張 瑜，高晶暉，張立強(qiáng)，高 洋，賈云曉，陳德坤

（西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100）

羊口瘡（Orf）又叫羊接觸傳染性膿皰皮炎（Contagious pustular dermatitis），是由羊口瘡病毒（Orf virus，ORFV）引起的一種接觸性傳染病。病毒主要感染綿羊和山羊，山羊比綿羊易感，羔羊比青年羊更易感，羊感染后口唇部產(chǎn)生增生性損傷［1］。3月齡～6月齡的羔羊發(fā)病率一般為95.4%左右，致死率一般在0～93%之間［2］。羊口瘡在世界各養(yǎng)羊國家中分布較為廣泛，對養(yǎng)羊業(yè)造成較大的威脅［3］。在我國青海、寧夏、新疆、陜西、吉林、四川、黑龍江、西藏和甘肅等地都有羊口瘡流行的相關(guān)報(bào)道，給養(yǎng)羊業(yè)造成了較大的損失［4－6］。文獻(xiàn)報(bào)道［7］，近年來羊口瘡病毒分離株出現(xiàn)了基因變異，這些變異是否會導(dǎo)致我國羊口瘡弱毒疫苗免疫保護(hù)效果下降，還存在一些爭議。因此，有必要對我國各地羊口瘡野毒株進(jìn)行分離和基因分析，以便為羊口瘡防控策略和具體措施制定提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)用動(dòng)物 具有典型羊口瘡臨床癥狀的山羊，來自楊凌某養(yǎng)殖場。

1.1.2 犢牛睪丸 采自1日齡犢牛。

1.1.3 主要試劑 M199培養(yǎng)基為Gibco公司產(chǎn)品；胎牛血清、胰酶、二甲基亞砜均為Amresco公司產(chǎn)品；乙醇、氯化鈉、氯化鉀、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鈉、碳酸氫鈉、葡萄糖、瓊脂糖等為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純；PCR相關(guān)試劑為TaKaRa公司產(chǎn)品。

1.1.4 主要儀器 CO2培養(yǎng)箱，高壓蒸汽滅菌器，各量程移液器，離心機(jī)，電子分析天平，冰箱，恒溫循環(huán)水浴鍋，－70℃冰箱，超凈工作臺，倒置顯微鏡，PCR儀，電泳儀等。

1.2 方法

1.2.1 病料采集與處理 采集患病羔羊口唇部結(jié)痂，置5mL離心管中，加入10g／L青、鏈霉素的PBS液3mL，4℃放置過夜。用組織勻漿器將病料充分研磨，2 000r／min離心10min，取上清用0.22μm微孔濾膜過濾，收集濾液，置－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 犢牛睪丸原代細(xì)胞的制備 將犢牛睪丸用750mL／L的酒精消毒，剪去筋膜組織，PBS沖洗睪丸實(shí)質(zhì)組織。將組織剪成小塊，加入2.5g／L胰酶于4℃放置14h后，用PBS液洗滌多次，直至胰酶沖洗干凈，加入無血清M199培養(yǎng)基反復(fù)吹打組織至細(xì)胞完全散開。將犢牛睪丸細(xì)胞懸液移入細(xì)胞培養(yǎng)瓶，37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2條件下培養(yǎng)。

1.2.3 病毒增殖 待培養(yǎng)的犢牛睪丸原代細(xì)胞鋪滿瓶底約80%時(shí)，棄培養(yǎng)基，接種500μL痂毒濾液，在37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2培養(yǎng)箱中作用1h。再加入含50mL／L犢牛血清的M199培養(yǎng)基10mL，37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)。前4代未觀察到明顯的病變（CPE），接毒72h后反復(fù)凍融細(xì)胞3次，收集病毒液，盲傳至第5代犢牛睪丸原代細(xì)胞出現(xiàn)明顯CPE，當(dāng)70%～80%的細(xì)胞發(fā)生病變、脫落時(shí)，將培養(yǎng)細(xì)胞反復(fù)凍融3次，收集病毒液。

1.2.4 病毒滴度測定 收集第5代細(xì)胞毒。參照本實(shí)驗(yàn)室建立的方法［8］測定病毒滴度。主要操作程序如下，用96孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)犢牛睪丸原代細(xì)胞72h后，接種10倍稀釋的病毒液，從10－1～10－10每個(gè)稀釋度接種一列，每孔接種100μL，第11和12列作為細(xì)胞空白對照。然后置于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，連續(xù)7d觀察發(fā)生細(xì)胞病變的孔數(shù)。根據(jù)Reed－Muench氏法計(jì)算病毒的TCID50。

1.2.5 B2L、F1L基因的PCR檢測 用氯仿－異戊醇方法提取第5代病毒液的DNA，參照本實(shí)驗(yàn)室建立的羊口瘡病毒B2L、F1L基因PCR檢測方法［9］進(jìn)行檢測。B2L、F1L引物分別參照登錄號為JN565696.1和HQ221964.1的羊口瘡病毒基因序列設(shè)計(jì)。PCR反應(yīng)體系為：dNTP 2μL，Ex Taq buffer 2.5μL，MgCl22μL，Ex Taq 0.25μL，模板（Template）2μL，引物（Primer）各1μL，ddH2O 18.25μL。PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃ 5min；94℃45s，56℃30s，72℃70s，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃10min。反應(yīng)結(jié)束后，用含15g／L的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測。將PCR產(chǎn)物送往南京金斯瑞公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果與參照序列進(jìn)行比對，以確定擴(kuò)增的片段是否為羊口瘡病毒的基因片段。

2 結(jié)果

2.1 發(fā)病羊的臨床癥狀

此羊場發(fā)病羊?yàn)?0日齡～45日齡，臨床可見病羊口唇部周圍產(chǎn)生紅斑，伴有輕微腫脹。在感染3d～5d內(nèi)產(chǎn)生水皰和膿皰，嚴(yán)重者膿皰破裂后暴露出出血?jiǎng)?chuàng)面。潰爛的膿皰最終融合形成灰色痂皮（圖1）。由于口唇部的病變，引起羔羊采食和吮乳困難，羔羊嚴(yán)重消瘦，有的羔羊發(fā)生繼發(fā)感染。

圖1 羊口瘡發(fā)病羊照片F(xiàn)ig.1 Photoes of lamb infected with Orf virus

2.2 分離病毒引起的細(xì)胞病變觀察

研磨液接種至犢牛睪丸原代細(xì)胞，盲傳至第5代時(shí)，接種的細(xì)胞產(chǎn)生明顯病變。病變細(xì)胞出現(xiàn)折光性增強(qiáng)、變圓、聚堆等現(xiàn)象，后期細(xì)胞發(fā)生皺縮、脫落，CPE達(dá)90%（圖2），而正常對照的犢牛睪丸原代細(xì)胞生長狀態(tài)良好（圖3）。

圖2 接毒72h后發(fā)生細(xì)胞病變的犢牛睪丸原代細(xì)胞（20×）Fig.2 Cytopathic effects in calf testis primary cells 72hafter inoculation（20×）

圖3 正常犢牛睪丸原代細(xì)胞（20×）Fig.3 Normal calf testis primary cells（20×）

2.3 第5代病毒滴度測定

取引起細(xì)胞病變的第5代病毒液100μL進(jìn)行倍比稀釋，將不同稀釋度的羊口瘡病毒液接種到犢牛睪丸原代細(xì)胞上，測定其 TCID50。按 Reed－Muench氏法，測得第5代病毒液滴度為107.66TCID50／mL（表1）。

2.4 分離毒株的PCR檢測

分別用羊口瘡病毒B2L基因和F1L基因的特異性引物擴(kuò)增到540bp和437bp的基因片段，與預(yù)期擴(kuò)增片段大小一致（圖4和圖5），將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測序，測序結(jié)果用DNA Man進(jìn)行比對，B2L基因片段與參比序列JN565696.1的基因序列的相似度為96.57%，F(xiàn)1L的擴(kuò)增片段與參比序列HQ221964.1的基因序列的相似度為96.43%（圖6和圖7），確定分離到羊口瘡病毒。

表1 第5代病毒TCID50的測定Table 1 TCID50determination of 5th generation virus

圖4 B2L基因PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.4 Electrophoretic map of B2Lgene PCR products

3 討論

圖5 F1L基因PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.5 Electrophoretic map of F1Lgene PCR products

近年來，由于各地之間頻繁引種及羊只交易，羊口瘡在全國各地傳播，給我國的養(yǎng)羊業(yè)造成了較為巨大的經(jīng)濟(jì)損失［10］。已有報(bào)道表明，不同羊口瘡病毒分離株之間存在不同程度的基因差異［11］。為了獲得大量的野毒株樣本，本研究通過病毒分離、PCR檢測和病毒滴度測定，獲得了楊凌羊口瘡病毒野毒株。何水林等［12］的研究表明，羊口瘡病毒在犢牛睪丸原代細(xì)胞上連續(xù)傳3代時(shí)，細(xì)胞病變（CPE）穩(wěn)定出現(xiàn)在48h左右，詹述宣等［13］研究發(fā)現(xiàn)，羊口瘡病毒在犢牛睪丸細(xì)胞上初代培養(yǎng)3d后即能見到明顯的CPE。本研究所分離的羊口瘡病毒在犢牛睪丸細(xì)胞上盲傳至第5代才出現(xiàn)明顯的CPE，其所表現(xiàn)的細(xì)胞變圓，折光性增強(qiáng)等細(xì)胞病變效應(yīng)與其他研究者的結(jié)果是一致的。出現(xiàn)這樣的結(jié)果可能與各分離株的強(qiáng)弱、接毒劑量和接毒方式存在一定的關(guān)系。

在測定病毒TCID50時(shí)，需要連續(xù)數(shù)日觀察病變孔數(shù)，對病變孔的判定存在主觀差異，需要多次測定最終確定病毒滴度。已有研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法測定病毒滴度，與傳統(tǒng)方法相比較相關(guān)性較高，在后續(xù)的試驗(yàn)中可以采用此方法測定病毒滴度［14］。

B2L基因和F1L基因都編碼羊口瘡病毒表面囊膜蛋白，其中B2L基因的產(chǎn)物可刺激機(jī)體產(chǎn)生抗羊口瘡病毒的抗體［15］，F(xiàn)1L的產(chǎn)物能促使產(chǎn)生中和抗體［16］。兩者均為羊口瘡病毒的保守性基因，常被用作羊口瘡病毒分子生物學(xué)診斷對象，因此本研究應(yīng)用PCR技術(shù)檢測羊口瘡病毒的這兩個(gè)基因能夠保證檢測結(jié)果的可靠性。B2L基因片段與設(shè)計(jì)引物的陜西株基因相似度為96.57%，而與福建株、廣西株、四川株等的相似度為99%。F1L基因片段與設(shè)計(jì)引物的陜西株相似度為96.43%，與甘肅株、新疆株的相似性為99%［17］。這表明不同的羊口瘡病毒的B2L和F1L基因高度保守，可分析其他毒力基因以深入研究各毒株的差異。

圖6 B2L基因測序及比對結(jié)果Fig.6 The B2Lgene sequencing result and sequence alignment results

圖7 F1L基因測序及比對結(jié)果Fig.7 The F1Lgene sequencing result and sequence alignment results

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