紀(jì)松崗，吳 瓊，朱臻宇，董 昕，洪戰(zhàn)英，柴逸峰（．解放軍40醫(yī)院藥劑科，山東青島6607；．第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院，上海00433）

左卡尼汀緩解順鉑造成急性腎損傷的血清代謝組學(xué)研究

紀(jì)松崗1，吳 瓊2，朱臻宇2，董 昕2，洪戰(zhàn)英2，柴逸峰2（1．解放軍401醫(yī)院藥劑科，山東青島266071；2．第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院，上海200433）

目的利用血清代謝組學(xué)探究順鉑誘導(dǎo)小鼠急性腎損傷的特異性變量，同時(shí)評(píng)價(jià)左卡尼汀的干預(yù)作用。方法將19只小鼠分為正常對(duì)照組、模型組和干預(yù)組，適應(yīng)3 d后，對(duì)干預(yù)組給予左卡尼?。?00mg／kg，ip）干預(yù)，2 d后給予模型組和干預(yù)組順鉑（20 mg／kg，ip）造模，每天稱量各組小鼠的體質(zhì)量，2 d后取小鼠血清進(jìn)行LC-MS分析，結(jié)合模式識(shí)別分析各組間代謝組差異，并評(píng)價(jià)左卡尼汀的干預(yù)作用。結(jié)果代謝組學(xué)分析共鑒別28個(gè)差異代謝物，順鉑誘導(dǎo)的急性腎損傷主要涉及磷脂類、氨基酸類和脂肪酸類代謝途徑的改變，而左卡尼汀有改善作用。結(jié)論左卡尼汀可改善順鉑誘導(dǎo)的急性腎損傷，其機(jī)制可能是通過調(diào)控色氨酸代謝、谷氨酸代謝和能量代謝，從而減緩急性腎損傷的疾病進(jìn)程。

左卡尼??；順鉑；急性腎損傷；代謝組學(xué)

順鉑（cisplatin）為第二代抗癌金屬鉑藥物，是二氯化鉑的順式體。雖然順鉑抗腫瘤廣譜高效，但因其細(xì)胞毒性大、對(duì)癌細(xì)胞選擇性低等缺陷，導(dǎo)致藥物不良反應(yīng)發(fā)生率高，從而限制了其臨床應(yīng)用［1］。腎毒性是順鉑最嚴(yán)重的一種不良反應(yīng)，其中急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）較為常見，急性腎損傷是指小于等于3個(gè)月的腎臟功能或結(jié)構(gòu)方面的異常，包括血、尿、組織檢查或影像學(xué)方面的腎損傷標(biāo)志的異常，臨床具有起病急、早期診斷困難、病情進(jìn)展快、病死率高等特點(diǎn)［2］。順鉑導(dǎo)致AKI的具體機(jī)制尚不明確，目前研究認(rèn)為主要與氧化應(yīng)激、脂質(zhì)過氧化、細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)失調(diào)等有關(guān)［3］。

左卡尼汀具有降血壓、抗氧化及抗炎作用［4］，一般用于治療急性心肌梗死、充血性心力衰竭等患有心臟病的長(zhǎng)期透析患者及低血壓患者等。左卡尼汀在脂類代謝中發(fā)揮重要的作用，通過催化長(zhǎng)鏈脂肪酸的β氧化生成ATP供能，而AKI與能量代謝密切相關(guān)，所以有研究者猜測(cè)左卡尼汀在一定程度上可以用于AKI的預(yù)防和臨床治療［5］，但左卡尼汀的效應(yīng)機(jī)制并不清楚。

代謝組學(xué)作為系統(tǒng)生物學(xué)的分支，研究對(duì)象為生物體內(nèi)低相對(duì)分子質(zhì)量的代謝小分子，以一個(gè)或多個(gè)特定代謝物的動(dòng)態(tài)規(guī)律變化來表征生物體的生理病理變化趨勢(shì)，最終通過還原相關(guān)聯(lián)生物事件提示生物體的病理生理變化實(shí)質(zhì)和機(jī)制所在。鑒于此，筆者開展了順鉑誘導(dǎo)小鼠急性腎損傷的血清代謝組學(xué)研究，并通過比較左卡尼汀干預(yù)下代謝物的變化情況，探討左卡尼汀對(duì)順鉑誘導(dǎo)小鼠急性腎損傷的保護(hù)作用機(jī)制。

1 儀器與試藥

1．1試劑 HPLC級(jí)甲醇和乙腈購自Merk公司（Darmstadt，Germany）；HPLC級(jí)甲酸購自Fluka公司（Buchs，Sw itzerland）；花生四烯酸、18-羥基花生四烯酸、十八碳四烯酸、亞油酸和2-羥基亞麻酸均購自Sigma-A ldrich公司；溶血磷脂酰膽堿類購自Larodan AB公司；色氨酸、苯丙氨酸、鳥氨酸和亮氨酸購自上海純晶試劑有限公司；超純水由本實(shí)驗(yàn)室M ilio-Q超純水系統(tǒng)制得。左旋肉堿和順鉑均購自第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)海醫(yī)院藥劑科。

1．2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 潔凈級(jí)SD小鼠19只，體質(zhì)量為25±5 g，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司。小鼠飼養(yǎng)于保持12 h／12 h晝夜的房間中并給予標(biāo)準(zhǔn)飼料，控制室內(nèi)溫度為25℃，相對(duì)濕度為40%左右。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)飼養(yǎng)3 d。

1．3儀器 Agilent 1290 Infinity液相色譜儀（Agilent有限科技公司）；6530 Accurate-Mass串聯(lián)四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（Agilent有限科技公司）；M illi-Q超純水系統(tǒng)（M illopore中國有限公司）；微型渦旋混合儀（Thermo公司）。

2 方法

2．1急性腎損傷模型的建立及左卡尼汀干預(yù) 將19只小鼠分為3組，其中造模組和干預(yù)組各6只，對(duì)照組7只。干預(yù)組第3天腹腔注射給予左卡尼汀（400 mg／kg），對(duì)照組和造模組給予相應(yīng)劑量的生理鹽水。干預(yù)48 h后，干預(yù)組和造模組均腹腔注射給予順鉑（20 mg／kg）以形成急性腎損傷模型，對(duì)照組給予相應(yīng)劑量生理鹽水。所有小鼠每天稱其體質(zhì)量以監(jiān)測(cè)左卡尼汀干預(yù)和順鉑造成急性腎損傷病理過程對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響。

2．2樣品收集與制備 順鉑造模48 h后，小鼠眼眶取血，在室內(nèi)靜置1 h。血樣在4℃3 000 r／min離心15 m in，分離得上層血清，分成兩部分，一份用于生化指標(biāo)檢測(cè)，另一份用于代謝組學(xué)分析。

2．2．1 生化指標(biāo)分析樣品制備 取100μl血清，3 500 r／m in離心10 m in后收集上清液，用Beckman自動(dòng)生化儀測(cè)定血清尿素氮（BUN）、血清肌酐（SCr）。

2．2．2 代謝組學(xué)分析樣品制備 取100μl血清，加入400μl甲醇，渦旋1 m in，4℃13 000 r／min離心15 min除蛋白。上清液轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣小瓶中，放置于4℃冰箱中等待進(jìn)樣。為了考察系統(tǒng)的穩(wěn)定性和樣品對(duì)系統(tǒng)的適應(yīng)性，質(zhì)量控制（QC）樣品通過合并等量來自不同血清樣品制備得到。

2．3血清代謝組學(xué)分析

2．3．1 色譜條件 色譜分離采用ACQUITY UHPLCTM BEH C18柱（2．1 mm×100 mm，1．7μm，Waters，M ilford，MA）色譜柱，柱溫50℃。流動(dòng)相A為0．1%的甲酸水溶液，流動(dòng)相B為0．1%的甲酸-乙腈，采用梯度洗脫，梯度設(shè)置如下：0～2 min，0%～15%B；2～10 m in，15%～30%B；10～14 m in，30%～95%B；14～17 min；95%B；17～19 m in，95%～0%B。平衡色譜柱5 min，流速為400μl／min，進(jìn)樣量為4μl。

2．3．2 質(zhì)譜條件 離子源為ESI，質(zhì)譜采用正負(fù)離子進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)參數(shù)：毛細(xì)管電壓為3 500 V，干燥氣流速11 L／m in，干燥氣溫度350℃，噴霧氣壓45 psi，碎裂電壓120 V，Skimmer電壓60 V，數(shù)據(jù)采集范圍m／z 50～1 000，選取m／z 121．050 9和m／z 922．009 8的內(nèi)標(biāo)離子進(jìn)行實(shí)時(shí)質(zhì)量數(shù)校正。潛在生物標(biāo)志物離子進(jìn)一步進(jìn)行MS／MS分析，根據(jù)離子情況在10～30 V之間調(diào)整碰撞電壓。

2．4數(shù)據(jù)處理與模式識(shí)別 在進(jìn)行模式識(shí)別前，將原始數(shù)據(jù)（．d）經(jīng)Agilent MassHunter Qualitative software軟件轉(zhuǎn)換為通用格式（．mzData），并進(jìn)行去同位素峰處理。轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進(jìn)一步通過XCMS（http：／／mmetlin．scripps．edu／download／）進(jìn)行峰校正和峰積分，最終得到一個(gè)保留時(shí)間、質(zhì)核比和峰強(qiáng)度的三維矩陣。XCMS參數(shù)除設(shè)定fwhm＝10，bw＝10和snthresh＝5以外，其他參數(shù)均采用默認(rèn)值。采用修正80%規(guī)則來去除缺失值，即去除在某一組中出現(xiàn)頻率（非零值）低于80%的質(zhì)譜離子。將數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化和中心化。將標(biāo)準(zhǔn)后的數(shù)據(jù)矩陣導(dǎo)入SIMCA-P（Umetrics，Sweden）進(jìn)行偏最小二乘法-判別分析（PLS-DA）。通過交叉驗(yàn)證參數(shù)Q2Y和R2Y對(duì)所構(gòu)建的模型質(zhì)量進(jìn)行評(píng)判。應(yīng)用單因素方差分析（one-way ANOVA）對(duì)有顯著性差異的變量在對(duì)照組、干預(yù)組和造模組中的含量進(jìn)行分析，并進(jìn)行多組間的兩兩比較。當(dāng)變量滿足P＜0．05且VIP＞1，認(rèn)為其為潛在的生物標(biāo)志物。

3 結(jié)果與討論

3．1左卡尼汀干預(yù)和順鉑造模期間對(duì)小鼠體質(zhì)量及生化指標(biāo)的影響 如圖1所示，造模前，3組小鼠體質(zhì)量變化不顯著，且趨勢(shì)一致；順鉑造模后，干預(yù)組和造模組的體質(zhì)量呈現(xiàn)明顯的下降趨勢(shì)，造模第2天最為明顯（P＜0．05）。左卡干預(yù)組對(duì)體質(zhì)量下降有一定的抑制作用，但與模型組相比，差異不明顯（P＞0．05）。另外，由表1所示，順鉑誘導(dǎo)模型組的BUN、SCr均顯著高于對(duì)照組（P＜0．05），而左卡尼汀干預(yù)后BUN、SCr的水平有所下降，但是與模型組相比沒有顯著差異（P＞0．05），可能與實(shí)驗(yàn)時(shí)間較短有關(guān)。

表1 3組小鼠腎功能比較（±s）

表1 3組小鼠腎功能比較（±s）

*P＜0．05，與對(duì)照組同時(shí)間比較

組別BUN（c B／mmol?L－1）Scr（c B／μmol?L－1）對(duì)照組11．28±2．01 15．24±1．16模型組36．95±6．11*72．87±8．37*干預(yù)組32．49±3．45*68．02±6．32*

3．2多元統(tǒng)計(jì)分析 為了研究左卡尼汀對(duì)順鉑誘導(dǎo)的小鼠急性腎損傷的干預(yù)作用，筆者采用多元統(tǒng)計(jì)分析對(duì)正負(fù)離子模式下的3組小鼠的血清代謝譜進(jìn)行分析。如圖2所示，在PLS-DA的三維得分圖中可以看到：模型組偏離正常對(duì)照組的趨勢(shì)最大，左卡尼汀干預(yù)組位于正常組和模型組之間。從3組之間的距離并結(jié)合各組體質(zhì)量的變化，左卡干預(yù)組與模型組相比有明顯的改善。

圖2 基于UHPLC／TOF-MS的PLS-DA得分圖及相應(yīng)的交叉驗(yàn)證圖

另外，從正負(fù)離子模式的200次交叉驗(yàn)證圖可以看出，3組構(gòu)建的PLS-DA分類模型穩(wěn)定性好，沒有出現(xiàn)過擬合現(xiàn)象。

3．3代謝物鑒別與生物學(xué)意義解釋 結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析及單元統(tǒng)計(jì)分析，滿足VIP＞1且P＜0．05的差異變量共28個(gè)。之后筆者將這些有意義的變量和網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫（metlin，HMDB）進(jìn)行比對(duì)并用標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)這28個(gè)差異代謝物主要可歸為3類：磷脂代謝物、氨基酸代謝物及脂肪酸代謝物，具體如表2所示，而差異代謝物在3組之間的相對(duì)強(qiáng)度見圖3。

表2 左卡尼汀緩解順鉑造成急性腎損傷相關(guān)潛在生物標(biāo)志物

如圖3所示，模型組與正常組相比，氨基酸代謝物和脂肪酸代謝物上調(diào)，而磷脂代謝物卻呈現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)。干預(yù)組和模型組大致上有相同的變化趨勢(shì)，而琥珀酸、鳥氨酸、吲哚乳酸、吲哚丙烯酸、色氨酸和左旋肉堿卻出現(xiàn)明顯的回調(diào)趨勢(shì)。左旋肉堿含量增加可能與給予干預(yù)組左旋肉堿有關(guān)，而色氨酸、吲哚丙烯酸與吲哚乳酸參與色氨酸代謝，吲哚類是色氨酸的代謝產(chǎn)物，研究表明吲哚類是腎類疾病的特征性標(biāo)志物［6］，左卡尼汀干預(yù)后，下調(diào)的吲哚類代謝物及上調(diào)的色氨酸表明左卡尼汀通過抑制色氨酸-吲哚類物質(zhì)這一代謝途徑繼而改善順鉑誘導(dǎo)的急性腎損傷。琥珀酸是三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物，模型組較正常組水平上調(diào)表明模型組能量代謝發(fā)生異常，這一發(fā)現(xiàn)與之前的報(bào)道一致［7］。而左卡尼汀干預(yù)后出現(xiàn)回調(diào)趨勢(shì)則表明左卡尼汀可能參與了能量代謝繼而發(fā)揮干預(yù)作用。鳥氨酸是尿素循環(huán)的中間產(chǎn)物，其底物為精氨酸，左卡尼汀干預(yù)后，干預(yù)組較模型組鳥氨酸水平下調(diào)間接表明精氨酸水平下調(diào)，而精氨酸水平和谷氨酸水平相關(guān)，谷氨酸具有抗氧化作用［8］，基于此，筆者猜測(cè)左卡尼汀通過調(diào)控谷氨酸代謝減少氧化應(yīng)激，繼而改善順鉑誘導(dǎo)的急性腎損傷。

溶血磷脂酰膽堿類（LysoPCs）和游離脂肪酸類（花生四烯酸、亞油酸及十八碳四烯酸等）是AKI相關(guān)的重要的代謝產(chǎn)物，而這兩類物質(zhì)都是磷脂酰膽堿（PCs）經(jīng)磷脂酶A2（PLA2）催化的水解產(chǎn)物［5］。而磷脂是細(xì)胞膜的重要成分，其產(chǎn)物L(fēng)ysoPCs是細(xì)胞內(nèi)信使，具有促炎、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用［9］。因此該過程使細(xì)胞毒性增強(qiáng)，而這可能是急性腎損傷的誘因。左卡尼汀干預(yù)后，兩類物質(zhì)并沒有出現(xiàn)回調(diào)趨勢(shì)，這一現(xiàn)象表明左卡尼汀干預(yù)機(jī)制可能并不涉及這兩條代謝通路。

圖3 不同離子在對(duì)照組、模型組和干預(yù)組中相對(duì)強(qiáng)度比較

4 結(jié)論

綜上所述，左卡尼汀可以減緩順鉑誘導(dǎo)的小鼠急性腎損傷病理進(jìn)程，其機(jī)制可能主要是通過調(diào)節(jié)色氨酸代謝、谷氨酸代謝及能量代謝相關(guān)通路，繼而減少尿毒癥毒素的積聚，減少氧化應(yīng)激，保護(hù)線粒體功能，從而減緩急性腎損傷病理進(jìn)程。

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L-carnitine alleviating cisplatin induced acute kidney injury through serum metabolom ics analysis

JISonggang1，WU Qiong2，ZHU Zhenyu2，DONG Xin2，HONG Zhanying2，CHAIYifeng2（1．Department of Pharmacy，No．401 Hospital of PLA，Qingdao 266071，China；2．School of Pharmacy，Second M ilitary Medical University，Shanghai200433，China）

ObjectiveTo explore specific variables related to cisplatin induced acute kidney injury，serum metabonom ics techniques were applied and simultaneously the value of intervention effects of L-carnitine were appraised．Methods19 m ice were divided into the normal controlgroup，modelgroup，and intervention group，After a three day accommodation period，the intervention group was given L-carnitine（400 mg／kg，ip）．Two days later，cisplatin（20 mg／kg，ip）was given to themodel and intervention groups．The body weightof everymouse in each group wasmeasured daily．Two days after the serum sample of eachmicewas collected and analyzed by LC-MS，pattern recognition analysisofmetabolomics differencesamong the groups，and the effectiveness of L-carnitine intervention were evaluated．ResultsA totalof 28metaboliteswere identified through serum metabolom ics analysis．Our data shows that there is a possiblemechanism that cisplatin induced AKIwasmainly involved in changing phospholipids，amino acid and fatty acidmetabolic pathways and L-carnitinemitigates the damage of acute kidney injury induced by cisplatin．ConclusionL-carnitinecan alleviates cisplatin induced acute kidney injury by regulating tryptophan metabolism，glutamatemetabolism，and energy metabolism．

L-carnitine；cisplatin；acute kidney injury；metabolom ics

R979．1

A

1006-0111（2015）05-0429-05

10．3969／j．issn．1006-0111．2015．05．012

2014-11-27

2015-05-11

［本文編輯］ 陳 靜

自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81273472）；上海市中藥現(xiàn)代化基金重點(diǎn)基金（12401900802）

紀(jì)松崗，博士，主任藥師．研究方向：中藥復(fù)雜體系的分離分析．E-mail：jisonggang＠126．com

柴逸峰，博士，教授，博士生導(dǎo)師．研究方向：中藥復(fù)雜體系的分離分析．E-mail：yfchai2003c＠163．com