陳維中，蔡靖斌，陳曉蘭，陳瑞奇，李夏靜，廖聯明（．南京軍區(qū)福州總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院，福建莆田3500；．福建中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結合研究院腫瘤研究所，福建福州35008）

漢黃芩素與氟尿嘧啶聯用抗人肝癌細胞Hep-G2作用的拮抗效應研究

陳維中1，蔡靖斌1，陳曉蘭1，陳瑞奇2，李夏靜2，廖聯明2（1．南京軍區(qū)福州總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院，福建莆田351100；2．福建中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結合研究院腫瘤研究所，福建福州350108）

目的探討漢黃芩素（wogonin）聯合氟尿嘧啶（5-FU）對人肝癌細胞Hep-G2生長活性的影響。方法實驗分漢黃芩素組、5-FU組、漢黃芩素＋5-FU組和空白對照組，采用MTT法觀察藥物對腫瘤細胞體外生長活性的影響，采用流式細胞儀分析腫瘤細胞凋亡率的變化。結果MTT實驗結果顯示漢黃芩素（5、10、20、40μmol／L）作用24、48 h后對腫瘤細胞具有一定的增殖抑制作用（P＜0.05）；5-FU（5、10、20、40 mg／L）作用24、48 h后對腫瘤細胞增殖有明顯的抑制作用（P＜0.05）；與單用組對腫瘤細胞的抑制作用相比，漢黃芩素聯合5-FU組的抗腫瘤作用呈相互拮抗作用（P＜0.05）；漢黃芩素聯合5-FU給藥48 h后，聯合指數CI值呈現劑量依賴性，CI值隨漢黃芩素濃度的加大而增大，說明隨漢黃芩素濃度的加大，其拮抗5-FU抗腫瘤效應的作用也越來越明顯（P＜0.05）。結論漢黃芩素具有一定的抗腫瘤作用，但可拮抗5-FU的抗腫瘤作用，具體機制有待進一步研究。

漢黃芩素；氟尿嘧啶；拮抗作用；肝癌細胞Hep-G2

漢黃芩素（圖1）是一種從黃芩（唇形科）中提取的天然黃酮類化合物，其抗腫瘤作用越來越引起學者的重視［1］；臨床常運用5-FU治療實體瘤，但易產生耐藥性并導致嚴重的毒副作用，故聯合用藥增強化療藥物的抗腫瘤效應并減輕其毒副作用成為當今的研究熱點。但值得關注的是研究發(fā)現聯合用藥也可能產生一定的相互拮抗作用［2］。本研究在觀察漢黃芩素聯合5-FU的抗腫瘤作用時發(fā)現二者聯用存在一定的拮抗作用?，F將結果報告如下：

1 材料與方法

1．1藥物及試劑 漢黃芩素由福建中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結合研究院腫瘤研究所制備，用二甲基亞砜（DMSO）溶液配制成濃度為200μmol／L的母液，分裝，儲存于－20℃冰箱，備用；四甲基偶氮唑藍（MTT）和細胞凋亡試劑盒購自凱基生物試劑公司。

圖1 漢黃芩素化學結構式

1．2細胞培養(yǎng) 人肝癌細胞Hep-G2培養(yǎng)于10%胎牛血清，1640培養(yǎng)液中常規(guī)培養(yǎng)（37℃培養(yǎng)箱，5%CO2）。

1．3細胞增殖活力檢測（M TT法） 取2×103個細胞接種于96孔板中，每孔100μl，培養(yǎng)24 h后給藥，分為漢黃芩素組（5、10、20、40μmol／L）、5-FU組（5、10、20、40 mg／L）、聯合給藥組和空白對照組。每組設8個復孔。藥物分別作用24及48 h后，棄培養(yǎng)液。每孔加入100μl 0.5%MTT溶液并在培養(yǎng)箱中作用4 h，傾去培養(yǎng)液，加入DMSO溶液100μl，待完全溶解顯色后，用酶標儀于490 nm處測定吸光度（A），計算細胞生長抑制率。

1．4細胞形態(tài)學觀察 用顯微鏡分別觀察漢黃芩素（40μmol／L）和5-FU（5 mg／L）處理Hep-G2細胞48 h后細胞形態(tài)學的變化。

1．5細胞凋亡率檢測（流式細胞術） 實驗分為對照組、漢黃芩素（20μmol／L）組、5-FU（5 mg／L）組、聯合給藥組（漢黃芩素20μmol／L＋5-FU 5 mg／L）4個組，給藥處理Hep-G2細胞24 h，磷酸緩沖液（PBS）洗滌2次，用不含乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）的胰酶消化，收集1×105個細胞，加入500μl的結合緩沖液懸浮細胞，再加入5μl磷酯酰絲氨酸-異硫氰酸熒光素（Annexin V-FITC）混勻，室溫避光反應5～15 m in，1 h內用流式細胞儀進行檢測。

1．6聯合組給藥48 h的聯合指數CI計算方法參照相關文獻［3-5］：聯合指數CI＝D1／（DX）1＋D2／（DX）2。首先計算漢黃芩素和5-FU的IC50所對應的濃度，（DX）1代表漢黃芩素作用48 h，IC50所對應的漢黃芩素濃度，（DX）2代表5-FU作用48 h，IC50所對應的5-FU濃度。其次計算聯用組C1［漢黃芩素（5μmol／L）＋5-FU（5、10、20、40 mg／L）］、C2［漢黃芩素（10μmol／L）＋5-FU（5、10、20、40mg／L）］、C3［漢黃芩素（20μmol／L）＋5-FU（5、10、20、40 mg／L）］、C4［漢黃芩素（40μmol／L）＋5-FU（5、10、20、40 mg／L）］48 h給藥處理，IC50所對應的漢黃芩素和5-FU的濃度。D1代表聯合給藥組IC50所對應的漢黃芩素給藥濃度，D2代表聯合給藥組IC50所對應的5-FU的給藥濃度。將所得的值代入上述公式得到CI值。當CI＜1，表明具有協同作用；當CI＝1，表明具有相加作用；當CI＞1，表明具有拮抗作用。

1．7數據處理 應用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件對本研究數據進行統(tǒng)計學分析，實驗數據以均數±標準差（±s）表示，各均數間比較采用方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2．1漢黃芩素對Hep-G2細胞增殖的抑制作用結果表明，漢黃芩素給藥處理24、48 h后，漢黃芩素對人肝癌細胞Hep-G2增殖具有一定的抑制作用，其抑制作用呈劑量和時間依賴關系，見圖2、3。

圖2 漢黃芩素給藥24 h對Hep-G2細胞增殖抑制率

圖3 漢黃芩素給藥48 h對Hep-G2細胞增殖抑制率

2.2漢黃芩素對Hep-G2細胞形態(tài)學的影響 漢黃芩素給藥48 h，形態(tài)學上觀察發(fā)現細胞變圓，體積縮小，細胞變形，并伴有壞死細胞及碎片，呈現出典型的細胞凋亡現象。

2．35-FU對Hep-G2細胞增殖的抑制作用 5-

FU給藥處理24、48 h后，5-FU對人肝癌細胞Hep-G2具有明顯抑制作用，呈現劑量和時間依賴關系，見圖4、5。

2．45-FU對Hep-G2細胞形態(tài)學的影響 形態(tài)學上觀察發(fā)現細胞變圓，體積縮小，細胞變形，并伴有壞死細胞及碎片，呈現出典型的細胞凋亡現象。

2．5聯合給藥處理24、48h對Hep-G2細胞增殖抑制作用 聯用組對Hep-G2抑制率小于單用組抑制率之和，說明漢黃芩素聯合5-FU抗人肝癌細胞Hep-G2具有一定的拮抗作用（P＜0.05，見表1、2）。漢黃芩素聯合5-FU給藥48h，其聯合用藥指數CI值呈現劑量依賴性，CI值隨著漢黃芩素濃度的加大而增大，說明隨著漢黃芩素濃度的加大，其拮抗5-FU抗腫瘤效應越明顯（P＜0.05），見圖6。

圖4 5-FU給藥24h對Hep-G2細胞增殖抑制率

圖5 5-FU給藥48h對Hep-G2 細胞增殖抑制率

圖6 不同劑量漢黃芩素聯合5-FU 給藥48h對聯合指數影響

表1 聯用組給藥處理24h對Hep-G2細胞增殖抑制率（±s，n＝8）

表1 聯用組給藥處理24h對Hep-G2細胞增殖抑制率（±s，n＝8）

漢黃芩素濃度（cB／μmol?L－1）5-FU濃度（ρB／mg?L－1）0 5 102040 0 0 25．35±0．1830．71±0．4034．99±0．4237．62±0．43 5 2．53±0．7524．52±0．1830．72±0．0633．63±0．7136．43±0．90 103．88±0．0725．70±0．1131．96±0．0833．26±0．0938．10±0．75 2010．67±0．5626．50±0．2630．21±0．1432．69±0．0935．98±0．09 4014．52±0．3128．43±0．0832．64±0．0732．67±0．2230．85±0．05

表2 聯用組給藥處理48h對Hep-G2細胞增殖抑制率（±s，n＝8）

表2 聯用組給藥處理48h對Hep-G2細胞增殖抑制率（±s，n＝8）

漢黃芩素濃度（cB／μmol?L－1）5-FU濃度（ρB／mg?L－1）0 5 102040 0 0 48．93±0．0852．38±0．1457．86±0．0967．50±0．02 5 8．10±0．5748．02±0．0448．42±0．0856．73±0．2560．55±0．09 109．74±0．1347．29±0．3549．47±0．1755．90±0．0863．20±0．20 2016．21±0．0645．46±0．1146．17±0．2554．89±0．0563．95±0．08 4024．88±0．1543．77±0．3545．96±0．1055．93±0．0764．06±0．04

2．6聯合給藥處理24h對Hep-G2細胞凋亡的影響 從實驗結果中發(fā)現，聯用組細胞凋亡率之和小于單用組細胞凋亡率之和，1＋1＜2，說明漢黃芩素對5-FU抗腫瘤效應具有一定的拮抗作用，見圖7。

3 討論

5-FU在臨床上應用較為廣泛，對消化道腫瘤及其他實體瘤有良好療效，在腫瘤內科治療中占有重要地位，但其在治療劑量范圍內存在著嚴重的毒副作用，如：胃腸道反應、骨髓抑制導致的白細胞及血小板減少、脫發(fā)等。

本實驗采用MTT法觀察5-FU對人肝癌細胞Hep-G2的增殖抑制作用，證實其對人肝癌細胞Hep-G2具有明顯的抑制作用，從細胞形態(tài)學上觀察，其誘導了Hep-G2細胞產生凋亡，對細胞形態(tài)產生一定的影響，說明5-FU對Hep-G2有顯著的增殖抑制效應。漢黃芩素具有一定的抗氧化作用及神經保護作用，可以降低氧活性自由基的表達［6］，漢黃芩素作用于腫瘤細胞誘導氧自由基產生［7］，并激活細胞凋亡信號通路，誘導腫瘤細胞凋亡，并抑制腫瘤細胞生長；漢黃芩素還可作用于腫瘤細胞PI3KAKT信號通路［8-10］，誘導細胞凋亡，說明具有一定的抗癌作用。本實驗采用MTT法觀察漢黃芩素對人肝癌細胞Hep-G2的抑制作用，發(fā)現其在體外對人肝癌細胞Hep-G2具有一定的抑制作用，同時從細胞形態(tài)學上觀察，可誘導Hep-G2細胞凋亡，說明漢黃芩素對Hep-G2有一定的增殖抑制作用。

圖7 不同給藥組處理24 h對細胞凋亡的影響

雖然漢黃芩素在體外具有一定的抗腫瘤作用，但本實驗結果顯示漢黃芩素有拮抗5-FU的抗腫瘤效應，細胞增殖活力檢測（MTT法）和細胞凋亡檢測（流式細胞術）發(fā)現聯合給藥組對Hep-G2抑制率小于兩藥單用抑制率之和，表明漢黃芩素聯合5-FU抗人肝癌細胞Hep-G2具有一定的拮抗作用，漢黃芩素聯合5-FU給藥48 h，聯合指數CI＞1，隨著其濃度加大，CI變大，拮抗作用越明顯，說明漢黃芩素與5-FU聯合用藥不但不能提升療效，反而可能增加5-FU的毒副作用，漢黃芩素拮抗5-FU的抗腫瘤作用機制有待深入研究。

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Combination ofwogonin w ith 5-fluorouracilexhibits antagonistic effecton human Hep-G2 hepatocellular carcinoma cells

CHENWeizhong1，CAIJingbin1，CHEN Xiaolan1，CHEN Ruiqi2，LIXiajing2，LIAO Lianming2（1．First Affiliated Hospital，Fuzhou General Hospitalof Nanjing M ilitary Region，Putian 351100，China；2．Departmentof Oncology，Academy of Integrative Medicine，Fujian University of Traditional Chinese Medicine，Fuzhou 350108，China）

ObjectiveTo investigate the antagonistic effect of wogonin in combination w ith 5-fluorouracil（5-FU）on the proliferation of human Hep-G2 hepatocellular carcinoma cells．MethodsHuman hepatocellular Hep-G2 cellswere divided into experimental group（wogonin group，5-FU group，wogonin＋5-FU group）and controlgroup．MTTmethod was used to evaluate tumor cell proliferation in vitro，flow cytometry analysiswas used to evaluate tumor cell apoptosis．ResultsThe results showed that the wogonin inhibited the proliferation of tumor cells at the concentrations of 5，10，20 and 40μmol／L after 24 h and 48 h treatment respectively（P＜0.05）；5-FU also inhibited the proliferation of tumor cells at the concentrations of 5，10，20 and 40 mg／L after 24 h and 48 h treatment respectively（P＜0.05）．However when wogonin was combined w ith 5-FU（wogonin＋5-FU group），an antagonistic effect was observed on tumor cell proliferation（P＜0.05）．When cells were treated by wogonin＋5-FU for 48 h，the combined index（CI）value slowed a dose-dependentantagonistic effect（P＜0.05）．ConclusionWogonin has anti-tumor effect．However when wogonin was combined w ith 5-FU，an obvious antagonistic effect on 5-FU′s anti-tumor action was observed．The underlyingmechanism deserves further study．

wogonin；fluorouracil；antagonism；hepatocellular carcinoma cell Hep-G2

R979．1

A

1006-0111（2015）05-0411-04

10．3969／j．issn．1006-0111．2015．05．007

2014-11-20

2015-07-09

［本文編輯］ 陳 靜

陳維中，本科，副主任藥師．研究方向：醫(yī)院藥學．E-mail：cwzhongfz＠sina．com

廖聯明，博士，副教授，碩士生導師．研究方向：中藥抗腫瘤的藥理學機制．E-mail：llm＠fjtcm．edu．cn