陳越峰，陶琳琳，王慶航，朱 潔，周碧蓉

C57BL／6小鼠動(dòng)脈粥樣硬化中CD4＋CD25＋Treg和TGF-β的表達(dá)及其意義

陳越峰，陶琳琳，王慶航，朱 潔，周碧蓉

目的通過(guò)建立C57BL／6小鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型探討CD4＋CD25＋調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病及治療過(guò)程中的作用。方法24只雄性C57BL／6小鼠隨機(jī)分為3組：正常對(duì)照組、動(dòng)脈粥樣硬化組、阿托伐他汀組。正常對(duì)照組給予基礎(chǔ)飼料，其余組給予高脂飼料。高脂飼養(yǎng)4周后，阿托伐他汀組繼續(xù)高脂飼養(yǎng)并加用阿托伐他汀干預(yù)，3組共觀察16周。蘇木精染色觀察血管病變情況，流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血CD4＋CD25＋Treg的表達(dá)情況，ELISA法檢測(cè)外周血TGF-β濃度。結(jié)果①動(dòng)脈粥樣硬化組的動(dòng)脈血管的內(nèi)膜顯著增生，CD4＋CD25＋Treg／CD4＋T細(xì)胞比例顯著低于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。阿托伐他汀組的動(dòng)脈血管較動(dòng)脈粥樣硬化組病變明顯減輕。阿托伐他汀組的CD4＋CD25＋Treg／CD4＋T細(xì)胞比例較動(dòng)脈粥樣硬化組有顯著提升（P＜0.01），與正常對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。②動(dòng)脈粥樣硬化組TGF-β濃度較正常對(duì)照組明顯降低（P＜0.01）。阿托伐他汀組的TGF-β的濃度顯著高于動(dòng)脈粥樣硬化組（P＜0.01）；較正常對(duì)照組略低，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論CD4＋CD25＋Treg及其分泌的TGF-β具有抑制動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展的作用，有望成為治療動(dòng)脈粥樣硬化的新靶點(diǎn)。

調(diào)節(jié)性T細(xì)胞；動(dòng)脈粥樣硬化；流式細(xì)胞儀；阿托伐他汀

動(dòng)脈粥樣硬化是一種血管壁有大量脂質(zhì)沉積的慢性炎癥疾病，好發(fā)于大動(dòng)脈并伴隨有免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)，如巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞［1］。研究［2］證明免疫反應(yīng)在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展中起著重要的作用，但是其相關(guān)的機(jī)制并不明確。CD4＋CD25＋調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cell，Treg）是一種具有抑制功能的T細(xì)胞亞群，Treg在紅斑狼瘡、白血病以及動(dòng)脈粥樣硬化的病理過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用［3］。Treg數(shù)量的減少將會(huì)破壞機(jī)體自身免疫耐受調(diào)節(jié)［4］。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（transforming growth factor，TGF-β）是CD4＋CD25＋Treg主要產(chǎn)生的一種細(xì)胞因子［5］。Treg在動(dòng)脈粥樣硬化中的作用已經(jīng)成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。該研究通過(guò)建立C57BL／6小鼠模型探討動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病過(guò)程中的CD4＋CD25＋Treg及相關(guān)因子TGF-β的表達(dá)及意義。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組和模型建立24只SPF級(jí)雄性C57BL／6小鼠，實(shí)驗(yàn)初始體重為（25±5）g，由安徽醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，隨機(jī)分為3組：正常對(duì)照組，動(dòng)脈粥樣硬化組，阿托伐他汀組，每組8只，其中正常對(duì)照組給予基礎(chǔ)飼料，動(dòng)脈粥樣硬化組和阿托伐他汀組給予高脂飼料（含81.85%基礎(chǔ)飼料、0.15%膽固醇、18%豬油）；飼養(yǎng)4周后，阿托伐他汀組繼續(xù)用高脂飼料并加用阿托伐他汀干預(yù)［阿托伐他汀溶于無(wú)菌生理鹽水中，按2.5 mg／（kg·d）灌胃］［6］。各組小鼠均自由飲水。動(dòng)物模型制備時(shí)間為16周。

1.2 主要藥物和試劑阿托伐他汀片購(gòu)自美國(guó)輝瑞公司；小鼠Treg流式試劑盒購(gòu)自美國(guó)eBioscience公司；小鼠TGF-β試劑盒購(gòu)自美國(guó)Becton Dickinson公司；小鼠外周血淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自天津?yàn)笊镏破房萍加邢挢?zé)任公司；蘇木精試劑盒購(gòu)自北京海德生物公司；豬油為市售使用豬油。

1.3 組織標(biāo)本留取16周飼養(yǎng)結(jié)束后，小鼠禁食12 h后處死，用水合氯醛1 mg／kg腹腔注射麻醉，固定于手術(shù)臺(tái)上，剖開胸腔、腹腔、心包，先后用0.9%生理鹽水及4%多聚甲醛從左心室逆行灌注固定主動(dòng)脈后，自心臟根部至髂主動(dòng)脈分叉處離斷后取出，10%的中性福爾馬林固定，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋，主動(dòng)脈根部開始，行連續(xù)石蠟切片，切片厚度為5 μm，每張切片取2個(gè)組織面，每隔10張取1張切片，每只小鼠取4張，行HE染色。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)小鼠內(nèi)眥靜脈采血0.3 ml，生理鹽水稀釋至1 ml，取一支15 ml離心管，加入1 ml分離液置于18～22℃條件下。將血液樣本小心加于分離液液面上。18～22℃，1 500 r／min離心20 min。離心后，用吸管小心吸出分離液上層（包含白細(xì)胞的細(xì)胞層）0.5 cm以上的上清液，棄去。用吸管小心吸取分離液層、白細(xì)胞層及紅細(xì)胞層置于另一新離心管內(nèi)。所得離心管中加入10 ml細(xì)胞洗滌液混勻。18～22℃，1 200 r／min離心10 min。棄上清液，重復(fù)1次，細(xì)胞計(jì)數(shù)。每管加入細(xì)胞濃度為1×106／ml的淋巴細(xì)胞懸液，1號(hào)管加入0.125 μg CD4 FITC及0.06 μg CD25 PE抗體，各管加入相應(yīng)的同型對(duì)照。加入預(yù)冷的流式細(xì)胞染色緩沖液500 μl洗滌細(xì)胞，1 000 r／min離心10min，沉淀細(xì)胞，棄上清液。用500 μl的流式細(xì)胞儀染色緩沖液重懸細(xì)胞，上機(jī)檢測(cè)。

1.5 外周血TGF-β濃度小鼠內(nèi)眥靜脈采血0.3 ml，3 000 r／min離心后取得血清，使用ELISA法測(cè)定TGF-β細(xì)胞因子濃度，按照試劑盒說(shuō)明書步驟。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度以及相對(duì)應(yīng)的光密度（optical density，OD）450值分析作出細(xì)胞因子的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，根據(jù)酶標(biāo)儀檢測(cè)得到標(biāo)本的吸光值（檢測(cè)波長(zhǎng)為450 nm），用標(biāo)準(zhǔn)曲線二次方程式計(jì)算TGF-β的濃度。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 11.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以±s表示。組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)改變小鼠主動(dòng)脈根部組織學(xué)特征：實(shí)驗(yàn)16周后小鼠主動(dòng)脈做切片及HE染色，正常對(duì)照組動(dòng)脈血管壁外部和內(nèi)壁的彈性板完整、清晰、內(nèi)皮細(xì)胞的核心染色排列均勻（圖1A）。其余各組動(dòng)脈血管壁均有不同程度的變化。其中，動(dòng)脈粥樣硬化組血管壁不均勻增厚，血管壁有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，脂質(zhì)沉積（圖1B）。與動(dòng)脈粥樣硬化組比較，阿托伐他汀組的血管壁增厚，少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，病變明顯減輕（圖1C）。

2.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血Treg及TGF-β的濃度動(dòng)脈粥樣硬化組的CD4＋CD25＋Treg／CD4＋T細(xì)胞的比例顯著低于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。阿托伐他汀組的CD4＋CD25＋Treg／CD4＋T細(xì)胞的比例較動(dòng)脈粥樣硬化組有顯著的提升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與正常對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。動(dòng)脈粥樣硬化組TGF-β濃度顯著低于正常對(duì)照組，阿托伐他汀鈣組的TGF-β的濃度顯著高于動(dòng)脈粥樣硬化組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1、圖2。

表1 各組小鼠外周血CD4＋CD25＋Treg／CD4＋T細(xì)胞和TGF-β的濃度（n＝8，±s）

表1 各組小鼠外周血CD4＋CD25＋Treg／CD4＋T細(xì)胞和TGF-β的濃度（n＝8，±s）

與正常對(duì)照組比較：**P＜0.01；與動(dòng)脈粥樣硬化組比較：＃＃P＜0.01

項(xiàng)目正常對(duì)照組動(dòng)脈粥樣硬化組阿托伐他汀組F值CD4＋CD25＋Treg／CD4＋（%）10.25±1.196.45±1.24**9.75±1.17＃＃30.23 TGF-β濃度（ng／ml）18.32±3.838.55±3.26**16.93±3.67＃＃28.30

3 討論

動(dòng)脈粥樣硬化病變形成過(guò)程中免疫反應(yīng)貫穿始終。失衡的免疫內(nèi)環(huán)境加速動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展。Treg是一類CD4＋T細(xì)胞亞群，是免疫反應(yīng)系統(tǒng)重要組成部分。Treg維持機(jī)體的免疫耐受，調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)平衡、控制自身免疫性疾病以及動(dòng)脈粥樣硬化的病理過(guò)程［7］。

本研究顯示，C57BL／6小鼠在飼養(yǎng)16周后，動(dòng)脈粥樣硬化組的小鼠血管病變明顯加重，CD4＋CD25＋Treg數(shù)量較正常對(duì)照組明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，證明CD4＋CD25＋Treg可以有效抑制小鼠的動(dòng)脈粥樣硬化的病變。研究［8］證明輸注CD25特異性抗體PC61可以顯著增加斑塊面積及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，證明CD4＋CD25＋Treg可抑制動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與上述研究一致。阿托伐他汀是一種3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶抑制劑，對(duì)抑制動(dòng)脈粥樣硬化病變的發(fā)展進(jìn)程和穩(wěn)定斑塊具有重要的作用，能夠明顯降低心腦血管的發(fā)生率和死亡率，在臨床上已經(jīng)得到驗(yàn)證［9］。本實(shí)驗(yàn)顯示阿托伐他汀干預(yù)后，與動(dòng)脈粥樣硬化組比較，阿托伐他汀組小鼠的動(dòng)脈血管病變明顯減輕，CD4＋CD25＋Treg數(shù)量明顯上升。研究［10］表明可能是因?yàn)榘⑼蟹ニ∧芤种茦渫粻罴?xì)胞的成熟，而不成熟的樹突狀細(xì)胞能夠誘導(dǎo)Treg的形成，使Treg增多，從而抑制動(dòng)脈粥樣硬化病變的發(fā)展，進(jìn)一步證明CD4＋CD25＋Treg在動(dòng)脈粥樣硬化中的作用。研究［11］證明體外實(shí)驗(yàn)中TGF-β可以促進(jìn)Treg的成熟，協(xié)助Treg的存活和功能發(fā)揮。阻斷TGF-β信號(hào)通路會(huì)活化效應(yīng)T細(xì)胞，抑制Treg的成熟，減少Treg數(shù)量，大幅降低Treg的免疫抑制的能力［12］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示動(dòng)脈粥樣硬化組的TGF-β濃度較正常對(duì)照組顯著降低，而經(jīng)過(guò)阿托伐他汀的治療后，動(dòng)脈粥樣硬化病變的程度明顯減輕，顯示TGF-β對(duì)動(dòng)脈粥樣發(fā)展起到抑制作用。本研究顯示動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展和治療的過(guò)程中CD4＋CD25＋Treg比例的變化與TGF-β的濃度變化呈一致性，推測(cè)CD4＋CD25＋Treg能夠抑制動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展的作用機(jī)制可能是因?yàn)榉置赥GF-β這樣具有免疫抑制作用的細(xì)胞因子，可能TGF-β的水平不足導(dǎo)致誘導(dǎo)分化Treg的能力下降，從而致使Treg的數(shù)量減少，Treg數(shù)量不足，分泌TGF-β不足，機(jī)體對(duì)炎癥反應(yīng)抑制減弱，從而加重病變。經(jīng)過(guò)阿托伐他汀干預(yù)后，Treg的數(shù)量上升，上調(diào)TGF-β濃度，促使動(dòng)脈粥樣硬化的病變減輕。因此，TGF-β對(duì)Treg的數(shù)量和功能都具有重要的作用，CD4＋CD25＋Treg及其分泌的TGF-β可以有效抑制動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展。

綜上所述，Treg參在動(dòng)脈粥樣硬化的形成和發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。研究結(jié)果為應(yīng)用Treg治療動(dòng)脈粥樣硬化提供新的方向，有望成為治療動(dòng)脈粥樣硬化的新靶點(diǎn)。

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Expression and significance of CD4＋CD25＋Treg cells and TGF-β in C57BL／6 mice model of atherosclerosis

Chen Yuefeng，Tao Linlin，Wang Qinghang，et al
（Dept of Cardiology，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022）

ObjectiveTo investigate effects and mechanism on CD4＋CD25＋Treg in C57BL／6 mice model of atherosclerosis.MethodsTwenty-four male C57BL／6 mice were assigned to three groups：control group，atherosclerosis group and atorvastatin group.Control group was given normal diet，and the rest groups were given high fat diet. After 4 weeks of high fat diet，atorvastatin group was continued to keep high fat diet and given drugs.The mice were observed for 16 weeks.Vasculopathy was analyzed by hematoxylin-eosin staining.Expression of CD4＋CD25＋Treg in peripheral blood was analyzed by flow cytometry.Concentration of TGF-β was analyzed by ELISA.Results①Hyperplasia of intima was observed in AS group，and the percentage of CD4＋CD25＋Treg／CD4＋T cell was significantly lower than that of the control group（P＜0.01）.Atatorvastatin could significantly reduce the intimail thickness.The percentage of CD4＋CD25＋Treg／CD4＋T cell was significantly higher than that of AS group（P＜0.01）. Atorvastatin group and control group had no significant difference.②As group′s concentration of TGF-β was significantly lower than the control group（P＜0.01）.Atorvastatin group′s concentration of TGF-β was significantly higher than that of AS group（P＜0.01）.Atorvastatin group and control group had no significant difference.ConclusionOur date provides evidence to show CD4＋CD25＋Treg and autocrine secretion of TGF-β can inhibit the development of atherosclerosis，and they will be a new therapeutic target of atherosclerosis.

regulatory T cell；atherosclerosis；flow cytometry；atorvastatin

R 541.4

A

1000－1492（2015）07－0888－04

2015－02－09接收

安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院博士啟動(dòng)基金；安徽省高校省級(jí)自然科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目（編號(hào)：KJ2011A158）

安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，合肥 230022作者簡(jiǎn)介：陳越峰，男，碩士研究生；周碧蓉，女，副教授，副主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：zhoubirong1＠hotmail.com