／ml的母液，置于4℃冰箱保存，臨用時(shí)以純水稀釋至所需濃度（DMSO終濃度小于0.01%）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物60只ICR雌鼠，30只ICR雄鼠，8 ～10周齡，體重（30.5±2.2）g，購(gòu)自安徽省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)于安徽醫(yī)科大學(xué)毒理教研室動(dòng)物房。ICR鼠自由進(jìn)食，飼養(yǎng)室溫（22±2）℃，光照維持12 h光照／12 h黑暗的晝夜節(jié)律，光照從早上7點(diǎn)開始，ICR鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物分組與給藥 90只成年ICR小鼠于晚上9時(shí)以雌鼠∶雄鼠為2∶1進(jìn)行合籠，于次日上午9時(shí)檢查ICR雌鼠是否妊娠，妊娠標(biāo)準(zhǔn)為檢到陰栓。即確定為妊娠第0天（PGD0）。然后隨機(jī)分為溶劑對(duì)照組、BPA低劑量組（10 nmol／L）、BPA中劑量組（50 nmol／L）、BPA高劑量組（300 nmol／L），每組6只。為保持自然狀態(tài)，BPA采取自由飲水方式攝入，為保證BPA飲入濃度穩(wěn)定，ICR孕鼠每2 d稱重1次；孕鼠自PGD0起開始染毒，哺乳期間繼續(xù)染毒，斷乳后雄性仔鼠繼續(xù)染毒至產(chǎn)后42 d（PGD42），脫頸椎處死，無(wú)菌操作下取雄性ICR仔鼠睪丸組織，稱量睪丸濕重，計(jì)算睪丸臟器系數(shù)。睪丸臟器系數(shù)＝睪丸濕重／體質(zhì)量。將左側(cè)睪丸組織用于形態(tài)學(xué)檢查，右側(cè)睪丸組織置液氮凍存?zhèn)錅y(cè)蛋白等。

1.3.2 免疫組化染色檢測(cè)雄性ICR仔鼠睪丸組織β-catenin、DKK-1蛋白表達(dá) 將新鮮左側(cè)睪丸組織置于10%多聚甲醛中固定，梯度乙醇溶液脫水，二甲苯透明，常規(guī)石蠟包埋，取出蠟塊后置于－20℃冰箱，冷凍適度后，用石蠟切片機(jī)切成4 μm厚的切片，90℃燒烤30 min，即可進(jìn)行常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度乙醇至水，0.01 mol／L枸櫞酸鈉緩沖液微波抗原修復(fù)，3%H2O2于37℃溫箱孵育20 min，50 μl／片山羊血清封閉，37℃恒溫孵育30 min，吸去封閉血清、不需PBS沖洗；滴加50 μl／片兔抗鼠多克隆一抗β-catenin（1∶300）、DKK-1（1∶200），4℃孵育過(guò)夜，PBS漂洗3次，每次5 min；滴加50 μl／片生物素化山羊抗兔IgG工作液，37℃恒溫孵育30 min，PBS漂洗3次，每次5 min；滴加50 μl／片羊抗兔辣根酶標(biāo)記鏈霉卵蛋白二抗工作液，37℃恒溫孵育30 min，PBS漂洗3次，每次5 min；DAB顯色，細(xì)胞核采用蘇木精復(fù)染；進(jìn)行常規(guī)梯度乙醇上行脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。采用Nikon 80i生物顯微攝像與分析系統(tǒng)，觀察并記錄40倍物鏡下每個(gè)視野中β-catenin、DKK-1陽(yáng)性蛋白表達(dá)數(shù)目。

1.3.3 Western blot法檢測(cè)β-catenin、DKK-1蛋白表達(dá) 取右側(cè)睪丸組織，取樣、稱重、勻漿，按照試劑盒說(shuō)明書配置細(xì)胞裂解液裂解勻漿，3 000 r／min離心10 min，提取蛋白，BCA法蛋白定量。取50 μg蛋白上樣，SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，室溫下封閉1 h；加入兔抗鼠單克隆一抗β-catenin（1∶2 000）、DKK-1（1∶1 500）、GAPDH（1∶3 000），4℃冰箱孵育過(guò)夜；次日TBST脫洗3次，每次5 min；然后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔抗體（1∶3 000）37℃孵育1 h，再TBST脫洗3次，每次5 min；ECL檢測(cè)液發(fā)光顯影定影、X線片曝光、洗片，Image J軟件進(jìn)行灰度半定量分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 15.0軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以±s表示。組間比較用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 BPA暴露對(duì)雄性子鼠睪丸臟器系數(shù)的影響母鼠自懷孕PGD0開始BPA染毒，實(shí)驗(yàn)各組每只母鼠所產(chǎn)的子鼠的雌雄比例無(wú)顯著差異。與溶劑對(duì)照組比較，BPA暴露組的小鼠6周的睪丸重量下降，且隨著BPA暴露劑量的增加，子代雄鼠的睪丸臟器系數(shù)下降愈加明顯，睪丸臟器系數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖1。

2.2 免疫組化法檢測(cè)睪丸組織β-catenin、DKK-1蛋白表達(dá)情況溶劑對(duì)照組中β-catenin、DKK-1蛋白表達(dá)很弱或幾乎不表達(dá)；BPA暴露組中β-catenin、DKK-1蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)，有劑量依賴趨勢(shì)，且陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞多位于近生精小管基膜的精原細(xì)胞和睪丸間質(zhì)細(xì)胞中。見圖2。通過(guò)Nikon 80i生物顯微攝像和分析系統(tǒng)觀察并計(jì)數(shù)（×400）每個(gè)視野βcatenin、DKK1蛋白表達(dá)數(shù)目。隨著BPA暴露劑量的增加，β-catenin、DKK-1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)逐漸增多，βcatenin、DKK-1蛋白陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)與溶劑對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖3。

2.3 Western blot法檢測(cè)睪丸組織β-catenin、DKK-1蛋白表達(dá)情況溶劑對(duì)照組中β-catenin、DKK-1蛋白較弱，隨著BPA暴露劑量的增加，βcatenin、DKK-1蛋白表達(dá)呈上升趨勢(shì)；BPA暴露組β-catenin／GAPDH、DKK-1／GAPDH與溶劑對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。見圖4。

3 討論

研究［5］顯示低劑量的BPA即對(duì)機(jī)體，包括胚胎發(fā)育、生殖、神經(jīng)與免疫系統(tǒng)等產(chǎn)生一定的影響。研究［2，6］表明，BPA能引起受試小鼠精子畸形率大幅增加，精子生成量明顯減少、發(fā)育過(guò)程嚴(yán)重障礙，且存在明顯的劑量依賴性。與對(duì)照組比較，睪丸系數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），臟器系數(shù)用來(lái)反映臟器的腫大或是縮小、增生或是萎縮等變化，即臟器質(zhì)量與體重的比值，在體重變化不是很顯著時(shí)，是對(duì)毒物導(dǎo)致臟器損傷的一個(gè)比較靈敏的指標(biāo)。本研究顯示，出生前后BPA染毒導(dǎo)致了小鼠的睪丸臟器系數(shù)下降，提示BPA對(duì)子代雄性小鼠生殖細(xì)胞有一定的毒性作用，不同染毒劑量BPA暴露組對(duì)子鼠睪丸臟器系數(shù)均有影響且影響不同，隨著BPA染毒劑量的增加，睪丸臟器系數(shù)呈下降趨勢(shì)。亦提示了BPA對(duì)小鼠的睪丸臟器的毒性有劑量依賴性。

BPA的作用機(jī)制多樣，Wnt／β-catenin信號(hào)通路是機(jī)體生長(zhǎng)和發(fā)育調(diào)節(jié)的一個(gè)重要的信號(hào)通路，其組成主要包括Wnt蛋白、β-catenin、Tcf／Lef核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子家族及其下游靶基因［7］。β-catenin是最早發(fā)現(xiàn)的黏附因子，是一種多功能的蛋白質(zhì)，主要位于細(xì)胞膜，其功能主要為介導(dǎo)細(xì)胞間黏附和參與基因的表達(dá)，廣泛存在于各型細(xì)胞中，參與細(xì)胞增殖、分化和凋亡［8］。在胚胎發(fā)育過(guò)程中，Wnt／β-catenin信號(hào)通路的下游靶基因多數(shù)為調(diào)控細(xì)胞周期的重要基因，在促進(jìn)胚胎背腹軸的形成、加強(qiáng)細(xì)胞極性建立、引導(dǎo)細(xì)胞命運(yùn)決定等多個(gè)環(huán)節(jié)中起重要作用［9］。誘導(dǎo)Wnt／β-catenin信號(hào)通路下游通路中的抑制劑骨形態(tài)蛋白（Bmps）和DKK-1蛋白表達(dá)，可誘導(dǎo)胚胎細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致出生缺陷［10］，故DKK-1是Wnt／βcatenin信號(hào)通路下游通路中重要蛋白。

BPA通過(guò)干擾血睪屏障，導(dǎo)致生精細(xì)胞粘附力降低，進(jìn)而導(dǎo)致生精細(xì)胞的功能障礙［1］。本研究顯示，β-catenin及DKK-1蛋白陽(yáng)性細(xì)胞主要位于精原細(xì)胞、睪丸間質(zhì)細(xì)胞及生精基膜附近的支持細(xì)胞等，影響雄性子鼠的血睪屏障，影響生精細(xì)胞粘附和生精細(xì)胞功能。β-catenin及DKK-1蛋白陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，在溶劑對(duì)照組中β-catenin蛋白表達(dá)較弱，BPA暴露組中β-catenin及DKK-1蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)，主要位于精原細(xì)胞和睪丸間質(zhì)細(xì)胞中，且隨著BPA劑量的增加，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)逐漸增多。表明Wnt／β-catenin信號(hào)通路參與了BPA染毒對(duì)子鼠雄性生殖細(xì)胞的生長(zhǎng)和發(fā)育，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步闡明。

（致謝：感謝安徽醫(yī)科大學(xué)毒理教研室沈彤博士在實(shí)驗(yàn)造模中給予的幫助）

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Proteins expression of β-catenin，DKK-1 in bisphenol A exposure before and after birth on male rat reproductive cells

Yang Xiaosi1，2，Liu Xiaoli1，Song Xianbing1，et al
（1Dept of Histology and Embryology，Anhui Medical University，Hefei 230032；2Dept of Human Anatomy，Anqing Medical College，Anqing 246052）

ObjectiveTo explore the proteins expression and significance of β-catenin，DKK-1 in bisphenol A （BPA）exposure before and after birth on male rat reproductive cells.MethodsICR infected pregnant rats drinking water from the conception 0 day（PGD0）were randomly divided into：BPA solvent control group，10 nmol／L，50 nmol／L，300 nmol／L BPA groups.Male young rats were killed in the 6th week（PGD42）after birth，β-catenin and DKK-1 protein expressions in testicular tissue were detected by immune-histochemical stained and Western blot.ResultsCompared with the solvent control group，testicular viscera coefficient in BPA exposure group young mice decreased.Compared with the solvent control group，β-catenin and DKK-1 protein expression in BPA exposure group significantly increased with immunohistochemical results and Western blot.ConclusionThe main proteins of β-catenin，DKK-1 in Wnt／β-catenin signaling pathway proteins may be involved in the BPA exposure before and after birth on male rat reproductive cells.

bisphenol A；β-catenin protein；DKK-1 protein；testicular germ cell

A

1000－1492（2015）07－0929－04

2015－03－22接收

安徽省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（編號(hào)：1208085MC53）；國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（編號(hào)：81373421）

1安徽醫(yī)科大學(xué)組胚教研室，合肥 230032

2安慶醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校解剖教研室，安慶 246052

楊小四，男，碩士研究生，講師；陳曉宇，男，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：chenxy＠ahmed.edu.cn

R 329.24