姜 帆，張曉文，肖巧喆，鄭小龍，于業(yè)鋒，王 群＊

（1.山東出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東青島 266002；2.青島檢驗(yàn)檢疫技術(shù)發(fā)展中心，山東青島 266002；3.吉林大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 131000）

馬流感（Equine influenza，EI）即馬流行性感冒，是由正黏病毒科A型流感病毒屬馬H7N7亞型和H3N8亞型流感病毒引起的馬屬動(dòng)物的一種急性傳染性疾病，是嚴(yán)重危害馬屬動(dòng)物的重要呼吸系統(tǒng)疾病之一［1］。馬群一旦感染馬流感病毒（Equine influenza virus，EIV），極易大范圍迅速傳播，常呈暴發(fā)性流行，感染率極高，是世界各國(guó)動(dòng)物檢疫部門(mén)重點(diǎn)防范的動(dòng)物傳染病之一［2－3］。我國(guó)也將其列為出入境檢驗(yàn)檢疫的馬屬動(dòng)物必檢疫病。近年來(lái)，隨著動(dòng)物的國(guó)際貿(mào)易，賽馬的國(guó)際交流日益頻繁和我國(guó)社會(huì)經(jīng)濟(jì)的不斷發(fā)展，喜愛(ài)養(yǎng)馬和賽馬的人也越來(lái)越多，其傳播風(fēng)險(xiǎn)也越來(lái)越高，由于該病擴(kuò)散迅速、分布廣泛，一旦暴發(fā)和流行造成的經(jīng)濟(jì)損失極為嚴(yán)重，已引起了廣泛關(guān)注。

目前，檢測(cè)EIV的常規(guī)方法主要有間接EIL SA、RT－PCR和熒光定量RT－PCR，這些方法操作

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒 株 馬 流 感 病 毒 A／馬／新 疆／1／07（H3N8）、馬流感病毒 A／馬／北京／1／74（H7N7）由哈爾濱獸醫(yī)研究所動(dòng)物流感中心提供；馬動(dòng)脈炎病毒（EAV）、馬鼻肺炎病毒（EHV）由山東出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)檢疫實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑 RT－LAMP試劑盒 RNA Amplification Kit、Fluorescent Detection Reagent為L(zhǎng)oopamp榮研生物科技有限公司產(chǎn)品；RNA提取試劑盒 RNeasy Mini Kit、QIAgen One－step RTPCR Kit為QIAgen公司產(chǎn)品；AllPrep DNA／RNA Mini Kit、DNA Marker DL 2 000為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank中登陸的H3N8亞型馬流感的HA基因序列（登錄號(hào)：JQ955612.1、JN084397.1、 CY032945.1 和M73173.1等），通過(guò)MEGA 5.0軟件進(jìn)行基因的對(duì)比選取合適的保守區(qū)域，通過(guò)在線軟件Primer Explorer V4 （http：／／primerexplorer.jp／e／）設(shè) 計(jì)LAMP引物，其中F3和B3是外引物，F(xiàn)IP和BIP為內(nèi)引物，由寶生物工程（大連）有限公司合成。引物序列見(jiàn)表1。

表1 RT－LAMP引物序列Table 1 Primer sequence of RT－LAMP

1.2.2 H3N8亞型馬流感病毒RNA的提取 按照RNeasy Mini Kit說(shuō)明書(shū)提取H3N8亞型EIV的RNA，使用UV－1800紫外分光儀測(cè)定RNA的濃度，將病毒RNA保存于－80℃，備用。

1.2.3 RT－LAMP方法的優(yōu)化 按照 RT－LAMP試劑盒說(shuō)明書(shū)，在0.2mL離心管中依次加入病毒RNA 5μL（≥50ng），2×反應(yīng)緩沖溶液12.5μL，Bst DNA聚合酶1μL，F(xiàn)D染料1μL，引物濃度比（內(nèi)引物與外引物比例為1∶1、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16），補(bǔ)充去離子水至25μL。改變反應(yīng)的溫度（60、61、62、63、64、65 ℃）和反應(yīng)時(shí)間（30、45、60、75、90min）確定最佳反應(yīng)條件。95℃2min終止反應(yīng)，采用直接用肉眼觀察和瓊脂糖凝膠電泳兩種方式來(lái)觀察結(jié)果。

1.2.4 RT－LAMP靈敏度試驗(yàn) H3N8亞型 EIV的RNA按101，102，……109進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)韵♂尯蟮牟《綬NA為模板，分別使用RT－PCR和RTLAMP方法進(jìn)行檢測(cè)。

按照 QIAgen One－step RT－PCR Kit的 說(shuō) 明書(shū)，反應(yīng)體系包括：模板5μL，上、下游引物F3和B3各2μL，QIAGEN One Step RT－PCR Enzyme Mix 0.5μL，10mmol／L each dNTP Mix 1μL，5×One Step RT－PCR buffer 5μL，補(bǔ)充去離子水至25μL。反應(yīng)條件為：50℃30min，95℃15min，之后95℃30s，55℃30s，72℃30s進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后72℃10min。瓊脂凝膠電泳觀察結(jié)果。

按照優(yōu)化的RT－LAMP反應(yīng)體系及反應(yīng)條件對(duì)不同稀釋度的病毒RNA進(jìn)行檢測(cè)。采用目視和瓊脂凝膠電泳兩種方式觀察結(jié)果。

1.2.5 RT－LAMP 特異性試驗(yàn) 按照 AllPrep DNA／RNA Mini Kit說(shuō)明書(shū)，分別提取馬流感病毒A／馬／新疆／1／07 （H3N8）、馬流感病毒 A／馬／北京／1／74（H7N7）、EAV 、EHV 的 RNA／DNA，使用建立的RT－LAMP方法進(jìn)行檢測(cè)。采用瓊脂糖凝膠電泳和目視兩種方法觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 RT－LAMP方法的建立

通過(guò)優(yōu)化，最佳引物濃度為5pmol／μL的外引物F3和B3各1μL，40pmol／μL內(nèi)引物FIP和BIP各1μL。最佳反應(yīng)條件為63℃75min；95℃2min，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 RT－LAMP方法的優(yōu)化Fig.1 Optimization of RT－LAMP method

2.2 RT－LAMP檢測(cè)H3N8亞型EIV靈敏度

運(yùn)用優(yōu)化的RT－LAMP檢測(cè)方法與RT－PCR的方法對(duì)10倍梯度稀釋的病毒RNA同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，RT－LAMP方法的靈敏度比RT－PCR方法高10倍（圖2）。

2.3 RT－LAMP檢測(cè)特異性試驗(yàn)

圖2 RT－LAMP與RT－PCR靈敏度的比較Fig.2 Comparison of sensitivity between RT－LAMP and RT－PCR

為驗(yàn)證所建立的RT－LAMP檢測(cè)方法的特異性，分別以馬流感病毒 A／馬／新疆／1／07（H3N8）、馬流感病毒 A／馬／北 京／1／74 （H7N7）、EAV 、EHV的核酸為模板進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示僅H3N8亞型EIV可擴(kuò)增出條帶并見(jiàn)到綠色熒光，方法的特異性良好（圖3）。

圖3 RT－LAMP檢測(cè)方法的特異性試驗(yàn)結(jié)果Fig.3 Specificity test for RT－LAMP methods

3 討論

近年來(lái)，馬流感在歐洲、北美州、南美州、大洋州、亞洲、非洲超過(guò)30個(gè)國(guó)家都有發(fā)生的報(bào)道，表現(xiàn)出全球性流行、流行范圍廣和發(fā)病頻次高的趨勢(shì)［6－8］。為我國(guó)普查與檢疫，尤其對(duì)正在興起的賽馬業(yè)和發(fā)展提供了監(jiān)測(cè)方法具有重要意義。根據(jù)病毒的抗原性不同，馬流感病毒分為H3N8和H7N7兩種亞型，H7N7亞型流感病毒導(dǎo)致的馬流行性感冒病例在近40年來(lái)都未發(fā)現(xiàn)，已經(jīng)不作為通常檢疫的目標(biāo)，馬流感病毒H3N8亞型的檢測(cè)在馬流感病的診斷中占重要的地位。目前馬流感病毒的檢測(cè)方法有雙抗體夾心ELISA、RT－PCR、間接ELISA抗體檢測(cè)、抗原捕捉ELISA檢測(cè)、熒光定量檢測(cè)、基因芯片檢測(cè)和RT－LAMP檢測(cè)等。

LAMP技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用到很多病原體的核酸檢測(cè)中［9－13］，本研究針對(duì)馬流感病毒 H3N8亞型基因的保守序列，設(shè)計(jì)特異性引物，優(yōu)化反應(yīng)條件，建立了馬流感病毒的LAMP檢測(cè)方法。試驗(yàn)結(jié)果表明，該方法操作簡(jiǎn)便，耗時(shí)短，設(shè)備要求低，檢測(cè)結(jié)果是普通RT－PCR靈敏度的10倍，可以應(yīng)用于進(jìn)出口馬流感病毒的檢疫。在反應(yīng)體系中添加熒光染料后，可通過(guò)肉眼觀察判斷有無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物，無(wú)需電泳，既可避免電泳過(guò)程中其他雜質(zhì)DNA的污染，又減少了實(shí)驗(yàn)室環(huán)境污染，尤其是在疫病防控的第一防線基層哨點(diǎn)部門(mén)或現(xiàn)場(chǎng)工作中，由于所需檢測(cè)條件簡(jiǎn)單，LAMP技術(shù)更具備廣泛的應(yīng)用前景。我們對(duì)LAMP技術(shù)在H3N8EIV檢測(cè)中的應(yīng)用和評(píng)估也為今后該技術(shù)的推廣利用積累了實(shí)驗(yàn)室經(jīng)驗(yàn)，將會(huì)在疾病的早期診斷及預(yù)防控制方面發(fā)揮重要作用。

［1］孫高超，畢可東，張 娜，等.馬流感簡(jiǎn)介［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2008，29（8）：115－116.

［2］張志誠(chéng)，宋建德，楊 楠，等.全球馬流感發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)狀況研究［J］.中國(guó)動(dòng)物檢疫，2010（12）：45－48.

［3］楊建德，相文華.我國(guó)馬流感的研究現(xiàn)狀［J］.黑龍江畜牧獸醫(yī)，2002（3）：42－44.

［4］戴伶俐，李雪峰，相文華.馬流感診斷方法研究進(jìn)展與應(yīng)用概況［J］.中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2010（2）：157－160.

［5］Notomi T，Okayama H，Masubuchi H，et al.Loop－mediated isothermal amplification of DNA［J］.Nucleic Acids Research，2000，28（12）：e63－e63.

［6］Imai M，Ninomiya A，Minekawa H，et al.Development of H5－RT－LAMP （loop－mediated isothermal amplification）system for rapid diagnosis of H5avian influenza virus infection［J］.Vaccine，2006，24（44）：6679－6682.

［7］Nemoto M，Imagawa H，Tsujimura K，et al.Detection of equine rotavirus by reverse transcription loop－mediated isothermal amplification （RT－LAMP）［J］.J Vet Med Sci／Japan Soc Vet Sci，2010，72（6）：823－826.

［8］Curtis K A，Niedzwiedz P，Youngpairoj A S，et al.Real－time detection of HIV－2by reverse transcription，loop－mediated isothermal amplification［J］.J Clin Microbiol，2014：JCM.00935－14.

［9］Martella V，Elia G，Decaro N，et al.An outbreak of equine influenza virus in vaccinated horses in Italy is due to an H3N8 strain closely related to recent North American representatives of the Florida sub－lineage［J］.Vet Microbiol，2007，121（1）：56－63.

［10］Ito M，Nagai M，Hayakawa Y，et al.Genetic analyses of an H3N8influenza virus isolate，causative strain of the outbreak of equine influenza at the kanazawa racecourse in japan in 2007［J］.J Vet Med Sci／Japan Soc Vet Sci，2008，70（9）：899－906.

［11］Newton J R，Daly J M，Spencer L，et al.Description of the outbreak of equine influenza（H3N8）in the United Kingdom in 2003，during which recently vaccinated horses in Newmarket developed respiratory disease［J］.Vet Rec：J Bri Vet Asso，2006，158（6）.

［12］彭 宜，謝芝勛，劉加波，等.禽流感病毒RT－LAMP檢測(cè)技術(shù)的建立［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2012，33（12）：43－46.

［13］唐景峰，周康平，韓振偉，等.豬瘟病毒熒光定量RT－PCR和RT－LAMP快速檢測(cè)方法的建立［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2014，35（3）：1－5.