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        二乙基亞硝胺誘導(dǎo)的肝癌小鼠TGF-βⅢ型受體的表達(dá)

        2015-06-01 09:43:53孫嫵弋谷元婧魏偉
        關(guān)鍵詞:造模孵育肝細(xì)胞

        張 森,孫嫵弋,谷元婧,魏偉

        二乙基亞硝胺誘導(dǎo)的肝癌小鼠TGF-βⅢ型受體的表達(dá)

        張 森,孫嫵弋,谷元婧,魏偉

        目的觀察轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF-β)Ⅲ型受體(TβRⅢ)在二乙基亞硝胺(DEN)誘導(dǎo)的肝細(xì)胞癌(HCC)模型小鼠中的表達(dá)及其信號(hào)通路的變化。方法C57BL/6J小鼠腹腔注射DEN建立HCC小鼠模型;HE染色法觀察小鼠肝臟病理變化;ELISA法檢測(cè)小鼠肝臟組織中TGF-β1的水平;Western blot法檢測(cè)肝臟組織TβRⅢ、p-Smad2及Smad2蛋白的表達(dá)變化。結(jié)果HE染色結(jié)果顯示,對(duì)照組小鼠肝細(xì)胞大小形態(tài)正常,肝小葉結(jié)構(gòu)完整,隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng),模型組小鼠肝小葉逐漸被破壞,肝細(xì)胞異常增生,出現(xiàn)病理核分裂,HCC結(jié)節(jié)形成。在DEN誘導(dǎo)的HCC模型小鼠中,隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng),肝臟TGF-β1的水平明顯升高,TβRⅢ蛋白的表達(dá)降低,p-Smad2蛋白的表達(dá)升高,而Smad2蛋白的表達(dá)沒有明顯變化。結(jié)論TβRⅢ表達(dá)的降低可能與HCC的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

        TβRⅢ;TGF-β1;肝細(xì)胞癌;二乙基亞硝胺

        肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是臨床上常見的惡性程度高、預(yù)后較差且死亡率高的腫瘤之一[1]。外科HCC切除術(shù)、射頻消融治療和肝臟移植術(shù)雖然提高了患者的生存率,但是由于HCC的肝內(nèi)播散和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,導(dǎo)致其預(yù)后較其它惡性腫瘤差[2-3]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factorβ,TGF-β)是由結(jié)構(gòu)相近、功能類似的多肽組成的細(xì)胞因子,主要包括TGF-β、激活素、抑制素等。目前研究[4]表明,TGF-β/Smad信號(hào)通路不僅在胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖和分化等過程中發(fā)揮重要作用,也與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系。TGF-βⅢ型受體(type ⅢTGF-β receptor,TβRⅢ)是TGF-β家族中的輔助性受體,調(diào)控TGF-β與受體的結(jié)合以及信號(hào)通路的激活。研究[5-8]顯示,在乳腺癌、前列腺癌和非小細(xì)胞肺癌等腫瘤的發(fā)展進(jìn)程中,TβRⅢ表達(dá)降低甚至缺失。在HCC發(fā)展過程中,TβRⅢ表達(dá)是否發(fā)生變化,TGF-β信號(hào)通路又是否受到影響尚不清楚。該研究通過建立二乙基亞硝胺(diethylnitrosamine,DEN)誘導(dǎo)的HCC小鼠模型[9],觀察TβRⅢ在HCC中的表達(dá)以及TGF-β信號(hào)的變化。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 C57BL/6J小鼠,48只,雄性,2周齡,清潔級(jí),購(gòu)自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。在恒溫22℃、光照周期12 h環(huán)境中飼養(yǎng),造模過程中死亡4只。

        1.1.2 主要試劑 抗TβRⅢ抗體(英國(guó)Abcam公司);抗Smad2、p-Smad2和β-actin抗體(美國(guó)Bioworld公司);ELISA試劑盒(深圳達(dá)科為生物技術(shù)有限公司);DEN(美國(guó)Sigma公司);PVDF微孔轉(zhuǎn)移膜(美國(guó)Millipore公司);5×電泳加樣緩沖液、RIPA蛋白裂解液、苯甲基磺酰氯(phenylmethyl sulfonyl fluoride,PMSF)(江蘇碧云天公司)。

        1.1.3 主要儀器與設(shè)備 LAS400Mini型化學(xué)發(fā)光成像分析儀(美國(guó)GE公司);IX-70熒光倒置顯微鏡(日本Olympus公司);ELx50型洗板機(jī)、ELx808型酶標(biāo)儀(美國(guó)BioTek公司);3-30K低溫高速離心機(jī)(美國(guó)Sigma公司)。

        1.2 方法

        1.2.1 DEN誘導(dǎo)的C57BL/6J小鼠HCC模型的制備、分組及處理 出生后14 d的C57BL/6J小鼠,隨機(jī)分為對(duì)照組和模型組,每組8只,腹腔注射DEN 20 μg/g體重,以誘導(dǎo)小鼠肝臟腫瘤的發(fā)生。分別于注射DEN后8、16、24、32、40周處死小鼠,摘取部分肝臟組織放入EP管中,-80℃保存待測(cè),另取一小塊肝臟組織經(jīng)10%甲醛溶液固定,做病理檢測(cè)。

        1.2.2 肝臟組織病理學(xué)檢查 取出肝臟,用冷生理鹽水洗去浮血,取肝組織小塊,厚度不超過0.5 cm,立即用10%甲醛溶液固定24 h。70%、80%、90%、100%乙醇溶液脫水,二甲苯透明,石蠟包埋,Lecia石蠟切片機(jī)切片,常規(guī)脫蠟,HE染色,中性樹脂封片后,OLYMPUS顯微鏡下觀察。

        1.2.3 ELISA法檢測(cè)小鼠肝臟組織中TGF-β1的表達(dá) 每50 mg肝臟組織加入500 μl生理鹽水,勻漿器中充分研磨,離心提取上清液。加樣前將待測(cè)樣品活化,待測(cè)樣品孔及各濃度標(biāo)準(zhǔn)品孔中,每孔加入100 μl,空白對(duì)照孔中加入100 μl稀釋緩沖液(1×),37℃孵育1.5 h,充分洗滌,加入100 μl生物素標(biāo)記一抗,37℃孵育1.5 h,充分洗滌,加入親和素一辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗100 μl,37℃孵育30 min,充分洗滌后,加入四甲基聯(lián)苯胺顯色液100 μl,37℃避光孵育15 min后,每孔加入終止液100 μl,終止反應(yīng),使用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔450 nm處吸光度。

        1.2.4 肝組織蛋白的提取 裂解液配制:RIPA和蛋白酶抑制劑PMSF的比例為100∶1。肝組織放入勻漿器中按500 μl/50 mg組織加入裂解液研磨,轉(zhuǎn)入離心管中4℃離心,14 000 r/min離心20 min后吸取上清液,得到總蛋白。

        1.2.5 Western blot法檢測(cè)肝臟組織中TβRⅢ、p-Smad2以及Smad2的表達(dá) 肝臟組織裂解液處理后提取總蛋白,經(jīng)BCA蛋白定量試劑盒定量后,每泳道上等量蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳,在轉(zhuǎn)移液中,以200 mA電流轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。封閉2 h后,加入抗TβRⅢ、p-Smad2及Smad2抗體,4℃孵育過夜。洗滌后,繼以辣根過氧化物酶結(jié)合的二抗室溫孵育2 h,ECL試劑盒顯色。用ImageJ圖像處理軟件分析計(jì)算蛋白印跡值,將β-actin作為內(nèi)參,用目的條帶與β-actin條帶灰度值的比值作為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

        1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析,數(shù)據(jù)以±s表示。采用單因素方差分析比較各組間差異。

        2 結(jié)果

        2.1 DEN誘導(dǎo)的HCC小鼠肝臟病理變化HE染色顯示,對(duì)照組小鼠肝臟組織無明顯變化,肝細(xì)胞大小形態(tài)正常,肝小葉結(jié)構(gòu)完整;隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng),肝小葉結(jié)構(gòu)逐漸被破壞,肝細(xì)胞異常增生,細(xì)胞形態(tài)、大小不一,并且細(xì)胞的分化程度不均一,出現(xiàn)病理核分裂,HCC結(jié)節(jié)形成,40周后出現(xiàn)壞死。以上結(jié)果提示本實(shí)驗(yàn)中小鼠HCC模型造模成功。見圖1。

        2.2 DEN誘導(dǎo)的HCC小鼠肝臟組織中TGF-β1水平的變化ELISA結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng),模型組小鼠肝臟組織中TGF-β1水平不斷升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=6.65,P<0.01)。見圖2。

        2.3 DEN誘導(dǎo)的HCC小鼠肝臟組織中TβRⅢ蛋白表達(dá)變化半定量分析以對(duì)照組為基數(shù)1,計(jì)算各組比值的相對(duì)比例。Westernblot法檢測(cè)造模不同時(shí)間點(diǎn)小鼠肝臟中TβRⅢ蛋白的表達(dá)情況,結(jié)果顯示,DEN注射8周后,肝臟TβRⅢ的表達(dá)明顯低于對(duì)照組,隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng),TβRⅢ表達(dá)明顯降低,40周時(shí)TβRⅢ表達(dá)最低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F =148.87,P<0.01)。見圖3。

        2.4 DEN誘導(dǎo)的HCC小鼠肝臟組織中p-Smad2、Smad2蛋白表達(dá)變化半定量分析以對(duì)照組為基數(shù)1,計(jì)算各組比值的相對(duì)比例。Western blot法檢測(cè)造模不同時(shí)間點(diǎn)小鼠肝臟中p-Smad2、Smad2蛋白的表達(dá)情況,結(jié)果顯示,隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng),p-Smad2蛋白的表達(dá)升高,而Smad2蛋白的表達(dá)無明顯變化,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=118.09,P<0.01)。見圖4。

        3 討論

        HCC是一類發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜的常見腫瘤,目前HCC已成為全世界第5大惡性腫瘤,致死率高居第3位[1-2]。近年來,HCC發(fā)病率持續(xù)上升,可能與感染肝炎病毒而導(dǎo)致肝硬化,以及慢性酒精性肝病增多有關(guān)。肝臟中相關(guān)分子的異常表達(dá)以及信號(hào)通路的過度激活在HCC發(fā)生發(fā)展中可能扮演著重要角色。本研究進(jìn)一步探討HCC進(jìn)程中的分子機(jī)制,明確相關(guān)分子的作用,對(duì)HCC的診斷和預(yù)后判斷提供幫助。

        TGF-β能誘導(dǎo)上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,促進(jìn)細(xì)胞的遷移和侵襲能力,從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)展[10]。對(duì)非小細(xì)胞肺癌患者的研究[11]顯示,HCC組織中TGF-β1的表達(dá)明顯升高,且與患者的不良預(yù)后有關(guān)。此外,TGF-β1在卵巢上皮癌患者細(xì)胞外基質(zhì)中的表達(dá)升高,與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[12]。本研究顯示,在DEN誘導(dǎo)的小鼠HCC模型中,與對(duì)照組比較,模型組肝臟組織中TGF-β1的表達(dá)水平明顯升高。提示HCC的不斷惡化可能與TGF-β1的高水平表達(dá)有關(guān)。

        TβRⅢ是TGF-β家族的輔助性受體。研究[13]表明,在乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞和卵巢癌Ovca420細(xì)胞中,TGF-β1能夠降低TβRⅢmRNA和蛋白的表達(dá),而對(duì)TβRI和TβRⅡ的表達(dá)沒有明顯影響。研究[6]顯示,TβRⅢ在乳腺癌中表達(dá)缺失,恢復(fù)TβRⅢ的表達(dá)能夠抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移、侵襲以及血管生成。在胰腺癌和卵巢癌中,TβRⅢ的表達(dá)也出現(xiàn)降低甚至缺失的現(xiàn)象[14-15]。但TβRⅢ在HCC中表達(dá)情況尚不清楚。本研究結(jié)果顯示,隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng),模型組中TβRⅢ的表達(dá)逐漸降低。以上結(jié)果提示,低表達(dá)的TβRⅢ與肝臟病理惡性程度有關(guān),而自分泌型TGF-β1的高表達(dá)可能是TβRⅢ表達(dá)降低的原因。

        Smad蛋白作為細(xì)胞內(nèi)的TGF-β受體激酶的底物,在胞外信號(hào)經(jīng)由膜受體轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)的過程中發(fā)揮重要作用。其中,Smad2是TGF-β受體激活后傳遞信號(hào)的下游分子。在對(duì)乳腺癌的體內(nèi)外研究[6]中均顯示,TβRⅢ的表達(dá)能夠抑制Smad2的磷酸化水平。本研究結(jié)果顯示,在HCC的發(fā)展過程中,p-Smad2蛋白表達(dá)逐漸升高,而Smad2蛋白表達(dá)無明顯變化,提示TGF-β信號(hào)通路過度激活,可能與肝臟組織中TGF-β1的表達(dá)升高有關(guān),也可能是由于高表達(dá)的TGF-β1抑制了TβRⅢ的表達(dá),導(dǎo)致Smad2的磷酸化水平升高。

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        The expression of typeⅢTGF-β receptor in diethylnitrosamine-induced liver cancer model

        Zhang Sen,Sun Wuyi,Gu Yuanjing,et al
        (Institute of Clinical Pharmacology,Anhui Medical University;Key Laboratory of Anti-inflammatory and Immune Medicine,Ministry of Education,Hefei 230032)

        ObjectiveTo detect the expression of typeⅢTGF-β receptor(TβRⅢ)in diethylnitrosamine(DEN)-induced liver cancer model.MethodsC57BL/6J mice were intraperitoneally injected with DEN in a 20 μg/g dosage to establish liver cancer model.The pathological change of mice liver was observed by HE staining.The TGF-β1 level in liver tissue was measured by ELISA assay.The expressions of TβRⅢ,p-Smad2 and Smad2 were detected by Western blot.ResultsThe mice liver cell of the control group formed normal size with the complete hepatic lobule structure.With the time passing,hepatic lobule in model group mice was destroyed gradually with liver cell dysplasia,pathology of fission,tumor nodule formation.In DEN-induced liver cancer model,the TGF-β1 level was elevated compared with the control group and the TβRⅢprotein expression was significantly decreased.The expression of p-Smad2 protein was elevated,while Smad2 protein expression showed no obvious change.ConclusionThe low expression of TβRⅢmay play an essential role in the progression of hepatocellular carcinoma.

        TβRⅢ;TGF-β1;hepatocellular carcinoma;DEN

        R 735.7

        A

        1000-1492(2015)07-0912-05

        2015-03-17接收

        國(guó)家自然科學(xué)基金(編號(hào):81300332,81330081);高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金(編號(hào):20113420120002);安徽高校省級(jí)自然科學(xué)研究項(xiàng)目(編號(hào):KJ2012A153)

        安徽醫(yī)科大學(xué)臨床藥理研究所,抗炎免疫藥物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,合肥 230032

        張 森,男,碩士研究生;孫嫵弋,女,副教授,碩士生導(dǎo)師,責(zé)任作者,E-mail:sunwuyi51@hotmail.com;魏 偉,男,教授,博士生導(dǎo)師,責(zé)任作者,E-mail:wwei@ahmu.edu.cn

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