王 喆，吳永貴，章超群，武曉旭，徐興欣，王 坤

白芍總苷對(duì)糖尿病大鼠腎組織Txnip、Trx與ASK1表達(dá)的調(diào)節(jié)作用

王 喆，吳永貴，章超群，武曉旭，徐興欣，王 坤

目的了解白芍總苷（TGP）對(duì)糖尿病大鼠腎組織硫氧還蛋白相互作用蛋白（Txnip）、硫氧還蛋白（Trx）與凋亡信號(hào)激酶1（ASK1）表達(dá)的影響，探討TGP對(duì)糖尿病腎組織Trx系統(tǒng)調(diào)節(jié)作用。方法將鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)的糖尿病大鼠隨機(jī)分為模型組、TGP［50、100、200 mg／（kg·d）］給藥組，另取正常大鼠為對(duì)照組，8周后測(cè)定大鼠尿白蛋白排泄率（UAER）。應(yīng)用免疫組化、Western blot法及實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)大鼠腎組織Txnip、Trx與ASK1表達(dá)。結(jié)果實(shí)驗(yàn)8周后TGP［50、100、200 mg／（kg·d）］給藥組及對(duì)照組大鼠UAER水平均低于模型組（P＜0.01）；免疫組化和（或）Western blot法顯示TGP［50、100、200 mg／（kg·d）］給藥組及對(duì)照組大鼠腎組織Txnip、ASK1表達(dá)低于模型組（P＜0.05，P ＜0.01），而Trx高于模型組（P＜0.05，P＜0.01）；實(shí)時(shí)定量PCR顯示TGP［50、100、200 mg／（kg·d）］給藥組及對(duì)照組Txnip mRNA低于模型組（P＜0.01，P＜0.05），Trx mRNA高于模型組（P＜0.01，P＜0.05）。結(jié)論糖尿病腎病大鼠腎組織存在Trx系統(tǒng)異常，TGP對(duì)糖尿病大鼠腎組織保護(hù)作用可能與抑制Txnip表達(dá)、提高Trx表達(dá)有關(guān)。

糖尿病腎?。涣蜓踹€蛋白；ASK1；白芍總苷

研究［1］表明氧化應(yīng)激參與糖尿病腎病的發(fā)生及發(fā)展。硫氧還蛋白（thioredoxin，Trx）系統(tǒng)是機(jī)體一種對(duì)抗氧化應(yīng)激、維持氧化還原反應(yīng)的平衡系統(tǒng)。Trx是細(xì)胞內(nèi)主要的抗氧化劑，其作用在于減少活性氧生成，另外其還原形式可抑制凋亡信號(hào)激酶1 （apoptosis signal-regulating kinase 1，ASK1）的活性，從而抑制ASK1依賴性的凋亡。Trx相互作用蛋白（thioredoxin-interacting protein，Txnip）作為Trx功能和表達(dá)的負(fù)性調(diào)節(jié)因子，下調(diào)Trx表達(dá)，其平衡紊亂可導(dǎo)致氧化還原體系的失調(diào)，進(jìn)而加劇氧化應(yīng)激［2］。白芍總苷（total glucosides of paeony，TGP）是一種從白芍干燥根中提取的有效物質(zhì)，主要作用有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)與抗炎［3］。研究［4］表明TGP對(duì)糖尿病腎病有明顯保護(hù)作用，其機(jī)制部分與抗氧化應(yīng)激有關(guān)，但其對(duì)于Trx系統(tǒng)的作用尚不明確，該研究進(jìn)一步觀察TGP對(duì)糖尿病大鼠腎組織Trx、Txnip及ASK1表達(dá)的影響，旨在探討TGP對(duì)糖尿病腎組織Trx系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 Munich-Wistar大鼠50只，由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，昆明種，體重180～200 g。

1.1.2 藥品與試劑 TGP由安徽醫(yī)科大學(xué)臨床藥理研究所魏教授贈(zèng)予，使用前先將TGP溶于1%的羧甲基纖維素鈉溶液中；鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）（美國(guó)Sigma公司）；尿白蛋白測(cè)定試劑盒（法國(guó)SPI公司）；Trx、Txnip、內(nèi)參GAPDH引物及探針（上海生工公司）；M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑（美國(guó)Promega公司）；Tag酶及MgCl2（美國(guó)Roche公司）；TRIzol試劑（美國(guó)Life Technologies公司）；Txnip、Trx及ASK1多克隆抗體（美國(guó)Santa Cruz公司）；辣根酶標(biāo)記山羊抗兔／小鼠IgG（武漢博士德公司）；免疫組化檢測(cè)試劑盒（PV-9000）、DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；SDSPAGE蛋白上樣緩沖液（5×）、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒及BCA蛋白定量試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)研究所）；ECL增強(qiáng)發(fā)光試劑盒（美國(guó)Thermo Scientific公司）；硝酸纖維膜（美國(guó)Amersham公司）。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物飼養(yǎng)條件 實(shí)驗(yàn)前所有大鼠于12 h光照、12 h黑暗的光照周期、室溫（22±2）℃、相對(duì)濕度（55±5）%環(huán)境中適應(yīng)飼養(yǎng)1周。實(shí)驗(yàn)期間正常飲食，每日更換敷料，不應(yīng)用胰島素，觀察8周。

1.2.2 動(dòng)物分組及模型制備 將適應(yīng)飼養(yǎng)1周的實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)均等分成：對(duì)照組、模型組、TGP 50 mg／（kg·d）給藥組、TGP 100 mg／（kg·d）給藥組、TGP 200 mg／（kg·d）給藥組。STZ用前先將其溶于0.01 mmol／L枸櫞酸緩沖液中，使其pH達(dá)到4.5；模型組及TGP給藥組大鼠腹腔一次性注射STZ 65 mg／kg，對(duì)照組則注射等量枸櫞酸緩沖液。48～72 h后于尾靜脈采血，應(yīng)用血糖儀測(cè)定全血血糖，血糖在16.7 mmol／L以上者確定為糖尿病模型。

1.2.3 標(biāo)本收集 大鼠處死前1 d用代謝籠準(zhǔn)確收集24 h尿液，3 000 r／min離心10 min后分裝，放置于－80℃冰箱中保存，待測(cè)尿白蛋白含量。使用戊巴比妥對(duì)大鼠進(jìn)行腹腔注射麻醉，從右側(cè)頸總動(dòng)脈插管，向管中注入生理鹽水反復(fù)灌洗腎臟，至整個(gè)腎臟顏色變蒼白后去除包膜，并置于冰上，取8 mm3大小腎組織，置于4%多聚甲醛溶液中固定，進(jìn)行免疫組化研究，剩余腎組織分割成均等大小后分裝到凍存管中，迅速轉(zhuǎn)移至液氮中以備Western blot及實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)。

1.2.4 尿白蛋白排泄率（urinary albumin excretion rate，UAER）測(cè)定 采用ELISA法測(cè)定尿白蛋白含量，UAER＝尿白蛋白含量×24 h尿量。

1.2.5 實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定Txnip及Trx的表達(dá)使用TRIzol法提取腎組織總RNA，One-Drop核酸蛋白紫外分析儀檢測(cè)RNA質(zhì)量和濃度，并要求吸光度（absorbance，A）值A(chǔ)260／A280為1.8～2.0，并調(diào)整RNA濃度至1 mg／L。Txnip上游引物：5′-TCAGTCAGAGGCAATCACATTA-3′，下游引物：5′-GGAGCCAGGGACACTAACATAG-3′；Trx上游引物：5′-CCTTCTTTCATTCCCTCTGTGA-3′，下游引物：5′-CCCAACCTTTTGACCCTTTTTA-3′；GAPDH上游引物：5′-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3′，下游引物：5′-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3′。使用Bio-Rad SYBR Green PCR試劑盒進(jìn)行PCR檢測(cè)，在Bio-Rad Real-Time PCR擴(kuò)增儀中進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄及PCR反應(yīng)，每個(gè)樣本均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，計(jì)算平均Ct值，按照2－ΔΔCt計(jì)算目的基因表達(dá)值。

1.2.6 免疫組化測(cè)定Txnip、Trx及ASK1的表達(dá)大鼠腎組織經(jīng)甲醛溶液固定及石蠟包埋后制成2 μm厚度的切片，并經(jīng)多聚賴氨酸處理，將石蠟切片常規(guī)脫蠟，滴加3%過(guò)氧化氫溶液以抑制內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，放置于室溫下孵育15 min。沖洗甩干后浸泡于檸檬酸鹽緩沖液中，并使用微波爐高火加熱10～15 min以修復(fù)表面抗原，PBS沖洗后加入山羊血清封閉，37℃孵育30 min，再分別滴加兔抗大鼠Trx多克隆抗體（1∶100）、山羊抗大鼠Txnip多克隆抗體（1∶200）、兔抗大鼠ASK1多克隆抗體（1∶100），使用PBS作為陰性對(duì)照組，后放置于4℃冰箱中過(guò)夜，第2天，將切片放入37℃溫箱中孵育30 min復(fù)溫，PBS沖洗甩干后滴加聚合物增強(qiáng)劑，37℃孵育20 min，PBS沖洗后加入辣根酶標(biāo)記山羊抗兔／小鼠IgG多聚體，30℃孵育30 min，PBS沖洗甩干后應(yīng)用DAB顯色。腎小球免疫組化結(jié)果按半定量分析法評(píng)分，按染色面積計(jì)分：微弱或無(wú)染色為0分，染色面積＜25%為1分，染色面積25%～50%為2分，染色面積51%～75%為3分，染色面積＞75% 為4分。腎小管－間質(zhì)區(qū)使用圖像分析軟件，進(jìn)行陽(yáng)性目標(biāo)分割編輯后測(cè)算陽(yáng)性面積占腎小管－間質(zhì)百分比，取均值。

1.2.7 Western blot法檢測(cè)ASK1及Txnip的蛋白表達(dá) 取100 mg腎組織及苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonylfluorid，PMSF）放入勻漿器中，冰上充分研磨后4℃、12 000 r／min離心30 min，取上清液放入EP管中，并用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定總蛋白含量。取30 μg蛋白與SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（5×）按4∶1比例混勻，置于100℃水浴5 min，使蛋白變性，10 000 r／min，離心1 min，取出上清液放入EP管中，按照SDS-PAGE凝膠配制試劑盒說(shuō)明書配制6%～15%PAGE膠，上樣后先用電壓55 V，約45 min，待蛋白電泳至濃縮膠與分離膠交界處時(shí)改用電壓110 V，約60～90 min。再將蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜上，提前將脫脂奶粉5 g、PBST 100 ml配制成封閉液，將NC膜放入封閉液中，放在搖床上室溫封閉2 h。洗膜后加入免抗大鼠Txnip（1∶100）；ASK1（1∶100）和β-actin（1∶500）4℃過(guò)夜，洗膜后放入辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的羊抗兔／鼠二抗（1 ∶5 000）中孵育，37℃，1 h。洗膜后使用ECL發(fā)光試劑化學(xué)顯色后曝光并顯影，使用Image J圖象分析系統(tǒng)測(cè)定條帶灰度值。β-actin作為內(nèi)參，取其余組與其比值，計(jì)算均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析，正態(tài)分布資料的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用±s表示，腎小球免疫組化評(píng)分為非正態(tài)分布資料，用中位數(shù)表示。由于UAER為非正態(tài)分布資料，故先采用對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后，再用幾何均數(shù)×（÷）耐受因子表示。參數(shù)資料采用單因素方差分析檢驗(yàn)。非參數(shù)資料采用Krustal-Wallis秩和檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠UAER的變化實(shí)驗(yàn)8周后對(duì)照組、模型組、模型＋TGP 50 mg／（kg·d）給藥組、TGP 100 mg／（kg·d）給藥組、TGP 200 mg／（kg·d）給藥組的UAER水平分別為0.38×（÷）1.3、1.87× （÷）1.1、1.32×（÷）1.1、1.15×（÷）1.1、0.65× （÷）1.1，實(shí)驗(yàn)顯示模型組大鼠UAER明顯高于對(duì)照組（P＜0.01），而TGP 50、100 mg／（kg·d）給藥組及TGP 200 mg／（kg·d）給藥組均低于模型組（F ＝5.41，P＜0.05，P＜0.01）。

2.2 各組大鼠腎組織Txnip表達(dá)的變化對(duì)照組、模型組、TGP 50 mg／（kg·d）給藥組、TGP 100 mg／（kg·d）給藥組、TGP 200 mg／（kg·d）給藥組腎小球Txnip表達(dá)按染色面積計(jì)分，評(píng)分分別為0（0～1）、2（2～3）、1.5（1～2）、1（0～1）、0.5（0～1），結(jié)果顯示模型組腎小球Txnip表達(dá)明顯高于對(duì)照組（P ＜0.01），TGP 50 mg／（kg·d）及TGP 100、200 mg／（kg·d）給藥8周大鼠腎小球Txnip表達(dá)低于模型組（H＝35.231，P＜0.05，P＜0.01），見圖1。Western blot法顯示模型組腎組織Txnip蛋白表達(dá)明顯高于對(duì)照組（P＜0.01），與模型組比較，TGP 50、100、200 mg／（kg·d）給藥8周腎組織Txnip蛋白表達(dá)明顯降低（F＝30.55，P＜0.05），見圖2。實(shí)時(shí)定量PCR顯示模型組腎組織Txnip mRNA表達(dá)高于對(duì)照組（P＜0.01）。TGP 50、100、200 mg／（kg·d）給藥8周腎組織Txnip mRNA表達(dá)低于模型組（F＝111.582，P＜0.05），見圖3。

2.3 各組大鼠腎組織Trx表達(dá)的變化免疫組化顯示模型組Trx在腎小球及腎小管－間質(zhì)的表達(dá)明顯低于對(duì)照組（P＜0.01），TGP 50、100、200 mg／（kg ·d）給藥8周大鼠腎小球中Trx表達(dá)高于模型組（H＝20.245，P＜0.01），TGP 50、100、200 mg／（kg· d）給藥組大鼠腎小管－間質(zhì)中Trx表達(dá)也明顯高于模型組（F＝19.446，P＜0.05，P＜0.01）。見表1、圖4。實(shí)時(shí)定量PCR顯示模型組腎組織Trx mRNA表達(dá)明顯低于對(duì)照組（P＜0.01），TGP 50、100、200 mg／（kg·d）給藥8周腎組織Trx mRNA表達(dá)高于模型組（F＝14.377，P＜0.05），見圖5。

表1 各組大鼠腎組織免疫組化指標(biāo)Trx變化（n＝10，±s）

表1 各組大鼠腎組織免疫組化指標(biāo)Trx變化（n＝10，±s）

a腎小球評(píng)分為非參數(shù)資料，用中位數(shù)表示；與對(duì)照組比較：**P＜0.01；與模型組比較：＃P＜0.05，＃＃P＜0.01

組別劑量［mg／（kg·d）］腎小球a（評(píng)分）腎小管－間質(zhì)（%）對(duì)照－2（1～2）25.31±4.01模型－0（0～1）**11.81±3.64**TGP給藥501（0～2）15.65±4.08＃1001（1～2）＃＃19.16±2.15＃＃2001（1～2）＃＃20.17±3.91＃＃

2.4 各組大鼠腎組織ASK1表達(dá)的變化免疫組化顯示模型組ASK1在腎小球及腎小管－間質(zhì)的表達(dá)明顯高于對(duì)照組（P＜0.01），TGP 50、100、200 mg／（kg·d）給藥8周大鼠腎小球中ASK1表達(dá)低于模型組（H＝26.034，P＜0.05，P＜0.01），腎小管－間質(zhì)中ASK1表達(dá)也低于模型組（F＝32.464，P ＜0.05，P＜0.01）。見表2、圖6。Western blot法顯示模型組腎組織ASK1蛋白表達(dá)明顯高于對(duì)照組（P ＜0.01），TGP 50、100、200 mg／（kg·d）給藥8周腎組織ASK1蛋白表達(dá)明顯低于模型組（F＝2 214.085，P＜0.05），見圖7。

表2 各組大鼠腎組織ASK1免疫組化指標(biāo)變化（n＝10，±s）

表2 各組大鼠腎組織ASK1免疫組化指標(biāo)變化（n＝10，±s）

a腎小球評(píng)分為非參數(shù)資料，用中位數(shù)表示；與對(duì)照組比較：**P＜0.01；與模型組比較：＃P＜0.05，＃＃P＜0.01

組別劑量［mg／（kg·d）］腎小球a（評(píng)分）腎小管－間質(zhì)（%）對(duì)照－0.5（0～1）2.54±0.63模型－2.5（1～3）**8.48±1.91**TGP給藥502（0～2）＃6.79±1.43＃1001（1～2）＃＃6.44±1.26＃＃2001（0～2）＃＃4.06±0.92＃＃

3 討論

在高血糖或糖尿病腎病時(shí)，體內(nèi)產(chǎn)生的大量活性氧自由基明顯超過(guò)機(jī)體正常的清除能力，未能清除的活性氧自由基則可激活體內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路或細(xì)胞因子，引起腎組織的損傷。為了維持細(xì)胞內(nèi)外氧化還原平衡狀態(tài)，細(xì)胞本身存在一個(gè)調(diào)節(jié)系統(tǒng)Trx系統(tǒng)，Trx可清除氧自由基對(duì)抗氧化應(yīng)激，Trx還可與細(xì)胞內(nèi)的一種重要的促凋亡蛋白ASK1結(jié)合，從而抑制ASK1活性。Txnip也被稱作Trx結(jié)合蛋白2（TBP-2）及維生素D3上調(diào)蛋白（VDVP-1），高糖是Txnip最主要的生理性刺激物，Txnip通過(guò)與ASK1競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合Trx，導(dǎo)致了ASK1從Trx-ASK1復(fù)合物中釋放出來(lái)，游離的ASK1隨后激活下游的c-Jun氨基端激酶（JNK）和絲裂原活化蛋白激酶p38 （p38 MAPK），誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，p38 MAPK反過(guò)來(lái)可促進(jìn)Txnip表達(dá)，加重氧化應(yīng)激反應(yīng)，促進(jìn)糖尿病腎病進(jìn)展。

研究［5］顯示在糖尿病腎病大鼠造模成功4周時(shí)，模型組中Txnip mRNA和蛋白水平均明顯增高，說(shuō)明在糖尿病腎病的早期已有Txnip的增高。實(shí)驗(yàn)［6］顯示Trx在糖尿病大鼠腎臟組織的表達(dá)較正常組明顯減少，而Txnip明顯升高。研究［7］顯示Trx在正常大鼠腎組織中表達(dá)較高，在模型組中表達(dá)降低。本研究顯示，與對(duì)照組比較，模型組腎組織中Txnip表達(dá)明顯升高、Trx表達(dá)降低，與上述文獻(xiàn)報(bào)道一致。Saitoh et al［8］發(fā)現(xiàn)Trx可與ASK1的N-末端結(jié)合，形成蛋白－蛋白復(fù)合物，抑制ASK1活性。本研究提示糖尿病腎組織ASK1表達(dá)明顯增加，提示Trx系統(tǒng)與凋亡在糖尿病腎病發(fā)病中起重要作用。

白芍系毛莨科植物，有多種生理與藥理活性，研究［9－10］顯示TGP可通過(guò)抑制糖尿病大鼠腎組織前炎癥介質(zhì)的過(guò)度表達(dá)及減少氧化應(yīng)激，發(fā)揮其保護(hù)腎臟的作用并且TGP有不依賴降低血糖、血脂水平的DN保護(hù)作用，無(wú)明顯毒副作用。但其對(duì)于腎組織Trx系統(tǒng)的影響尚不明確，研究［11］表明在高糖環(huán)境下抑制p38 MAPK通路能顯著降低Txnip表達(dá)，研究［12］顯示TGP可顯著降低糖尿病腎病大鼠腎組織中p38 MAPK的表達(dá)，影響p38 MAPK信號(hào)通路的激活。本研究表明TGP可使糖尿病大鼠的UAER明顯降低，與模型組比較，TGP給藥組Txnip及ASK1明顯降低，而Trx表達(dá)明顯增加，因而，TGP的抗氧化應(yīng)激作用可能與調(diào)節(jié)Trx系統(tǒng)有關(guān)，TGP可能通過(guò)抑制p38 MAPK通路，使Txnip水平降低、Trx水平增加進(jìn)而降低ASK1水平，發(fā)揮其抗氧化應(yīng)激效應(yīng)，從而保護(hù)糖尿病腎病，并延緩糖尿病腎病進(jìn)展，但TGP作用于Trx系統(tǒng)的具體機(jī)制尚不明確，待進(jìn)一步研究。

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Effect of total glucosides of paeony on the expression of Txnip，Trx and ASK1 in the kidney from diabetic rats

Wang Zhe，Wu Yonggui，Zhang Chaoqun，et al
（Dept of Nephropathy，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022）

ObjectiveTo research effect of total glucosides of paeony（TGP）on the expression of thioredoxin-interacting protein（Txnip），thioredoxin（Trx）and apoptosis signal-regulating kinase 1（ASK1）investigate role of TGP on thioredoxin system in the kidney from diabetic rats.MethodsDiabetes rats induced with streptozotocin were randomly divided into model group which was treated with TGP［50，100，200 mg／（kg·d），for 8 weeks］；besides，use normal rats as control group.24 h urinary albumin excretion rate（UAER）was determined with ELISA. Txnip，Trx and ASK1 were measured with immunohischemistry，Western blot and real-time PCR.ResultsElevated 24 h UAER was obviously decreased by TGP treatment with 50，100，200 mg／（kg·d）.Compared with diabetic rats，analysis of the immunohischemistry and／or Western blot showed the expression of Txnip and ASK1 was decreased in TGP treatment with 50，100，200 mg／（kg·d）（P＜0.01），and the expression of Trx was increased（P ＜0.01）.Real-time PCR analysis showed that Txnip mRNA expression in diabetic rats was also significantly inhibited by TGP（P＜0.05），and that Trx mRNA was markedly increased by TGP（P＜0.05）.ConclusionThere is an abnormity occuring in the thioredoxin system in the renal tissue of diabetic rats.TGP obviously has the function of renal protection，and its mechanism may be related to the inhibition of Txnip expression and the enhancement of Trx expression.

diabetic nephropathy；thioredoxin；ASK1；total glucosides of paeony

R 587.24

A

1000－1492（2015）07－0916－06

2015－03－10接收

國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：81270813、81374034）；安徽省自然科學(xué)基金（編號(hào)：1208085MH149）

安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，合肥 230022

王 喆，女，碩士研究生；吳永貴，男，博士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：wuyonggui＠m(xù)edmail.com.cn