符天曉，周菊英，焦 旸

C57BL／6小鼠放射性心臟損傷
動(dòng)物模型的建立及血清標(biāo)志物的探討

符天曉1，周菊英1，焦 旸2

目的探討放射性心臟損傷動(dòng)物模型建立方法和相關(guān)血清標(biāo)志物。方法雌性C57BL／6小鼠28只，隨機(jī)分為3組：對照組（4只），18 Gy放療組（12只），25 Gy放療組（12只）。每周測小鼠體重，分別于照射后第0、8、16周，取心肌組織行HE染色，觀察心臟病理組織改變并進(jìn)行評分；采集下腔靜脈血檢測心肌肌鈣蛋白I（cTnI）。結(jié)果與對照組比較，放療組小鼠的體重開始呈下降趨勢后緩慢上升。放療組小鼠的心肌組織存在明顯的組織病理學(xué)改變，早期以急性炎癥為主，后期以進(jìn)行性纖維化為特征；隨著受照劑量的增加，炎性反應(yīng)和纖維化程度加重，病變時(shí)間提前。cTnI隨時(shí)間變化呈升高趨勢，和劑量大小、病理學(xué)表現(xiàn)均呈相關(guān)性。結(jié)論成功建立放射性心臟損傷動(dòng)物模型。cTnI可作為評價(jià)心臟損傷動(dòng)物模型的無創(chuàng)性指標(biāo)。

放射性心臟損傷；動(dòng)物模型；評價(jià)方法；肌鈣蛋白

1970年，F(xiàn)ajardo et al［1］首次證實(shí)射線能引起心臟損傷，自此放射性心臟疾?。╮adiation-induced heart disease，RIHD）這一名詞得以確定，該疾病越來越引起相關(guān)研究者的重視。胸部放射治療過程中不可避免地使一定體積的心臟組織受到照射，從而發(fā)生RIHD，多見的是遲發(fā)性心臟損傷［2－3］。臨床資料顯示，輕度RIHD表現(xiàn)為血清酶升高、心功能降低、心率失常及心電圖異常，重度為急慢性心包炎、心肌炎，最終導(dǎo)致心肌硬化和冠心病［4－5］。心臟已被公認(rèn)為是胸部放療的劑量限制器官之一［6］。該研究旨在建立C57BL／6小鼠放射性心臟損傷模型，并初步探索可靠的評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，為RIHD的臨床研究提供可靠的基礎(chǔ)研究依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雌性C57BL／6小鼠，SPF級，6 ～8周齡，體重18～22 g，購自蘇州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。在恒溫（22±2）℃、濕度（50±10）%、正常光照中適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 儀器及試劑 模擬定位機(jī)（荷蘭核通公司）；自制C57固定木板；1%戊巴比妥鈉（美國Sigma）；PRIMUS M型直線加速器（德國西門子公司）；強(qiáng)生vitros5600型全自動(dòng)生化分析儀（美國強(qiáng)生公司）。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組［7－8］將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨即分為3組：對照組4只（不做任何處理），18 Gy放療組12只，25 Gy放療組12只。

1.2.2 建立動(dòng)物模型 首先用1%戊巴比妥鈉1 ml進(jìn)行腹腔麻醉，待動(dòng)物麻醉成功后，利用自制木板固定小鼠，在模擬定位機(jī)下確定小鼠心臟輪廓。照射方法：機(jī)架角＝0°，6 MV能量的X射線采用源皮距（source skin distance，SSD）＝100 cm方法垂直照射。照射劑量：根據(jù)小鼠心臟大小及深度分別計(jì)算各劑量組所需出束劑量，具體公式為：Mu＝Dd× 100／PDD（r，d，SSD）×Sc（rc）×Sp（r）×Kc。其中腫瘤量（Dd）分別為18、25 Gy；查表可得百分深度量（PDD）、準(zhǔn)直器散射因子（Sc）、體模散射因子（Sp）；托架因子（Kc＝0.946）。照射結(jié)束待動(dòng)物麻醉清醒后送回動(dòng)物房，試驗(yàn)過程中無動(dòng)物死亡。

1.2.3 動(dòng)物模型的評價(jià) 觀察小鼠活動(dòng)、飲食、體重變化。小鼠于放療后每周稱重1次；分別于第8周、第16周處死小鼠，收集下腔靜脈抗凝全血測定心肌肌鈣蛋白I（cardiac troponin I，cTnI）。開胸取心臟（注意保留心房），用10%福爾馬林固定心臟，常規(guī)石蠟包埋切片后HE染色，光鏡下觀察心肌組織結(jié)構(gòu)，予病理評分。具體評分標(biāo)準(zhǔn)，0級：正常心肌結(jié)構(gòu)，心肌細(xì)胞無萎縮與肥大，無空泡，橫紋清晰，心肌排列整齊，心內(nèi)、外膜均無異常，血管和間質(zhì)無變化；1級：散在的單個(gè)心肌細(xì)胞表現(xiàn)為局部肌漿溶解和空泡，而鄰近的心肌細(xì)胞仍正常；2級：小至中等范圍的成簇心肌細(xì)胞表現(xiàn)有萎縮、肌漿溶解和空泡，可見小灶性心肌細(xì)胞壞死；3級：大范圍彌漫性心肌細(xì)胞萎縮、肌漿溶解或空泡，有較明顯的壞死。根據(jù)情況，可在1～2級，2～3級之間評分，如1.5、2.5等［9］。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 11.5軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以±s表示。多組間差異的比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）。

2 結(jié)果

2.1 體重及生長情況觀察與對照組比較，18 Gy放療組和25 Gy放療組小鼠的體重開始呈下降趨勢，1周后緩慢上升（圖1），小鼠在后期出現(xiàn)厭食、形體消瘦、心臟體表投影區(qū)域脫毛、活動(dòng)緩慢等現(xiàn)象；而對照組小鼠體重呈增長趨勢，飲食、活動(dòng)一切正常，皮毛柔順亮澤，小鼠未見死亡。

2.2 組織病理變化HE染色可見對照組小鼠心肌組織無滲出和充血水腫，肌纖維排列正常，結(jié)構(gòu)清晰（圖2A）。而18 Gy放療組的心肌組織病變初期（照射后8周）以炎性滲出為主，主要表現(xiàn)為心肌間充血水腫（圖2B）；25 Gy組伴有炎性細(xì)胞的浸潤，切片中尚見到一些無核的細(xì)胞，似脂肪細(xì)胞（圖2C）；照射16周后，18 Gy放療組小鼠的心肌組織以進(jìn)行性纖維化為特征，表現(xiàn)為心肌間隙增寬，肌纖維排列紊亂，橫紋不清晰，纖維蛋白滲出（圖2D）；25 Gy組出現(xiàn)局灶性心肌變性以及肌漿凝聚（圖2E）。

對照組心肌病理評分為0分，第8周18 Gy與25放療Gy組病理評分均上升。18 Gy放療組與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而25 Gy放療組與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。第16周，18 Gy、25 Gy放療組與對照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見表1。

表1 放射性心臟損傷小鼠病理評分表（±s）

表1 放射性心臟損傷小鼠病理評分表（±s）

與對照組比較：**P＜0.01

時(shí)間對照組（n＝4）18 Gy放療組（n＝12）25 Gy放療組（n＝12）第8周0.00±0.000.42±0.661.00±0.55**第16周0.00±0.001.33±0.41**2.08±0.38**

表2 放射性心臟損傷小鼠血清中cTnI含量（±s）

表2 放射性心臟損傷小鼠血清中cTnI含量（±s）

與對照組比較：*P＜0.05；與18 Gy放療組比較：＃P＜0.05

時(shí)間對照組（n＝4）18 Gy放療組（n＝12）25 Gy放療組（n＝12）第8周0.10±0.030.15±0.05*0.19±0.03*第16周0.11±0.030.25±0.04*0.32±0.03*＃

2.3 cTnI檢測結(jié)果在第8周和第16周，與對照組比較，放療組小鼠血清中cTnI含量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；在第8周，與18 Gy放療組比較，25 Gy放療組小鼠血清中cTnI含量升高，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表2）。在第16周，25 Gy放療組小鼠血清中cTnI含量最高，與18 Gy放療組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。研究顯示，小鼠血清中cTnI含量與放射劑量、時(shí)間均呈明顯的相關(guān)性，提示cTnI作為血清標(biāo)志物可用于評價(jià)放射性心臟損傷模型的程度。

3 討論

近年來，動(dòng)物模型的建立和應(yīng)用在研究RIHD的發(fā)病機(jī)制、病理生理學(xué)改變中起到重要的作用。目前，動(dòng)物模型建立的方法有很多，但是放射靶區(qū)確定、劑量選擇以及評判標(biāo)準(zhǔn)尚不明確。本試驗(yàn)在模擬定位機(jī)下觀察每只小鼠的心影、運(yùn)動(dòng)范圍，嚴(yán)格控制放療靶區(qū)為2.0 cm×1.5 cm，并根據(jù)射野定位片設(shè)計(jì)不規(guī)則擋鉛區(qū)域，物理師嚴(yán)格校準(zhǔn)加速器，精確計(jì)算劑量，使心臟得到精確照射。本研究中除心臟損傷外，周圍組織均正常，未發(fā)生炎癥和纖維化等病理改變，符合放射性心臟損傷動(dòng)物模型建立標(biāo)準(zhǔn)。

射線對心臟損傷的主要靶細(xì)胞是心肌間豐富的毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致炎癥、凝血與血栓、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化。這些反應(yīng)影響了冠狀動(dòng)脈的血流以及微循環(huán)對心肌的供血，從而引起放射性心臟損傷。白蘊(yùn)紅等［10］人以鈷60伽瑪射線30 Gy照射SD大鼠心臟，發(fā)現(xiàn)大鼠心臟呈三型改變：①變性滲出型：心肌充血、出血，心肌間有纖維蛋白滲出及炎性細(xì)胞浸潤，部分心肌細(xì)胞變性，局灶性肌漿凝聚，此型病變多見于照射后0.5和1個(gè)月，之后呈減輕、發(fā)生減少趨勢；②壞死型：多位于心內(nèi)膜下，心肌有點(diǎn)片狀壞死病灶，另外，尚見一些心肌細(xì)胞呈空泡狀，似脂肪細(xì)胞，此型變化最早見于單次照射30 Gy后2個(gè)月；③纖維化型：最早見于單次照射30 Gy后3個(gè)月，始見小的成纖維細(xì)胞團(tuán)，于照射后6個(gè)月，見心肌間局部纖維細(xì)胞增多和膠原纖維增生。本實(shí)驗(yàn)中病理學(xué)變化和以上研究結(jié)果相似。

心臟屬于晚反應(yīng)器官，傳統(tǒng)的心電圖改變往往出現(xiàn)較晚，發(fā)生時(shí)間為3～5年［11］。心肌細(xì)胞內(nèi)有大量的心肌酶，由于心肌細(xì)胞的缺血、壞死會導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性增加，使得各種酶釋放入血液，血清心肌酶升高。RIHD單次破壞心肌細(xì)胞數(shù)量較少，傳統(tǒng)心肌酶如肌酸激酶（creatine kinase，CK）、CK同工酶（CK-MB）敏感度不高；CK及CK-MB存在于心肌細(xì)胞胞質(zhì)外，還存在于骨骼肌細(xì)胞胞質(zhì)中，特異性不高。肌鈣蛋白僅存在于心肌細(xì)胞，是心肌損傷的特異性血清標(biāo)志物。當(dāng)心肌細(xì)胞受到損傷，肌鈣蛋白的血清濃度（3～6 h）可升高10～100倍，而CK、CKMB（3～8 h）僅升高2～20倍，肌鈣蛋白對診斷心肌損傷敏感性高。同時(shí)，肌鈣蛋白升高持續(xù)時(shí)間長達(dá)2～3周，而CK、CK-MB僅持續(xù)幾天，肌鈣蛋白診斷時(shí)間窗寬［12］。本實(shí)驗(yàn)選擇cTnI作為血清標(biāo)志物用于評價(jià)模型心臟損傷，具有特異性敏感性高、診斷時(shí)間窗寬等特點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)中取下腔靜脈血cTnI檢測，不同實(shí)驗(yàn)組cTnI檢測結(jié)果和放療劑量大小呈相關(guān)性；隨時(shí)間變化，檢驗(yàn)結(jié)果和心臟的晚反應(yīng)病理變化特點(diǎn)相吻合。

綜上所述，以C57BL／6小鼠心臟作為靶區(qū)精確放療，單次劑量25 Gy，放療后16周可成功建立放射性心臟損傷小鼠模型，可用于放射性心臟損傷疾病研究。病理切片及評分可作為評價(jià)建模成功與否的標(biāo)準(zhǔn)，cTnI可作為無創(chuàng)性方法用來評價(jià)動(dòng)物模型。

［1］ Fajardo L F，Stewart J R.Experimental radiation-induced heart disease.1.Light microscopic studies［J］.Am J Pathol，1970，59（2）：229－316.

［2］ Gustavsson A，Osterman B，Cavallin-St?hl E.A systematic over view of radiation therapy effects in Hodgkin’s lymphoma［J］.Acta Oncol，2003，42（5－6）：605－19.

［3］ Giraud P，Cosset J M.Radiation toxicity to the heart：physiopathology and clinical data［J］.Bull Cancer，2004，91 Suppl 3：147－53.

［4］ 李興鳳.放射性心臟損傷10例臨床分析［J］.山東醫(yī)藥，2007，47（26）：108－10.

［5］ 郭兆嬌，楊 林.放射治療導(dǎo)致心臟損害及其檢測與防護(hù)［J］.安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，49（9）：1353－4.

［6］ Stewart J R，F(xiàn)ajardo L F.Radiation-induced heart disease：an update［J］.Prog Cardiovase Dis，1984，27（3）：173－94.

［7］ 徐久宏，高耀明，張軍寧，等.大鼠心臟放射損傷對內(nèi)皮素-1和心肌肌鈣蛋白I表達(dá)水平的影響［J］.蘇州大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，31 （3）：354－6.

［8］ 呂 鵬，臧愛民.血清肌鈣蛋白I在放射性心臟損傷中的變化及右丙亞胺對其影響［J］.長治醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2013，27（2）：94－6.

［9］ 周明東.神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白用于心血管疾病治療的方法和組合物［P］.中國專利CN 101007027 A：2007－08－01.

［10］白蘊(yùn)紅，王德文.大鼠放射性心臟的病理學(xué)觀察［J］.中華放射醫(yī)學(xué)與防護(hù)雜志，1994，14（5）：329－30.

［11］Allavena C，Conroy T，Aletti P.Late cardiopulmonary toxicity after treatment for Hodgkin’s disease［J］.Br J Cancer，1992，65（6）：908－12.

［12］郭 瑋，潘柏申.心肌肌鈣蛋白－心肌損傷的確定生化標(biāo)志物［J］.上海醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)雜志，2000，15（1）：81－3.

Establishment of irradiation induced heart injury in C57 mice model and identification of serum marker

Fu Tianxiao1，Zhou Juying1，Jiao Yang2
（1Dept of Oncological Radiotherapy，The First Affiliated Hospital of Soochow University，2School of Radiation Medicine and Public Health of Soochow University，Suzhou 215006）

ObjectiveTo establish and investigate C57BL／6 mice model of radiation induced heart injury and serum marker.MethodsTwenty eight female C57BL／6 mice were randomly divided into 3 groups：normal group（n ＝4），18 Gy radiation therapy group（n＝12），25 Gy radiation therapy group（n＝12）.The mice were weighed every week.Respectively，0，8 and 16 weeks after irradiation，the pathological changes of myocardial tissue were observed by hemetoxylin-eosin（HE）staining and made pathological score.Inferior vena cava blood was collected to take cardiac troponin I（cTnI）test.ResultsCompared with the normal group，the weight of radiation group went down first then went up slowly.The myocardial tissue from mice had obvious histopathological changes.Acute inflammation was the main change in the early days.At the late stage，progressive fibrosis was the main characteristic.With the increase of the dose，the inflammatory reaction and fibrosis degree had aggravated，pathological changes had occurred earlier.cTnI showed a trend of higher performance over time，and had a correlation with pathology.ConclusionWe successfully established radiation induced myocaridal injury model.As a noninvasive serum marker，cTnI can be used as the evaluation standard of radiation induced myocardial injury animal model.

radiation induced heart injury；animal model；evaluation method；cardiac troponin I

Q 95-3；R 818.74

A

1000－1492（2015）07－0922－04

2015－03－20接收

國家青年自然基金項(xiàng)目（編號：81302382）

蘇州大學(xué)1附屬第一醫(yī)院腫瘤放療科、2放射醫(yī)學(xué)與公共衛(wèi)生學(xué)院，蘇州 215006

符天曉，男，主管技師；焦 旸，女，副教授，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：jiaoyang＠suda.edu.cn