覃興昆，程道海

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，廣西 南寧 530021)

萬古霉素的安全治療范圍較窄，且具有耳、腎毒性，故臨床應(yīng)用時(shí)需要監(jiān)測(cè)血藥濃度，其有效范圍為峰濃度25～40 mg/L、谷濃度5～10 mg/L[1]。采用內(nèi)標(biāo)法測(cè)定萬古霉素血藥濃度[2－4]，條件苛刻;血漿處理過程煩瑣[5]，或使用如三氯甲烷、二氯甲烷等有害有機(jī)溶劑[6－7];流動(dòng)相采用乙腈 － 緩沖鹽系統(tǒng)[2，8－9]，成本高且毒性大。筆者采用外標(biāo)法，并對(duì)血漿中萬古霉素的提取過程等條件進(jìn)行了改進(jìn)，操作簡單，結(jié)果準(zhǔn)確?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

LC－10ATVP型高效液相色譜儀(日本島津);DF110型電子分析天平(江蘇常熟衡器廠);PHS－3C型精密pH計(jì)(上海雷磁儀器廠);XW－80A型渦旋混合器(上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠);TDX FLX75003530/02型高速離心機(jī)(美國雅培公司);TF－50型溶劑過濾器(天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);SHB－Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司);SB2200型超聲儀(上海Branson公司)。萬古霉素對(duì)照品(中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)130360－200301，含量為100%);人新鮮血漿(廣西南寧市中心血站);甲醇(色譜級(jí)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司)，磷酸二氫鉀、磷酸、硫酸鋅均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:Hypersil ODS－2 C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，Thermo公司);流動(dòng)相:25 mmol/L磷酸二氫鉀(用磷酸調(diào)pH至3.2)－ 甲醇(83 ∶17);柱溫:25 ℃;流速:1.0 mL/min;檢測(cè)波長:230 nm;進(jìn)樣體積:20 μL。

2.2 溶液制備

精密稱取萬古霉素對(duì)照品0.101 2 g，用蒸餾水溶解并定容至50 mL，配制成質(zhì)量濃度為2 024 mg/L的萬古霉素對(duì)照品貯備液。稱取硫酸鋅30.0 g，用蒸餾水溶解并定容至100 mL，配制成30%硫酸鋅溶液，作為沉淀劑。所有配制成的溶液置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 血樣處理

取血漿 450 μL，置 1.5 mL Eppendorf管中，加入沉淀劑 50 μL，渦旋混勻1 min，置50℃水浴鍋中加熱10 min，取出，10 900 r/min離心5 min，取上清液進(jìn)樣。

2.4 方法學(xué)考察

專屬性考察:取萬古霉素對(duì)照品貯備液，用蒸餾水稀釋成質(zhì)量濃度為5 mg/L的對(duì)照品溶液，直接進(jìn)樣;另取空白血漿、空白血漿+萬古霉素對(duì)照品，按2.3項(xiàng)下方法操作。結(jié)果萬古霉素峰形較好，血漿中內(nèi)源性雜質(zhì)對(duì)萬古霉素測(cè)定無干擾。色譜圖見圖1。

線性關(guān)系考察:取萬古霉素對(duì)照品貯備液，用空白血漿稀釋成質(zhì)量濃度為 1，2，5，10，20，40，60，80，100 mg/L 的對(duì)照品溶液，按2.3項(xiàng)下方法操作，取20 μL進(jìn)樣測(cè)定，以質(zhì)量濃度(X)對(duì)峰面積(Y)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程 Y=2×10－5X+0.381 5(r=0.999 6)。結(jié)果表明，萬古霉素質(zhì)量濃度在1～100 mg/L范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。定量下限為1 mg/L，按信噪比法得檢測(cè)限(LOD)為 0.2 mg/L。

回收率試驗(yàn):取萬古霉素對(duì)照品貯備液，用空白血漿稀釋成質(zhì)量濃度為 5，20，60 mg/L的對(duì)照品血漿各 5份，取 450 μL，按2.3項(xiàng)下方法操作，依法測(cè)定，結(jié)果見表1。

圖1 高效液相色譜圖

表1 萬古霉素加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=15)

精密度試驗(yàn):取回收率試驗(yàn)項(xiàng)下低、中、高3種質(zhì)量濃度含藥血樣各1份，1 d內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣5次以及連續(xù)3 d內(nèi)進(jìn)樣。按峰面積計(jì)算，日內(nèi) RSD 分別為 3.61%，3.52%，2.93%(n=15)，日間RSD分別為 5.34% ，4.28%，4.06%(n=15)，表明儀器精密度良好。

3 討論

檢測(cè)方法改進(jìn):因內(nèi)標(biāo)法易受干擾，實(shí)驗(yàn)條件不易控制。本試驗(yàn)采用外標(biāo)法測(cè)定提取過程簡單、無雜質(zhì)干擾。

檢測(cè)條件優(yōu)化:1)血漿處理，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)RP－HPLC測(cè)萬古霉素血藥濃度的血漿處理方法有固相萃取法[5，10]、液－液萃取法[7，11]、高氯酸沉淀法[12]、三氯醋酸沉淀法[13]、硫酸鋅沉淀法[2－3，8]等，其中以硫酸鋅沉淀法更簡便、安全，但沉淀蛋白的效果與試驗(yàn)時(shí)沉淀劑的濃度、用量以及操作時(shí)環(huán)境的溫度有關(guān)。最終確定血漿經(jīng)30%硫酸鋅(450 μL血漿中只需加入沉淀劑50 μL)50℃水浴中加熱10 min，沉淀劑用量少可大大提高檢測(cè)的靈敏度。2)流動(dòng)相，采用25 mmol/L磷酸二氫鉀溶液(用磷酸調(diào)pH至3.2)－甲醇(83∶17)為流動(dòng)相，萬古霉素峰形較好，并無袁孔現(xiàn)等[3]報(bào)道的拖尾現(xiàn)象，血漿中內(nèi)源性雜質(zhì)對(duì)萬古霉素測(cè)定無干擾，流動(dòng)相中緩沖鹽濃度較低，對(duì)色譜柱的損害較小。甲醇替代了乙腈，毒性和成本均降低，更適合在治療藥物監(jiān)測(cè)中推廣應(yīng)用。3)檢測(cè)波長選擇，多數(shù)采用236 nm，少數(shù)采用230 nm[4]和210 nm[14]，但發(fā)現(xiàn)萬古霉素的吸收度于230 nm處大于另外2個(gè)波長處，故采用230 nm作為檢測(cè)波長。

本試驗(yàn)提取方法簡單靈敏，峰形好，無內(nèi)源性雜質(zhì)干擾，回收率高(＞90%)，精密度好(＜6%)，線性范圍寬(1 ～100 mg/L)，適用于基層醫(yī)院的治療藥物血藥濃度監(jiān)測(cè)。

[1]《中國國家處方集》編委會(huì).中國國家處方集(化學(xué)藥品與生物制品卷)[M].北京:人民軍醫(yī)出版社，2010:992－995.

[2]羅 奕，劉 文，鄧 楠，等.萬古霉素血藥濃度監(jiān)測(cè)方法的建立及穩(wěn)定性考察[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17(20):133－135.

[3]袁孔現(xiàn)，黃義澤，毛名揚(yáng)，等.RP－HPLC法測(cè)定萬古霉素血藥濃度[J].安徽醫(yī)藥，2010，14(2):163 －165.

[4]張 虹，方 昱，李 英，等.反相高效液相色譜法測(cè)定臨床聯(lián)合用藥時(shí)血漿中萬古霉素濃度[J].藥物分析雜志，2008，28(4):591－594.

[5]張文娟，宋新文，汪 洋，等.固相萃取高效液相色譜法測(cè)定萬古霉素血藥濃度[J].中國臨床藥理學(xué)雜志，2011，27(2):149－151.

[6]錢南萍，喬 峰，王 華，等.HPLC和微生物法測(cè)定萬古霉素的血藥濃度[J].中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)雜志，2009，26(11):937－940.

[7]杜貫濤，謝小菊，劉廣軍，等.高效液相色譜法測(cè)定人血漿中萬古霉素質(zhì)量濃度[J].中國藥業(yè)，2009，18(13):17－18.

[8]楊小英，葛文佳.萬古霉素血藥濃度快速測(cè)定方法的建立[J].西北藥學(xué)雜志，2010，25(3):163 －165.

[9]宋新文，許 瓊，汪 洋，等.HPLC法測(cè)定人血清中萬古霉素的濃度[J].中國藥房，2010，21(18):1 663 －1 665.

[10]程 鋼，周述香，曾 玲，等.固相萃取結(jié)合高效液相色譜測(cè)定人血漿中萬古霉素的濃度[J].中南藥學(xué)，2010，8(10):742－745.

[11]萬麗麗，余 奇，李 顏，等.高效液相色譜法測(cè)定血漿中去甲萬古霉素和萬古霉素濃度[J].中國藥師，2008，11(8):998－1 000.

[12]崔艷麗，武 峰.HPLC法同時(shí)快速測(cè)定萬古霉素和去甲萬古霉素的血藥濃度[J].中國醫(yī)院用藥評(píng)價(jià)與分析，2011，11(10):920－922.

[13]林秀麗，朱金平，費(fèi) 燕.HPLC法快速測(cè)定萬古霉素和去甲萬古霉素的血藥濃度[J].中國臨床藥學(xué)雜志，2011，20(4):231－234.

[14]林玉仙，蘇煌財(cái).高效液相色譜法測(cè)定萬古霉素的血藥濃度[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2009，29(8):637 －639.