石 海 盧 杰 程 芃 張楠楠 許建明 胡乃中

·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)·

巨噬細(xì)胞金屬?gòu)椓γ?缺氧誘導(dǎo)因子-1α及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子在胃癌中的表達(dá)及其意義

石 海 盧 杰 程 芃 張楠楠 許建明 胡乃中

目的探討巨噬細(xì)胞金屬?gòu)椓γ?HME)、缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)在胃癌中的表達(dá)及臨床意義。方法采用免疫組化SP法檢測(cè)胃癌及癌旁組織各30個(gè)標(biāo)本中HME、HIF-1α及VEGF的表達(dá)情況。結(jié)果①HME、HIF-1α和VEGF在胃癌組織中表達(dá)高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。②HME的表達(dá)與胃癌的血管浸潤(rùn)和分化程度有相關(guān)性, HIF-1α的表達(dá)與腫瘤的組織學(xué)類(lèi)型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期有相關(guān)性，VEGF的表達(dá)與浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期有相關(guān)性。③VEGF分別與HME和HIF-1α在胃癌組織中的表達(dá)存在密切的相關(guān)性。結(jié)論胃癌中HME、HIF-1α及VEGF的高表達(dá)可能為腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制之一，且這些指標(biāo)的檢測(cè)對(duì)于胃癌的早期判斷、干預(yù)治療及預(yù)測(cè)腫瘤的轉(zhuǎn)移預(yù)后有重要的臨床意義。

胃癌；人巨噬細(xì)胞金屬?gòu)椓γ?；缺氧誘導(dǎo)因子-1α；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子

胃癌是世界上最常見(jiàn)的惡性腫瘤，在我國(guó)發(fā)病率高，病死率占惡性腫瘤的第一位，其早期的診斷、治療、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移是影響預(yù)后的主要因素。腫瘤的快速生長(zhǎng)必然造成營(yíng)養(yǎng)成分和氧氣供應(yīng)不足導(dǎo)致腫瘤缺氧甚至無(wú)氧，故腫瘤細(xì)胞微環(huán)境缺氧是其共同特征，是腫瘤生長(zhǎng)過(guò)程中存在的普遍現(xiàn)象。在缺氧微環(huán)境下腫瘤細(xì)胞高表達(dá)缺氧誘導(dǎo)因子-la[1](Hypoxia induced factor, HIF-1α)。在長(zhǎng)期缺氧微環(huán)境刺激下，通過(guò)HIF-1α表達(dá)增高、調(diào)控血管新生(如VEGF，TGF等)及促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(如TWIST，E-cadherin等)等途徑，適應(yīng)缺氧微環(huán)境而促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[2]。其中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是特異性最高、作用最強(qiáng)的促血管生長(zhǎng)因子[3],是誘導(dǎo)腫瘤血管生長(zhǎng)最關(guān)鍵的因子之一；而巨噬細(xì)胞金屬?gòu)椓γ?human macrophage metalloelastase, HME)是基質(zhì)金屬蛋白酶家族(MMPs)中的一員，又稱為MMP-12，其過(guò)度表達(dá)可以分解纖溶酶原產(chǎn)生血管抑素從而抑制VEGF的作用。故本文通過(guò)對(duì)HME、HIF-1α及VEGF在胃癌中的表達(dá)及相互關(guān)系進(jìn)行探討，為臨床的診斷、治療及預(yù)后提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 兔抗人Anti-VEGF多克隆抗體、HIF-1α兔抗人多克隆抗體、MMP-12兔抗人多克隆抗體、檸檬酸鹽、免疫組化試劑盒、PBS及DAB顯色液均購(gòu)自北京中杉金橋生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集 組織標(biāo)本取自2007年6月至2008年1月安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院外科手術(shù)全切或者次全切除的胃癌組織及距胃癌組織切緣3 cm以外的正常胃黏膜組織各30個(gè)。胃癌組織和癌旁組織均再次由病理科醫(yī)生經(jīng)HE染色鏡檢確認(rèn)診斷結(jié)果。

1.2.2 免疫組化染色 采用常規(guī)免疫組化SP法對(duì)石蠟包埋組織切片(厚5 μm )進(jìn)行MMP-12、HIF-1α和VEGF染色。

1.2.3 結(jié)果判定 HIF-1α以細(xì)胞質(zhì)和(或)細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性；HME染色陽(yáng)性位于細(xì)胞漿和(或)細(xì)胞膜中呈棕黃色，強(qiáng)染時(shí)呈棕褐色；VEGF染色陽(yáng)性主要表達(dá)于胞質(zhì)。采用半定量積分法判斷陽(yáng)性結(jié)果[4]：按染色強(qiáng)度評(píng)分：無(wú)染色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；高倍鏡(×400)下隨機(jī)對(duì)每張切片取10個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞占同類(lèi)細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)，細(xì)胞陽(yáng)性率無(wú)的為0分，<25%的為1分，25%～50%的為2分，>50%的3分。 二者積分乘積<2為陰性，>2為陽(yáng)性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用χ2檢驗(yàn)分析HME、HIF-1α及VEGF的表達(dá)，參數(shù)間的相關(guān)性分析采用2×2列聯(lián)分析進(jìn)行比較，所有統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件完成，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HME、HIF-1α及VEGF在胃癌及癌旁組織中的表達(dá) HIF-1α在胃癌組織中主要分布細(xì)胞質(zhì)中，少量分布在細(xì)胞核中，在癌旁組織中表達(dá)大部分為陰性，少數(shù)為陽(yáng)性，染色后呈棕黃色顆粒，強(qiáng)染呈棕褐色；HME和VEGF在胃癌組織中表達(dá)主要分布在細(xì)胞漿和(或)細(xì)胞膜中，在癌旁組織中少量表達(dá)，染色后呈棕黃色，強(qiáng)染時(shí)呈棕褐色。HME陽(yáng)性率：在胃癌組織中為70.0%(21/30)，在癌旁組織中為26.7%(8/30)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=11.279，P<0.05)；HIF-1α陽(yáng)性率：在胃癌組織中為76.7%(23/30)，在癌旁組織中為16.7%(5/30)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=21.696，P<0.05)；VEGF的陽(yáng)性率：在胃癌組織中為73.3%(22/30)，在癌旁組織中為30.0%(9/30)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=11.279，P<0.05)。詳見(jiàn)表1。

2.2 VEGF、HIF-1α及HME在胃癌中的表達(dá)與胃癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系 HME的表達(dá)與胃癌的血管浸潤(rùn)和分化程度存在相關(guān)性,與其他臨床病理參數(shù)無(wú)明顯相關(guān)；HIF-1α的表達(dá)與腫瘤的組織學(xué)類(lèi)型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期存在相關(guān)性，與其他臨床病理參數(shù)無(wú)明顯相關(guān)；VEGF的表達(dá)與浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期有相關(guān)性，與其他臨床病理參數(shù)無(wú)明顯相關(guān)。詳見(jiàn)表1。

2.3 VEGF與HME及HIF-1α在胃癌組織中表達(dá)的關(guān)聯(lián)性分析 腫瘤新生血管的形成依賴VEGF的表達(dá)[5],本實(shí)驗(yàn)亦分析了胃癌標(biāo)本中VEGF的表達(dá)與HME、HIF-1α的關(guān)系，在VEGF和HME的聯(lián)合檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)兩者均為陽(yáng)性的為63.3%(19/30)，均為陰性的為20.0%(6/30)；在VEGF陽(yáng)性表達(dá)的例數(shù)中HME也表達(dá)為陽(yáng)性的為86.4%(19/22)，在HME陽(yáng)性表達(dá)的例數(shù)中VEGF也表達(dá)為陽(yáng)性的為90.5%(19/21)。VEGF和HME在胃癌組織中表達(dá)存在關(guān)聯(lián) (列聯(lián)分析r=0.510，P<0.05)。在VEGF和HIF-1α的檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)兩者均為陽(yáng)性的為70.0%(21/30)，均為陰性的為20.0%(6/30)；在VEGF陽(yáng)性表達(dá)的例數(shù)中HIF-1α也表達(dá)為陽(yáng)性的為95.5%(21/22)，在HIF-1α陽(yáng)性表達(dá)的例數(shù)中VEGF也表達(dá)為陽(yáng)性的為91.3%(21/23)；VEGF和HIF-1α在胃癌組織中表達(dá)存在關(guān)聯(lián)(列聯(lián)分析r=0.593,P<0.05)。詳見(jiàn)表2。

3 討論

胃癌的發(fā)生發(fā)展是胃黏膜細(xì)胞一系列基因的結(jié)構(gòu)或表達(dá)水平改變所積累起來(lái)的多因素、多步驟的復(fù)雜過(guò)程[6]。惡性腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移是其重要特征，是導(dǎo)致患者預(yù)后不良的主要原因，而血管的生成是惡性腫瘤浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移和發(fā)展過(guò)程中極為重要的步驟。VEGF是目前發(fā)現(xiàn)的作用最強(qiáng)，特異性最高的促血管生長(zhǎng)因子，在血管生成中處于核心地位。VEGF是內(nèi)皮細(xì)胞特異性的血管生成因子，具有經(jīng)典的信號(hào)序列[7], VEGF通過(guò)直接刺激內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移發(fā)揮重要作用。本組實(shí)驗(yàn)在胃癌和癌旁組織標(biāo)本各30個(gè)中，胃癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織，說(shuō)明VEGF與胃癌的發(fā)生、發(fā)展、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移有密切的關(guān)系。通過(guò)對(duì)HME、VEGF和HIF-1α的聯(lián)合檢測(cè)進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析發(fā)現(xiàn)HME的表達(dá)與VEGF呈負(fù)相關(guān)，HIF-1α的表達(dá)與VEGF呈正相關(guān)，結(jié)合患者完整的臨床資料提示：VEGF的表達(dá)與浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期有相關(guān)性，與其他的臨床參數(shù)無(wú)明顯的相關(guān)性。

表1 HME、HIF-1α及VEGF在胃癌及癌旁組織中的表達(dá)及臨床意義(例)

表2 HME、HIF-1α及VEGF在胃癌組織中表達(dá)的關(guān)聯(lián)性分析(例)

腫瘤生長(zhǎng)迅速，隨著腫瘤的不斷生長(zhǎng),體積不斷增大，細(xì)胞耗氧量也不斷增加，因此缺氧是惡性腫瘤生長(zhǎng)過(guò)程中普遍存在的現(xiàn)象，是腫瘤微環(huán)境的顯著特征[8]。而在缺氧的微環(huán)境中，HIF-1α是關(guān)鍵的氧調(diào)節(jié)因子，是腫瘤生長(zhǎng)的啟動(dòng)子。 HIF-1α的活性在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移中起著非常重要的作用[9]。HIF-1α的過(guò)表達(dá)可調(diào)控下游的靶基因如VEGF、糖酵解酶、EPO等產(chǎn)生紅細(xì)胞、新生血管等病理生理反應(yīng)，從而提高腫瘤細(xì)胞對(duì)缺氧的耐受性，保證有足夠的能量使其增殖，浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。有研究[10]表明，胃黏膜上皮細(xì)胞中HIF-1α表達(dá)與VEGF表達(dá)密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)中，胃癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織，說(shuō)明HIF-1α與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移有關(guān)。通過(guò)對(duì)VEGF和HIF-1α的聯(lián)合檢測(cè)進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析發(fā)現(xiàn)兩者在胃癌組織中的表達(dá)存在正相關(guān)，HIF-1α表達(dá)的增加可以促進(jìn)VEGF的生成，從而促進(jìn)新生血管的生成。結(jié)合患者完整的臨床資料提示：HIF-1α的表達(dá)與腫瘤的組織學(xué)類(lèi)型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期有關(guān)，與其他的臨床參數(shù)無(wú)明顯的相關(guān)性。

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移是多重因素作用所致，而機(jī)體自身免疫監(jiān)控失調(diào)是腫瘤形成的基本因素之一，其中巨噬細(xì)胞是機(jī)體免疫防御體系的主要組成部分。巨噬細(xì)胞金屬?gòu)椥悦?HME)是由活化的巨噬細(xì)胞分泌,它能降解多種細(xì)胞外和非細(xì)胞外成分[11], 是巨噬細(xì)胞穿透基底膜和浸潤(rùn)腫瘤組織必不可少的一種活性物質(zhì)，部分瘤細(xì)胞也具有分泌巨噬細(xì)胞金屬?gòu)椓γ傅淖饔?。在肝?xì)胞癌組織中，HME表達(dá)與癌組織的血供呈負(fù)相關(guān)，是一個(gè)新的影響肝癌患者術(shù)后生存時(shí)間的獨(dú)立預(yù)后因素。HMEmRNA過(guò)表達(dá)，結(jié)直腸癌患者的血管浸潤(rùn)及淋巴結(jié)浸潤(rùn)的發(fā)生率均較低，預(yù)后較好。重組MME具有顯著的抑制小鼠原位種植結(jié)腸癌生長(zhǎng)和微血管生成的作用[12-15]。上述結(jié)果均提示HME起著重要的抑制腫瘤進(jìn)展的作用。國(guó)外研究[16]發(fā)現(xiàn)，HME可以分解纖溶酶原產(chǎn)生血管抑素，從而具有抑制微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的作用。血管抑素主要通過(guò)抑制VEGF而抑制新生血管的生成，從而抑制腫瘤的浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移。本實(shí)驗(yàn)中，HME在胃癌中的表達(dá)明顯高于癌旁組織，說(shuō)明HME的過(guò)度表達(dá)與腫瘤的浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移有關(guān)，通過(guò)對(duì)VEGF和HME的聯(lián)合檢測(cè)進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析發(fā)現(xiàn)兩者在胃癌組織中的表達(dá)存在負(fù)相關(guān)，HME的過(guò)表達(dá)的抑制VEGF的生成，從而抑制新生血管的生成。結(jié)合患者完整的臨床資料提示：HME的表達(dá)與腫瘤的血管浸潤(rùn)和分化程度有相關(guān)性,與其他的臨床參數(shù)無(wú)明顯的相關(guān)性。

綜上所述，胃癌早期檢出率低，高轉(zhuǎn)移高侵襲性是其致死率高的主要原因。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，HME、HIF-1α及VEGF在胃癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織，并且HME的表達(dá)與VEGF呈負(fù)相關(guān)，HIF-1α與VEGF呈正相關(guān)，提示HME、HIF-1α及VEGF在胃癌發(fā)展的進(jìn)程中均發(fā)揮著一定的作用，為進(jìn)一步探討胃癌的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移及發(fā)病機(jī)制奠定基礎(chǔ)，可作為評(píng)價(jià)胃癌的早期診斷、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移及預(yù)后的指標(biāo)并為分子靶向治療等提供線索。

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(2015-03-21收稿 2015-05-01修回)

Expressions and clinical significance of human macrophage metalloelastase, hypoxia induced factor-la and vascular endothelial growth factor in gastric cancer

ShiHai,LuJie,ChengPeng,etal

DepartmentofGastroenterology,theFirstAffiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei230032,China

Objective To investigate the expression and clinical significance of human macrophage metalloelastase (HME), hypoxia induced factor-la (HIF-1α) and vascular endothelial growth factor (VEGF) in gastric cancer. Methods The expression of HME, HIF-1α and VEGF proteins in 30 specimens of gastric carcinoma and corresponding normal tissues were detected by immunohistochemical SP method, and the correlation of HME, HIF-1α and VEGF and its relationship with clinical pathology were analyzed. Results ①The expression of HME, HIF-1α and VEGF in gastric carcinoma was significantly higher than that of normal gastric tissues, and the difference had statistical significance. ②The expression of HME was significantly associated with blood vessel invasion and the degree of differentiation, nothing to do with other clinic pathological parameters. The expression of HIF-1α was significantly associated with the degree of differentiation, lymph node metastasis and tumor stage. The expression of VEGF was significantly associated with the depth of invasion, lymph node metastasis and tumor stage. ③The expression of VEGF was correlated to that of HME and HIF-1α in gastric carcinoma. Conclusion The expressions of HME, HIF-1α and VEGF show a positive expression in gastric carcinoma. Their expressions are closely related with the angiogenesis, infiltration and transfer, and involved in the occurrence and development of gastric cancer, which may help to explore the mechanism of gastric cancer.

Gastric carcinoma；Human macrophage metalloelastase；Hypoxia induced factor；Vascular endothelial growth factor

上海市衛(wèi)生局科研課題基金資助項(xiàng)目(20124271)

230032 合肥 安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化科(石海，盧杰，張楠楠，許建明，胡乃中) 201900 上海 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第三人民醫(yī)院消化科(程芃)

程芃，shmdah@163.com

10.3969/j.issn.1000-0399.2015.07.033