林軼男，金慧子，蘇 娟（．上海交通大學(xué)藥學(xué)院，上海0040；．第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院天然藥物化學(xué)教研室，上海00433）

高效液相色譜法測定山楂精降脂片中齊墩果酸和熊果酸含量

林軼男1，金慧子1，蘇 娟2（1．上海交通大學(xué)藥學(xué)院，上海200240；2．第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院天然藥物化學(xué)教研室，上海200433）

目的建立高效液相色譜法（HPLC）測定山楂精降脂片中齊墩果酸和熊果酸的含量，有效地控制產(chǎn)品質(zhì)量。方法采用Agilent Zorbax SB C18柱（250 mm×4．6 mm，5μm），以甲醇-0．06 mol／L乙酸銨（85∶15）為流動相，流速為0．8m l／min；檢測波長為210 nm；柱溫為25℃。結(jié)果齊墩果酸和熊果酸分別在0．124～2．48μg（r＝0．999 7）和0．498～9．96μg（r＝0．999 8）范圍內(nèi)與其峰面積呈良好線性關(guān)系。測得齊墩果酸平均回收率為96．9%，RSD為1．26%；熊果酸平均回收率為100.4%，RSD為2．6%。結(jié)論山楂精降脂片質(zhì)量穩(wěn)定，質(zhì)控方法簡便、準(zhǔn)確，結(jié)果可靠、重現(xiàn)性好。

山楂精降脂片；齊墩果酸；熊果酸；高效液相色譜法

山楂精降脂片（Shanzhajing Jiangzhi tablet）是福建匯天生物藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的以山楂提取物為單一原料制成的純中藥制劑，是降血脂的良藥。原標(biāo)準(zhǔn)收載于1994年版《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)?中藥成方制劑》第九冊（標(biāo)準(zhǔn)號為WS3-B-1687-94）。原標(biāo)準(zhǔn)中含量測定采用紫外分光光度法測定無水槲皮素的含量，該方法專屬性差，對山楂精降脂片的質(zhì)量控制意義不大。事實上三萜類成分為山楂精降脂片中降血脂的主要活性成分［1-3］，而齊墩果酸和熊果酸都被廣泛證實具有降脂、降壓、抗腫瘤、抗肝炎等作用。為了更好地控制山楂精降脂片的內(nèi)在質(zhì)量，筆者制定了同時測定山楂精降脂片中齊墩果酸和熊果酸含量的HPLC方法，提高完善了山楂精降脂片的檢測標(biāo)準(zhǔn)，對產(chǎn)品的質(zhì)量控制和保證用藥安全具有積極意義。

1 儀器與試藥

1．1儀器 Agilent HP-1100系列高效液相色譜儀，包括在線脫氣機、四元泵、自動進(jìn)樣器、柱溫箱、可變波長檢測器、二極管陣列檢測器。Sartotius BP211D型電子天平（德國賽多利斯公司）。

1．2試藥 齊墩果酸對照品、熊果酸對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：110709-200505，110742-200516，純度≥98%）。山楂精降脂片（福建匯天生物藥業(yè)有限公司，批號：120403、130201、130202、130203、130204、130103、130302、130602、130901）。甲醇（J．T Baker，質(zhì)譜純），乙酸銨（Anaqua Chemicals Supply，質(zhì)譜純），水為M illi-Q超純水。

2 方法與結(jié)果

2．1色譜條件 色譜柱Agilent Zorbax SB C18柱（250 mm×4．6 mm，5μm）；以甲醇-0．06 mol／L乙酸銨（85∶15）為流動相；流速為0．8 m l／m in；檢測波長為210 nm；柱溫為25℃；進(jìn)樣量5μl。

2．2溶液的制備①對照品溶液：取齊墩果酸對照品和熊果酸對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1m l含齊墩果酸0．1mg和熊果酸0．5mg的混合溶液，即得。②供試品溶液：取本品10片，剝?nèi)ヌ且?，研?xì)，取約0．5 g，精密稱定，精密加入甲醇30 m l，超聲提取30 m in后，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失重量，搖勻，用微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。③空白對照溶液：因山楂精降脂片是以山楂提取物為單一原料制成的純中藥制劑，所以使用甲醇溶液作為空白對照。

2．3系統(tǒng)適用性試驗 分別取供試品溶液、對照品溶液、空白對照溶液，按“2．1”項色譜條件，進(jìn)樣5μl。齊墩果酸、熊果酸的保留時間分別為24．239、25．742 min。理論塔板數(shù)均＞4 000，兩色譜峰分離度為1．54，達(dá)到基線分離，且空白對照無干擾，結(jié)果見圖1。

圖1 山楂精降脂片HPLC色譜圖

2．4線性關(guān)系考察 精密稱取齊墩果酸對照品3．10 mg，熊果酸對照品12．45 mg，置25 m l量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密吸取上述對照品溶液各1、2、4、6、8、10、12、14、20μl，按“2．1”項色譜條件進(jìn)樣，測定峰面積，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)，齊墩果酸和熊果酸的質(zhì)量（mg）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算回歸方程。齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y＝455.813 X＋12．367，r＝0．999 7；熊果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y＝433.59 X＋25.099，r＝0．999 8。結(jié)果表明齊墩果酸在0．124～2．48μg范圍內(nèi)、熊果酸在0．498～9．96μg范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

2．5精密度試驗 精密稱取齊墩果酸對照品3．10 mg，熊果酸對照品12．45 mg，置25 m l量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，按“2．1”項色譜條件進(jìn)樣5μl，連續(xù)進(jìn)樣6次。測得齊墩果酸、熊果酸峰面積積分值的RSD分別為1．43%和0．34%。結(jié)果表明精密度良好。

2．6重復(fù)性試驗 取同一批號的樣品（山楂精降脂片批號：130901）40片，去糖衣，精密稱重，每片片芯重106.62 mg。研細(xì)，分別精密稱重0．5 g，共稱取6份，按“2．2”項下方法配成供試品溶液，按“2．1”項下的色譜條件進(jìn)樣，測得齊墩果酸的平均含量為0.633 mg／片，RSD為1.63%；熊果酸的平均含量為3.574 mg／片，RSD為0.8%。結(jié)果證明此方法重現(xiàn)性良好。

2．7穩(wěn)定性試驗 取同一供試樣品（山楂精降脂片批號：130901）10片，去糖衣，精密稱重，研細(xì)，精密稱重0．5 g，按“2．2”項下方法配成供試品溶液，按“2．1”項下的色譜條件，分別于提取后0、1、2、4、6、8、10、12、24 h，進(jìn)樣5μl，測得齊墩果酸和熊果酸的峰面積的RSD分別為2.57%和1.37%。結(jié)果表明，供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2．8加樣回收率試驗 取已知含量的山楂精降脂片樣品（批號：130901）40片，去糖衣，精密稱重，每片片芯重106.62 mg。研細(xì)，各精密稱定樣品約0.25 g，共稱取6份，分別置于30 m l量瓶中。分別精密加入濃度為1．5 mg／m l的齊墩果酸對照品溶液1m l和濃度為8．47mg／m l的熊果酸對照品溶液1 m l，加入甲醇適量。按“2．2”項下方法配成供試品溶液，按“2．1”項下的色譜條件，進(jìn)樣5μl，測得其含量，分別計算回收率，結(jié)果表明齊墩果酸平均回收率為96．9%，RSD為1．26%；熊果酸平均回收率為100.4%，RSD為2．6%，見表1。

2．9樣品含量測定 取山楂精降脂片樣品9批，按“2．2”項下方法配成供試品溶液，測定其含量，按外標(biāo)一點法計算齊墩果酸和熊果酸含量，結(jié)果見表2。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果（n＝6）

表2 樣品中齊墩果酸、熊果酸的含量（n＝2）

3 討論

3．1指標(biāo)性成分的選擇 山楂中主要含有黃酮類、有機酸類和三萜類成分。而原標(biāo)準(zhǔn)采用的含量測定方法是以無水槲皮素作為指標(biāo)［4］，采用紫外分光光度法檢測樣品中的總黃酮含量。所以我們首先采用液質(zhì)聯(lián)用、對照品比對等方法研究了山楂精降脂片中含有的黃酮類成分，結(jié)果發(fā)現(xiàn)山楂提取物中并不含有槲皮素，且文獻(xiàn)報道的金絲桃苷［5］、牡荊素等常見的黃酮類化合物在山楂精降脂片中也檢測不到。故黃酮類物質(zhì)不適合作為山楂精降酯片含量測定的指標(biāo)性成分。而三萜類成分作為山楂中另一類主要成分，有廣泛的生物活性。其中，齊墩果酸和熊果酸是降血脂、降血壓的活性成分［2-4］，且兩者是已確知的山楂三萜類代表性化學(xué)成分。2010版《中國藥典》［6］山楂藥材的鑒別項采用的就是以熊果酸為對照品的薄層色譜法，詹學(xué)雄等［7］選取了熊果酸作為山楂精降脂片含量測定的指標(biāo)性成分。齊墩果酸和熊果酸作為同分異構(gòu)體，結(jié)構(gòu)相近，藥理活性相似，在山楂精降脂片中同時存在，且含量較高，所以我們認(rèn)為，將兩者一起作為含量測定的指標(biāo)性成分更合理、可靠。

3．2提取溶劑與提取方法考察 在樣品的前提取處理中，對水、乙醇、乙酸乙酯、甲醇等提取溶劑進(jìn)行了考察，結(jié)果表明，甲醇作為提取溶劑提取率最高。對冷浸法、熱回流提取法、以及超聲處理法進(jìn)行了考察，結(jié)果表明，超聲處理法效果較理想，而且操作簡單易行。此外，對超聲時間進(jìn)行了考察，證明超聲處理30 min，即可將有效成分提取完全。

3．3色譜條件選擇 齊墩果酸和熊果酸是互為同分異構(gòu)體，結(jié)構(gòu)非常相似，分離存在一定困難。要將兩者分開，色譜條件的選擇非常重要。根據(jù)文獻(xiàn)報道，我們試驗了不同的流動相系統(tǒng)：甲醇-水-冰醋酸-三乙胺［8］、甲醇-水-磷酸［9］、甲醇-四丁基溴化銨-三乙胺［10］和乙腈-甲醇-水-乙酸胺［11］系統(tǒng)等。結(jié)果表明，乙腈-甲醇-水-乙酸胺系統(tǒng)分離效果較好，在此基礎(chǔ)上最終確定甲醇-0．06 mol／L乙酸銨（85∶15）為流動相?？疾炝?種不同型號的色譜柱對供試品分離效果的影響，包括AGT Venusil XBPC18（250 mm×4．6 mm，5μm）；Intersil ODS-3 C18（250 mm×4．6 mm，5μm）；Agilent extend C18（250 mm×4．6 mm，5μm）和Agilent Zorbax SB C18（250mm×4．6mm，5μm）。結(jié)果表明，用Agilent Zorbax SBC18柱能更好地分離山楂精降脂片中的成分，而且指標(biāo)性成分齊墩果酸峰和熊果酸峰峰形較好，理論板數(shù)較高，所以選用Agilent Zorbax SB C18柱進(jìn)行含量測定。之后又進(jìn)一步考察了流動相流速和溫度的變化對分離效果的影響，結(jié)果表明柱溫為25℃時，甲醇-0．06 mol／L乙酸銨（85∶15）的流動相在流速為0．8 m l／m in的情況下，齊墩果酸和熊果酸的分離效果最好。

3．4檢驗波長選擇 在實驗中，對齊墩果酸和熊果酸對照品溶液進(jìn)行DAD全波長掃描，測得齊墩果酸和熊果酸的最大吸收波長為210 nm。

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Determ ination of oleanolic acid and ursolic acid in Shanzhajing Jiangzhi tablet by HPLC

LIN Yinan1，JIN Huizi1，SU Juan2（1．School of Pharmacy，Shanghai Jiaotong University，Shanghai 200240，China；2．Department of Phytochem istry，School of Pharmacy，Second M ilitary Medical University，Shanghai200433，China）

ObjectiveTo establish the quality standard for Shanzhajing Jiangzhi tablet by HPLC．MethodsSamples were analyzed on a Agilent Zorbax SB C18column（250mm×4．6mm，5μm）w ithmethanol and 0．06mol／L ammonium acetate（85∶15）asmobile phase at the flow rate of 0．8 m l／m in．The wavelength and column temperature were set at 210 nm and 25℃，respectively．ResultsThe calibration curve showed a good linear relationship w ithin the range of 0．124-2．48μg for oleanolic acid（r＝0．999 7）and 0．498-9．96μg for ursolic acid（r＝0．999 8）．The average recovery ratio of the oleanolic acid and ursolic acid were 96．9%（RSD＝1．26%）and 100.4%（RSD＝2．6%），respectively．ConclusionThemethod was proved to be good at evaluation effectiveness and practicality．

Shanzhajing Jiangzhi tablet；oleanolic acid；ursolic acid；HPLC

R927

A

1006-0111（2015）05-0448-04

10．3969／j．issn．1006-0111．2015．05．018

2014-07-09

2014-11-07

［本文編輯］ 顧文華

林軼男，碩士研究生．Tel：18616634566，E-mail：linyinan1989＠gmail．com

金惠子，副教授，碩士生導(dǎo)師．研究方向：天然藥物化學(xué)．Tel：（021）34205989；E-mail：kimhz＠sjtu．edu．cn