武發(fā)菊，尚勇良，孫玉霞，董文教，安芳蘭，萬玉林，劉學榮，楊進才

（中農威特生物科技股份有限公司，甘肅蘭州 730046）

敘利亞倉鼠腎細胞或稱金黃色倉鼠腎細胞（BHK－21）來源方便，繁殖速度快，質量和外源因子易控制，是經(jīng)世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）推薦作為生產獸用疫苗的細胞，適合于多種疫苗的大規(guī)模工業(yè)化生產［1－3］。而細胞培養(yǎng)的研究則是優(yōu)化培養(yǎng)工藝、提高疫苗產品質量的核心部分［4］。目前，用于BHK－21細胞培養(yǎng)商品化的培養(yǎng)基主要有MEM、DMEM、GMEM、SLM和無血清培養(yǎng)基等。本試驗采用自制的GMEM細胞培養(yǎng)基進行試驗，該培養(yǎng)基是在基礎培養(yǎng)基MEM的基礎上，根據(jù)本室保存的BHK－21懸浮細胞的生長特性，研發(fā)的個性化專用培養(yǎng)基，使用時添加30mL／L的血清。應用此培養(yǎng)基通過批式培養(yǎng)本室保存的3株BHK－21細胞，比較了細胞培養(yǎng)過程中細胞的濃度、細胞活性、比生長速率和細胞周期分布變化等培養(yǎng)特性，以進一步認識BHK－21細胞的培養(yǎng)特性，為大規(guī)模工業(yè)化生產奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 本實驗室保存的懸浮培養(yǎng)細胞種子共有3個，分別是ECACC引進的懸浮培養(yǎng)BHK－21C13－2P株、ATCC引進的 BHK－21－L株和中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所引進的BHK－21－B株，經(jīng)本實驗室馴化適應懸浮培養(yǎng)。

1.1.2 試劑 GMEM培養(yǎng)基（即MEM培養(yǎng)基，含高糖）、胰酶為Hyclone公司產品，使用前按照產品說明書配制；新生牛血清為國產產品，本試驗使用的培養(yǎng)基為GMEM添加30mL／L小牛血清；細胞周期和細胞凋亡率測定試劑盒為碧云天生物技術公司產品；碳酸氫鈉、氫氧化鈉、鹽酸等常用試劑為國產分析純。

1.1.3 主要儀器 細胞計數(shù)儀為德國INNOVATIS公司產品；FACS2Calibur型流式細胞儀為美國BD公司產品；5L生物反應器為美國NBS公司產品。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 從細胞庫中取出 BHK－21C13－2P株、BHK－21－L株和BHK－21－B株3個細胞種子，分別在100mL小方瓶中加入12mL培養(yǎng)基進行復蘇培養(yǎng)，按1∶3～1∶5的接種比例傳代培養(yǎng)。選擇生長良好的貼壁細胞消化后，以細胞密度為0.75×106個／mL轉入搖瓶進行擴大培養(yǎng)。待細胞形態(tài)良好，逐級放大至5L生物反應器進行批式培養(yǎng)試驗（接種密度為0.3×106個／mL）。每隔24h取樣觀察細胞形態(tài)，分析細胞。

1.2.2 細胞計數(shù)與分析

1.2.2.1 細胞形態(tài)的觀察及數(shù)目和活力的測定將取出的細胞懸浮液直接滴在載玻片上顯微鏡下觀察；利用細胞分析儀計數(shù)細胞，分析細胞活力。

1.2.2.2 細胞比生長速率（μ）的計算μ＝lnX2－lnX1／t2－t1

式中X為細胞密度；t為培養(yǎng)時間。

1.2.2.3 細胞周期和細胞凋亡率的測定 采用PI染色法，在流式細胞儀進行細胞周期和細胞凋亡的測定。

2 結果

2.1 3個細胞株培養(yǎng)形態(tài)的比較

從形態(tài)圖1可見，當3株細胞處于最佳狀態(tài)時，在普通顯微鏡下觀察對比，細胞都呈圓球形，邊緣光滑，胞質透光性好，細胞直徑在10μm～15μm之間。不同的是BHK－21C13－2P細胞形態(tài)較大一點，在培養(yǎng)液中單個存在，細胞分散均勻，幾乎不接團；BHK－21－B株在鏡下細胞透亮似水珠，易結團；BHK－21－L株細胞則很少結團。因此，這3種細胞在形態(tài)上無明顯的差異，在顯微鏡下區(qū)別不明顯。

圖1 三種細胞株培養(yǎng)形態(tài)的比較Fig.1 The comparison of culture morphology of three cell lines

2.2 批式培養(yǎng)過程中細胞生長曲線比較

以同一接種密度進行細胞培養(yǎng)，細胞生長曲線（圖2）。3種細胞的生長趨勢基本相同。在0h～24h，細胞處于潛伏期，細胞數(shù)目稍有增加；在培養(yǎng)至24h～48h為指數(shù)生長期，細胞生長代謝旺盛，細胞數(shù)目劇增，為初始濃度的6倍～10倍；在培養(yǎng)至48h～72h，由于營養(yǎng)物質的耗竭、代謝副產物的積累、細胞接觸抑制現(xiàn)象的出現(xiàn)，細胞緩慢生長，使得細胞數(shù)目增加緩慢或未增加，此期為細胞的平穩(wěn)生長期；繼續(xù)培養(yǎng)，細胞數(shù)目驟減，細胞迅速衰亡。另外，比較發(fā)現(xiàn)，ATCC的BHK－21－L細胞株較其他2種細胞提前進入了細胞衰亡期，這可能是由于細胞生長能力強，使營養(yǎng)物質缺乏引起的。

另外，在細胞計數(shù)儀測定細胞密度時，也反映了批式培養(yǎng)生長過程中細胞的平均粒徑大小、結團情況等培養(yǎng)特性（圖3）。在同一初始接種密度（0.3×106個／mL）下，BHK－21－L細胞不僅達到了最大培養(yǎng)密度，即4.3×106個／mL，且結團很少；其次為BHK－21－B細胞，最大培養(yǎng)密度為3.2×106個／mL，細胞易結團；BHK－21C13－2P細胞株在整個培養(yǎng)過程中幾乎不結團，但其最大培養(yǎng)密度只有2.4×106個／mL，我們在長期的培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，該細胞在提高初始接種密度后，最高細胞密度可達5×106個／mL～6×106個／mL。

可見，ATCC的BHK－21－L細胞株在較低的初始接種密度下生長，在前期培養(yǎng)中不僅細胞形態(tài)較好，且細胞數(shù)能增長10倍～15倍，易于放大培養(yǎng)，更適合于細胞規(guī)?；a。

圖2 細胞數(shù)量隨培養(yǎng)時間變化的比較Fig.2 The comparison of cell counts with culture time

圖3 3種細胞株細胞特性的比較Fig.3 The comparison of cell characteristics of three cell lines

2.3 批式培養(yǎng)過程中細胞活性的比較

3種細胞的活力隨培養(yǎng)時間的延長，在48h后逐漸下降。原因可能是在細胞培養(yǎng)的初期，由于營養(yǎng)物質、生存空間等比較充足，溶氧度、pH環(huán)境等比較適合細胞生長，細胞活力比較高。但培養(yǎng)48h后，細胞之間為了爭奪有限的營養(yǎng)物質、生存空間等，必然導致一部分細胞死亡，細胞活力下降。另外，在細胞生長良好時，BHK－21－L細胞株長活性在96%左右，較其他兩株的細胞活性高（圖4）。

圖4 細胞活性隨培養(yǎng)時間變化的比較Fig.4 The comparison of cell activities with culture time

2.4 批式培養(yǎng)過程中比生長速率的比較

從表1可見，BHK－21－L細胞在24h～48h，比生長速率最高；但整體趨勢都是隨著細胞的生長，不同時間的平均比生長速率不同，有一個先升后將的過程。比生長速率的變化與前面細胞生長過程中數(shù)目和活力變化的結論一致，ATCC BHK－21－L細胞株生長速度快，能在較短時間內達到最大細胞密度，是規(guī)?；a口蹄疫疫苗的最佳候選細胞株。

表1 3種細胞比生長速率變化的比較Table 1 The comparison of specific growth rates of three cell lines

2.5 批式培養(yǎng)過程中細胞凋亡率和細胞周期分布變化的比較

由于懸浮培養(yǎng)方式進一步增大了細胞凋亡的比例和幾率，成為維持細胞高密度和高活性的重要障礙。2種細胞凋亡率（表2～表4）。在培養(yǎng)至72h，細胞發(fā)生了明顯的凋亡，隨后凋亡率逐增。BHK－21－L細胞在初始培養(yǎng)不僅細胞活性高，細胞也幾乎未發(fā)生凋亡。而其他2種在培養(yǎng)初期凋亡率較高，但生存維持時間較長。

從細胞周期分布的變化可見，3種細胞變化趨勢相同。由于12h的細胞營養(yǎng)豐富，細胞處于快速生長期，DNA合成旺盛，所以S期細胞比例高，但細胞還未分裂，未達到成熟穩(wěn)定期。隨著培養(yǎng)時間延長（48、72、96h），營養(yǎng)物質的消耗，處于 G0／G1期細胞數(shù)量顯著增加，大部分細胞被阻止在G0／G1期，處于穩(wěn)定期。但也有少部分細胞繼續(xù)進行增殖，處于S期和G2／M。不同之處是BHK－21－L細胞株由于生長速度較快，代謝旺盛，在同一培養(yǎng)基下，營養(yǎng)物質缺乏或代謝產物積累過多，在48h～72h已被完全阻止在 G0／G1，細胞不再增殖；而BHK－21－B株和BHK－21C13－2P細胞株繼續(xù)緩慢生長，在72h～96h才被完全阻止，從而延長了細胞的對數(shù)生長期。可見，從細胞周期的分布變化也反映了利用BHK－21－L細胞株懸浮培養(yǎng)能顯著縮短細胞的生產周期，更適合于規(guī)?；a。

表2 BHK－21C13－2P細胞株批式培養(yǎng)過程中細胞周期和細胞凋亡率的變化Table 2 The changes of cell cycle and apoptosis rate in the process of BHK－21C13－2Pbatch cultivation

表3 BHK－21－B細胞株批式培養(yǎng)過程中細胞周期和細胞凋亡率的變化Table 3 The changes of cell cycle and apoptosis rate in the process of BHK－21－B batch cultivation

表4 BHK－21－L細胞株批式培養(yǎng)過程中細胞周期和細胞凋亡率的變化Table 4 The changes of cell cycle and apoptosis rate in the process of BHK－21－L batch cultivation

2.6 3種細胞懸浮培養(yǎng)過程中其他特性的比較

在長期的懸浮培養(yǎng)過程中，發(fā)現(xiàn)BHK－21C13－2P細胞株極限接種密度為6.0×105個／mL，放大比例為1∶1.5～1∶2，不結團，不貼壁；其它兩種細胞極限接種密度為2.0×105個／mL，放大比例1∶5～1∶10，但BHK－21－B細胞株結團較嚴重。

3 討論

批式培養(yǎng)是懸浮培養(yǎng)工藝中一種重要的培養(yǎng)方式，具有典型的生長期，即潛伏期、指數(shù)生長期、平穩(wěn)期和衰亡期［5－7］。在本試驗中，BHK－21懸浮細胞培養(yǎng)48h細胞達到了最大密度，細胞活性較好，在96%～97%，僅個別細胞發(fā)生凋亡；DNA合成旺盛，在48h～72h大部分細胞被完全阻止在G0／G1期，細胞不再增殖；隨后，部分細胞逐漸發(fā)生凋亡，走向衰亡［8］。這提示我們，在細胞達到指數(shù)生長期前需優(yōu)化培養(yǎng)環(huán)境如更換新鮮培養(yǎng)液［9］、降低代謝產物濃度或采取流加培養(yǎng)等措施［10－12］，可使細胞周期繼續(xù)循環(huán)，細胞不斷增值。

本試驗中3種細胞株在培養(yǎng)特性上各具特色，其中BHK－21C13－2P和BHK－21－B細胞株在鏡下觀察透亮，細胞狀態(tài)好；在批式培養(yǎng)過程中具有典型的生長曲線，細胞生長代謝旺盛。但BHK－21C13－2P細胞株初始接種密度要求高，放大比例小，BHK－21－B細胞株在長期培養(yǎng)過程中易出現(xiàn)細胞結團、易貼壁的現(xiàn)象，從而影響細胞的生長。而BHK－21－L細胞株在具有上述2種細胞的優(yōu)點后，還可達到較高的培養(yǎng)密度，細胞活性值較高，在培養(yǎng)過程中不易結團和貼壁。另外，我們發(fā)現(xiàn)BHK－21C13－2P細胞株極限接種密度為6.0×105個／mL，放大比例為1∶1.5～1∶2，不結團，不貼壁；其它兩種細胞極限接種密度為2.0×105個／mL，放大比例1∶5～1∶10，但BHK－21－B細胞株結團較嚴重。本試驗比生長速率的變化與前面細胞生長過程中數(shù)目和活力變化的結論一致，ATCC BHK－21－L細胞株生長速度快，能在較短時間內達到最大細胞密度，是規(guī)?；a口蹄疫疫苗的候選細胞株。因此，通過上述3種細胞培養(yǎng)特性的比較，BHK－21－L細胞株更適合于規(guī)?；a。

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