鄭濱興，呂迪亞，方 芳，劉艷華，李 丹，陸 峰，許激揚（．中國藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇南京0009；．第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院，上海004；．福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建福州5008）

基于整體柱的表面增強拉曼光譜法檢測非法染色青黛

鄭濱興1，呂迪亞2，方 芳2，劉艷華1，李 丹3，陸 峰2，許激揚1（1．中國藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇南京210009；2．第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院，上海200433；3．福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建福州350108）

目的建立基于整體柱的表面增強拉曼光譜（surface enhanced Raman spectroscopy，SERS）法快速檢測非法染色的青黛。方法采用混合溶劑乙醇-水（1∶1，V／V）對染色青黛中的染料進(jìn)行提取，利用整體柱中網(wǎng)狀孔隙有助于銀納米顆粒在空間上耦合的特性，將樣品溶液和銀膠溶液混勻后滴加于整體柱上進(jìn)行SERS光譜采集。結(jié)果此法可得到青黛中染色摻偽量低至500μg／kg的孔雀石綠SERS信號。結(jié)論該方法具有快速、簡便、專屬性強等優(yōu)點，可運用于中藥材青黛非法染色的快速檢測。

表面增強拉曼光譜；整體柱；非法染色；青黛；孔雀石綠

在中藥市場中，受利益驅(qū)使，摻偽造假現(xiàn)象屢禁不止［1］，包括以次充好、以偽充真、染色摻偽等，其中染色摻偽尤為嚴(yán)重。青黛是一種廉價易得的中藥材，為爵床科植物馬藍(lán)、蓼科植物蓼藍(lán)或十字花科植物菘藍(lán)的葉或莖葉經(jīng)加工制得的干燥粉末或團(tuán)塊，具有清熱解毒、涼血消斑、瀉火定驚等功效。孔雀石綠染色青黛時有報道［2］?？兹甘G有毒，可致癌，食用孔雀石綠染色青黛不僅無預(yù)期療效，反而會加重病情，因而急需快速有效的鑒別手段。

中藥染色摻偽常用鑒別方法有經(jīng)驗鑒別和一般理化方法、色譜法與光譜法等［3］。薄層色譜法（TLC）具有分離與鑒定的雙重功能，且操作簡單成本低，但影響因素較多，常用于定性初篩；高效液相色譜法（HPLC）分離性能強，可與不同檢測器聯(lián)用，具有較好的定性與定量功能，但操作煩瑣、儀器復(fù)雜，不適于快速檢測；表面增強拉曼光譜法（SERS）是一種高靈敏、高專屬的新型譜學(xué)技術(shù)，對樣品預(yù)處理要求低，已廣泛應(yīng)用于色素、農(nóng)藥殘留與污水中污染物等的檢測研究［4-7］。近年來提出了基于整體柱的SERS檢測方法［8］，對樣品進(jìn)行富集后檢測，可檢測濃度低至10－18mol／L的羅丹明（R6G），表明此法具有高靈敏性和廣闊的應(yīng)用前景。

筆者采用多孔有機整體柱，結(jié)合具有較好增強效果的銀膠溶液，并優(yōu)化SERS檢測條件以期建立非法染色青黛的快速有效的檢測方法，從而有利于中藥市場的監(jiān)管，保障消費者用藥安全。

1 儀器與材料

1．1儀器 BWS415-785H便攜式拉曼光譜儀（B&W Tek，USA）；TG16-WS高速離心機（上海盧湘儀離心機有限公司）；XW-80A型漩渦混合器（上海精科實業(yè)有限公司）；KQ-250DB型數(shù)控超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；掃描電鏡（Zeiss EVO MA-10）。

1．2材料 孔雀石綠、硝酸銀、檸檬酸三鈉、青黛（均為分析純，上海國藥化學(xué)試劑有限公司）；甲基丙烯酸縮水甘油酯（GMA）、乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA）、過氧化苯甲酰（BPO）、環(huán)己醇、正十二醇（均為分析純，阿拉丁試劑公司）；實驗用水為超純水。

2 方法

2．1整體柱的合成 據(jù)文獻(xiàn)［9］報道的GMA-EDMA整體柱合成方法制作整體柱：稱取GMA（單體）1．28 g、EDMA（交聯(lián)劑）1．92 g、BPO（引發(fā)劑）0．032 g、十二醇（致孔劑）0．768 g和環(huán)己醇（致孔劑）4．032 g，超聲使其充分混勻與除氣，倒入長為10 cm、直徑為0．5 cm的塑料管狀模具中，密封后置60℃水浴中12 h；將模具剖開，取出整體柱置乙醇中過夜，室溫干燥，將所得整體柱切成小圓柱，打磨平整后備用。

2．2銀膠溶液的制備 稱取45 mg硝酸銀置500 m l三頸圓底燒瓶中，加入250 m l去離子水溶解，加熱至沸騰，不斷攪拌的情況下逐滴加入5 m l 1%的檸檬酸鈉溶液，沸騰狀態(tài)下繼續(xù)攪拌50 m in，自然冷卻，即得灰綠色銀膠溶液［10］，取制得的銀膠溶液1 m l離心濃縮至所需濃度后備用。

2．3樣品溶液的配制

2．3．1 孔雀石綠對照溶液 精密稱取孔雀石綠適量，加入乙醇溶解，制備成10－3mol／L的溶液，逐級稀釋制備所需濃度溶液。

2．3．2 染色青黛制備與染料提取 稱取0．05 g青黛，加入上述孔雀石綠對照溶液渦旋混勻后烘干；向上述染色后的青黛加入混合溶劑乙醇-水（1∶1，V／V）200μl，渦旋30 s后靜置，待其分層，取100μl上清液備用。

2．4拉曼光譜法檢測 取100μl的樣品溶液，加入10μl銀膠溶液和10μl氯化鈉溶液（80 mmol／L）渦旋混勻，滴加于整體柱表面，多余的液體將隨著整體柱孔隙流出，將激光光斑聚焦于整體柱表面采集SERS信號。

3 結(jié)果與討論

3．1整體柱的表征 采用掃描電鏡（SEM）對所得整體柱進(jìn)行表征，結(jié)果如圖1，可以看出整體柱材料具有豐富的相互交織的孔隙，呈三維結(jié)構(gòu)，可使固定在整體柱材料上的納米顆粒在空間位置上有更好的耦合作用，從而產(chǎn)生較好的SERS增強效果，利于待測物質(zhì)的檢測。

圖1 GMA-EDMA整體柱掃描電鏡圖

3．2銀膠溶液濃度的選擇 SERS增強效應(yīng)與銀納米粒的濃度有關(guān)［11］，為使整體柱／銀膠體系有較好的SERS增強效果，考察相同體積不同濃度銀膠溶液的增強效果。如圖2，曲線a為整體柱的常規(guī)拉曼圖譜；曲線b為空白銀膠溶液在整體柱上的拉曼圖譜，用超純水代替孔雀石綠溶液與銀膠溶液混合后，滴加于整體柱進(jìn)行光譜采集；曲線c～g分別為采用1～5倍濃縮銀膠溶液所獲得的SERS圖譜。根據(jù)圖2中標(biāo)出的423、441、1 173、1 618 cm－1的特征峰，可知隨著銀膠溶液濃縮倍數(shù)不斷增大，SERS信號不斷增強，隨后出現(xiàn)下降趨勢。銀膠溶液濃度的適當(dāng)增加有助于銀納米粒子在整體柱上有效耦合從而達(dá)到良好的增強效果，但銀膠溶液濃度過高將導(dǎo)致附著于整體柱上的銀納米粒子過度聚集，SERS信號反而降低。實驗中發(fā)現(xiàn)采用4倍濃縮銀膠溶液時增強效果較佳。

3．3最佳富集量的確定 銀膠溶液與樣品溶液混合后，孔雀石綠分子會吸附于銀納米粒表面，滴加于整體柱表面富集時，吸附有孔雀石綠的銀納米粒滯留在整體柱表面，多余的液體將從其內(nèi)部孔隙流出。理論上，富集量（V）越大，滯留于整體柱表面的孔雀石綠分子越多，所得SERS信號越強。實驗中對比了V＝40、60、100、150、200μl時所得的增強效果，如圖3，整體柱／銀膠體系中，當(dāng)V＜100μl時，隨著富集量的增大，SERS信號增強，符合預(yù)期情況；當(dāng)V＞100μl時，孔雀石綠423、441、1 173、1 397、1 618 cm－1的特征峰反而減弱，可能由于隨著富集量的增大，滯留在整體柱表面的銀納米顆粒的聚集狀態(tài)發(fā)生改變；且由圖4可知，當(dāng)V＞100μl時，所得SERS信號的穩(wěn)定性較弱。實驗結(jié)果表明，V＝100μl時整體柱／銀膠體系的SERS增強效果最佳。

圖2 不同濃度銀膠溶液所得SERS圖譜

3．4整體柱／銀膠體系孔雀石綠的檢測采用上述孔雀石綠在整體柱／銀膠體系中優(yōu)化的最佳檢測條件，筆者對孔雀石綠的檢測限進(jìn)行了考察。得到系列濃度孔雀石綠在整體柱／銀膠體系中的SERS圖譜，由圖5可知，當(dāng)孔雀石綠的濃度（C）降至10－10mol／L時仍能觀察到其特征峰，在1 010 cm－1處有時會出現(xiàn)整體柱自身增強峰，但并不影響孔雀石綠的檢測。由423、441、1 173、1 397、1 618 cm－1特征峰可知在10－7～10－10mol／L濃度范圍內(nèi)，隨孔雀石綠濃度的降低其SERS信號呈減弱趨勢。

圖3 不同富集量所得SERS圖譜

圖4 孔雀石綠441 cm－1特征峰強與富集量的關(guān)系

圖5 基于整體柱的不同濃度孔雀石綠的SERS圖譜

3．5染色青黛的鑒別 將實驗室自行制備的染色青黛按“2．4”項的方法進(jìn)行測定，結(jié)果如圖6所示，曲線a為未染色青黛結(jié)合上述方法測定的SERS信號，作為空白信號，未觀察到孔雀石綠的特征峰，而在693和733 cm－1處出現(xiàn)青黛基質(zhì)的未知信號峰，但并不干擾孔雀石綠的測定；曲線b～e為不同染色摻偽量（m）所得的SERS圖譜，由圖看出可檢測低至500μg／kg孔雀石綠染色摻偽的青黛，遠(yuǎn)低于實際染色摻偽量1 g／kg，表明此方法結(jié)合簡單的前處理能快速地檢測青黛中的孔雀石綠。同時，SERS譜圖中的信息對應(yīng)其分子結(jié)構(gòu)，可對被測樣品分子進(jìn)行定性，通過建立相應(yīng)的染料圖譜庫，即可對染色摻偽中藥材進(jìn)行快速鑒別。

4 結(jié)論

筆者制備了多孔有機整體柱，并采用SEM對制得的整體柱進(jìn)行表征，整體柱內(nèi)部具有交織的孔隙，為空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，可作為金、銀納米粒良好的承載基底。通過優(yōu)化銀膠溶液濃度和富集量，可獲得濃度低至10－10mol／L的孔雀石綠SERS信號；對模擬樣品檢測時，可得到低至500μg／kg的孔雀石綠信號，滿足真實樣品檢測的需求。本研究建立的方法具有快速、簡單、檢測成本低、專屬性強等優(yōu)點，在非法染色中藥材檢測中具有較好的應(yīng)用前景。

Detection ofmalachite green in natural indigo by surface enhanced Raman spectroscopy based on monolithic column

ZHENG Binxing1，LV Diya2，F(xiàn)ANG Fang2，LIU Yanhua1，LIDan3，LU Feng2，XU Jiyang1（1．School of Life Science and Technology，China Pharmaceutical University，Nanjing 210009，China；2．School of Pharmacy，the Second M ilitary Medical University，Shanghai 200433，China；3．School of Pharmacy，F(xiàn)ujian University of Traditional Chinese Medicine，F(xiàn)uzhou 350108，China）

ObjectiveTo develop a rapid SERS detection method based on monolithic column for detection of dye adulterated natural indigo．MethodsThe dyes in natural indigo were extracted andmixed w ith silver colloid．The spectrawere recorded after applying them ixture solution to themonolithic column since the intertw ined pores inmonolithic column could contribute for the distribution of silver nanoparticles．ResultsSERS signals ofmalachite green dyed natural indigo at quantity as low as500μg／kg could be obtained．ConclusionThis simple，fastand specific SERSdetectionmethod based onmonolithic column could be used for rapid detection of stained natural indigo．

surface enhanced Raman spectroscopy（SERS）；monolithic column；adulteration；natural indigo；malachite green

R927．1

A

1006-0111（2015）05-0426-04

10．3969／j．issn．1006-0111．2015．05．011

鄭濱興，碩士研究生．E-mail：zhengbinxing＠hotmail．com

許激揚，博士，教授，碩士生導(dǎo)師．研究方向：生物技術(shù)制藥．Tel：（025）83271306；E-mail：jiyangx＠126．com