李慶德，鄭錦坤，李旭桂 ，黃紅雯 ，張 毅，卞益民，羅啟年

(1.廣東省粵北人民醫(yī)院，廣東 韶關(guān) 512000;2.廣東省韶關(guān)市食品藥品檢驗所，廣東 韶關(guān) 512000;3.麗珠集團(tuán)利民制藥廠藥物研究所，廣東 韶關(guān) 512000)

1 儀器與試藥

Agilent 1260型高效液相色譜儀。醒酒護(hù)肝口服液(粵北人民醫(yī)院，批號為 20130301，20130302，20130303);槲皮素對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號為100081－200907);甲醇(色譜純，美國TEDIA公司);純化水;磷酸(分析純，廣州化學(xué)試劑廠)，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件[2－3]及系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱:Kromasil C18柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm);流動相:甲醇 －0.4% 磷酸溶液(50∶50);流速:1.0 mL/min;檢測波長:360 nm;柱溫:25℃;進(jìn)樣量:10 μL。理論板數(shù)按槲皮素峰計算應(yīng)不低于8 000。取陰性對照品溶液、對照品溶液和供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣，在擬訂色譜條件下，主峰的理論板數(shù)8 000，與其他雜質(zhì)峰的分離度 R=2.3，表明系統(tǒng)適用性良好，且陰性對照品溶液在槲皮素吸收峰處無干擾。色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

2.2 溶液制備[4]

稱取槲皮素對照品10.98 mg，精密稱定，置50 mL容量瓶中，用80%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為貯備液;精密吸取貯備液3.0 mL，置20 mL容量瓶中，用80%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得對照品溶液。精密量取醒酒護(hù)肝口服液5 mL，置10 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，濾過，棄去初濾液，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。按處方比例稱取除枳子外其余4味藥材，按工藝提取制得的陰性樣品，精密量取5 mL，按供試品溶液制備方法制得陰性對照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察:分別精密量取對照品貯備液 1，2，3，4，5 mL，分別置20 mL容量瓶中，用80%甲醇稀釋至刻度，搖勻，得系列對照品溶液。精密吸取上述溶液各10 μL，注入液相色譜儀，按擬訂色譜條件測定。以對照品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程 Y=3.810 67×104X －10 762.7，r=0.999 5(n=5)。結(jié)果表明，槲皮素進(jìn)樣量在 0.109 8 ～0.549 0 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

精密度試驗:取同一對照品溶液，精密量取5 mL，取6份，由3人在不同時間、同一臺儀器依法測定槲皮素含量。結(jié)果的 RSD=0.40%(n=6)，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗:取同一供試品溶液，精密量取5 mL，分別于0，2，4，6，8，10 h 時進(jìn)樣測定含量。結(jié)果的 RSD=0.20%(n=6)，表明供試品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗:取已知含量的同一批樣品，精密量取5 mL，取6份，依法檢測。結(jié)果含量的 RSD=0.50%(n=6)，表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗:精密吸取已知含量的樣品(批號為20130301)9份，置20 mL容量瓶中，每份4 mL，分別精密加入槲皮素對照品溶液(每 1 mL 含槲皮素 32.94 μg)2，4，6 mL，各 3 份，混勻，依法測定。結(jié)果見表1。

表1 槲皮素加樣回收試驗結(jié)果(n=9)

2.4 樣品含量測定

取3批樣品(批號為130301，130302，130303)溶液和對照品溶液，按擬訂色譜條件用外標(biāo)法測定其槲皮素的含量。結(jié)果3批樣品含量分別為 40.24，46.20，40.64 μg/mL。

3 討論

供試品溶液的制備:曾考慮先用醋酸乙酯提取，但操作煩瑣，且槲皮素流失量大，故選用水直接稀釋進(jìn)樣，既能減少槲皮素的損失，又能省時、省試劑，減少環(huán)境污染。

檢測波長的選擇:取槲皮素對照品溶液，于280～450 nm波長范圍進(jìn)行掃描，結(jié)果槲皮素于360 nm波長處有最大吸收，故檢測波長為360 nm。

流動相的選擇:流動相用甲醇－0.4%磷酸(55∶45)和乙腈－0.5%磷酸溶液(33∶67)，均達(dá)不到理想的分離效果;以甲醇－0.4%(50∶50)為流動相時，主峰與其他雜質(zhì)分離度和峰形都理想，故選擇該流動相。

含量限定的測定:3批樣品平均含量為42.36 μg/mL，且批次間含量差距不大，由于無法考察更多批次枳子的槲皮素含量，因此含量限度的制訂結(jié)合將來的覆蓋面，槲皮素的相對含量較低，檢測允許一定的誤差范圍等因素，根據(jù)實測結(jié)果，且參照中藥的有關(guān)資料，含量幅度相對較寬，將含量限度定為每1 mL含槲皮素(C15H10O7)不得少于 30 μg。

[1]李慶德，鄭錦坤，賴水招，等.醒酒護(hù)肝口服液對小鼠酒精性肝損傷的保護(hù)作用[J].中國藥業(yè)，2014，23(3):14 －15.

[2]宋粉云，張德志，鐘兆健，等.HPLC法測定枳子中槲皮素的含量[J].中國新藥與臨床藥理，2006，9(17):361－363.

[3]孫學(xué)惠，楊文業(yè)，韓 冰，等.枳子的提取工藝及含量測定[J].中國藥師，2011，14(3):385－387.

[4]曾 嶸，文 為，張 洪，等.高效液相色譜法測定枳子中槲皮素的含量[J].醫(yī)藥導(dǎo)報，2006，25(8):833 －834.