杜敬霆，孫朋飛，趙宇華，張昕*

(1.浙江農(nóng)林大學(xué)林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，浙江 臨安 311300;2.浙江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物研究所，杭州 310058)

隨著現(xiàn)代工業(yè)的發(fā)展，染料已經(jīng)廣泛應(yīng)用于印染、紡織、食品、藥品和化妝品等行業(yè).在我國，染料的年產(chǎn)量達(dá)到15萬t，其中約有2000 ～3000 t染料會直接隨著廢水排入到環(huán)境中，我國的染料污染位居世界前列.在所有染料中，偶氮染料是目前工業(yè)上應(yīng)用最為廣泛的一類［1］.它具有偶氮基，兩端連接芳基，常用于紡織品的印染工藝中.據(jù)統(tǒng)計，在目前的染料品種中高達(dá)半數(shù)以上為偶氮染料，且該染料結(jié)構(gòu)復(fù)雜，在水環(huán)境中能長期保持穩(wěn)定.此外，偶氮染料結(jié)構(gòu)中的芳香烴類化合物很難被去除，分解后能產(chǎn)生20多種致癌芳香胺，經(jīng)過活化作用可改變?nèi)梭w的DNA結(jié)構(gòu)從而引起病變和誘發(fā)癌變［2］.因此，偶氮染料廢水必須在排放前進(jìn)行無害化處理.目前，已有多種處理偶氮染料廢水的方法，其中物理吸附與微生物脫色被認(rèn)為是最有效且對環(huán)境無害的手段［3］.

殼聚糖是自然界中一種帶正電荷的多糖，廣泛分布于甲殼類動物、昆蟲外殼和真菌的細(xì)胞壁中，年產(chǎn)量上百億噸.殼聚糖具有生物兼容性、可降解性、無毒、生理惰性、抗菌性和重金屬離子螯合性等優(yōu)良特性［4］.生物炭是以農(nóng)業(yè)廢棄秸稈為原料，在限氧條件下熱裂解而成，具有孔隙豐富、對染料吸附性強(qiáng)等特點［5］.由于均具有價廉、高效及不會對環(huán)境產(chǎn)生二次污染的特性，目前采用殼聚糖與生物炭進(jìn)行有毒污染物質(zhì)的吸附已成為新的研究熱點，但迄今為止國內(nèi)外尚未有殼聚糖與生物炭相結(jié)合制備微球用來吸附染料的相關(guān)報道.

本研究綜合考慮生物炭空隙豐富、表面積大、吸附性強(qiáng)及殼聚糖可降解、生物兼容性好的優(yōu)點制備了殼聚糖-生物炭微球制劑，并以典型偶氮染料甲基紅為材料研究了殼聚糖-生物炭微球制劑對甲基紅的吸附動力學(xué)及吸附機(jī)制.利用人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)建模分析了pH、溫度、染料初始質(zhì)量濃度和吸附時間對吸附量的影響.在取得良好吸附效果的基礎(chǔ)上，本研究將高效脫色菌株Bacillus sp.UN2包埋在微球中，通過比較殼聚糖-生物炭微球菌劑與殼聚糖-生物炭微球無菌制劑、微生物單獨施用的吸附效果，明確了包埋微生物的微球菌劑的增益吸附效應(yīng)，實驗結(jié)果可為吸附劑-微生物組合制劑對環(huán)境中偶氮類染料去除的開發(fā)利用提供初步的理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種來源 甲基紅高效降解菌株Bacillus sp.UN2為本實驗室分離保藏［6］.

1.1.2 材料及培養(yǎng)基 殼聚糖(黏度50～800 mPa?s，脫乙酰度80% ～95%)和甲基紅均為國產(chǎn)分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司.生物炭由玉米秸稈在400℃條件下熱解制備所得，粉碎后過篩，烘干至恒質(zhì)量，冷卻后保存在密封袋中備用.

Luria-Bertani培養(yǎng)基 (LB，pH 7.1):10 g/L 蛋白胨，5 g/L酵母膏，10 g/L NaCl(固體培養(yǎng)基含2%瓊脂);在115℃滅菌30min，用于微生物培養(yǎng).

甲基紅溶液配制:稱取1000 mg甲基紅粉末溶于少量乙醇中，移入(1000 ±0.4)mL容量瓶內(nèi)定容作為質(zhì)量濃度為1000 mg/L的母液保存，用時稀釋到試驗所需質(zhì)量濃度.

脫色研究所用的無機(jī)鹽培養(yǎng)基配方:5.1 g/L K2HPO4，3.0 g/L KH2PO4，5 g/L NaCl，2.0 g/L 葡萄糖，最適pH條件.

1.2 試驗方法

1.2.1 微球純材料制劑及菌劑的制備 微球純材料制劑:稱取2.5 g殼聚糖粉末加入到100 mL體積分?jǐn)?shù)為2%的乙酸溶液中，磁力攪拌1 h，靜置過夜，使殼聚糖充分溶解，配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.5%的殼聚糖溶液.在殼聚糖溶液中加入2%生物炭，在持續(xù)磁力攪拌下，將上述殼聚糖溶液用裝有5號針頭的注射器逐滴加到100 mL凝結(jié)液(含2 mol/L NaOH)中，制得多孔凝膠微球.殼聚糖微球制成后，在室溫下放置過夜，然后用蒸餾水洗至中性，于4℃冰箱中保存待用.

微球菌劑的制備:在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.5%的殼聚糖溶液中加入2%生物炭，再加入干質(zhì)量為0.05 g的菌株UN2，而后依照微球純材料制劑方法制成微球菌劑.

1.2.2 溶液pH對微球純材料制劑吸附量的影響稱取1 g殼聚糖-生物炭微球加入到100 mL質(zhì)量濃度為200 mg/L、pH值范圍1.0～10.0的甲基紅溶液中.在恒溫30℃、120 r/min下振蕩90min后，分別取不同處理上清液用分光光度計測定甲基紅濃度，研究pH值對吸附量的影響.吸附量計算方法:

式中:qe為吸附量，mg/g;C0和Ce分別為初始和平衡液質(zhì)量濃度，mg/L;V為溶液體積，L;m為吸附劑質(zhì)量，g.

1.2.3 等溫吸附試驗 稱取1 g微球分別加入到100 mL初始質(zhì)量濃度為50～500 mg/L的甲基紅溶液中，在溫度分別為20、30和40℃條件下振蕩90min，取上清液.使用分光光度計對上清溶液進(jìn)行檢測，計算吸附量.

1.2.4 吸附熱力學(xué)試驗 吉布斯自由能變ΔG0是判斷吸附過程能否自發(fā)進(jìn)行的基本條件，在試驗溫度20～40℃范圍內(nèi)選擇5個溫度，計算得到吸附過程中的熱力學(xué)參數(shù) ΔG0、熵變 ΔS0和焓變ΔH0.

1.2.5 吸附動力學(xué)試驗 稱取1 g殼聚糖微球加入到100 mL初始質(zhì)量濃度分別為100、200和300 mg/L的甲基紅溶液中，在溫度30℃、振蕩90min(120 r/min)過程中，每隔10min取樣，使用分光光度計對上清溶液進(jìn)行檢測，計算吸附量.

1.2.6 人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型構(gòu)建 本研究應(yīng)用人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)［7］模擬殼聚糖-生物炭微球吸附甲基紅的過程.選取200組實驗數(shù)據(jù)構(gòu)建神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型，數(shù)據(jù)集分為3部分:150個作為訓(xùn)練集，25個作為驗證集，25個作為測試子集.輸入層:pH 1.0～10.0，溫度20～40℃，染料初始質(zhì)量濃度50～500 mg/L，吸附時間10～90min;輸出層為微球?qū)谆t的吸附量.當(dāng)訓(xùn)練曲線趨于給定的均方差(mean square error，MSE)值時，神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型訓(xùn)練停止，完成建模.數(shù)據(jù)分析供試的4個參數(shù)(pH值，溫度，染料初始質(zhì)量濃度，吸附時間)對殼聚糖-生物炭微球吸附量影響的權(quán)重比例.

1.2.7 微球菌劑的增益脫色試驗 稱取1 g包埋微生物的微球菌劑加入到初始質(zhì)量濃度為1000 mg/L的甲基紅溶液中，在30℃、pH 3.0條件下，120 r/min振蕩90min，取上清液測定后計算脫色率.同時，設(shè)置只含有純吸附材料的微球制劑和僅含有與微生物菌劑中含量相等的微生物純菌處理.上述所有吸附實驗均重復(fù)3次，利用分光光度計在最大吸收波長410 nm處測定水溶液中甲基紅的吸光值，計算脫色率.

式中:Ac為對照組的吸光值;Af為試驗組的吸光值.

2 結(jié)果與分析

2.1 pH值對吸附量的影響

pH值是影響殼聚糖-生物炭微球?qū)谆t吸附的重要因素.溶液中氫離子濃度不僅影響包埋材料殼聚糖和生物炭表面的官能團(tuán)、電荷量，而且對甲基紅的形態(tài)結(jié)構(gòu)也有一定的影響.從圖1可以看出，在pH 1～3的范圍內(nèi)，吸附量隨著pH值的增加而增加，當(dāng)pH為3時，殼聚糖-生物炭微球?qū)谆t的吸附量達(dá)到最大值，此后隨著pH值的升高吸附量快速下降，最后趨于平穩(wěn).

圖1 pH值對殼聚糖-生物炭微球制劑吸附甲基紅的影響Fig.1 Effects of pH on the adsorption capacity of chitosan-biochar microsphere for methyl red

2.2 染料初始質(zhì)量濃度與溫度對吸附量的影響

從圖2可以看出:微球制劑對甲基紅的吸附量隨著染料初始質(zhì)量濃度的升高而明顯增加;低溫更有利于微球?qū)谆t的吸附，本試驗在甲基紅初始質(zhì)量濃度為500 mg/L、溫度為20℃時，吸附量達(dá)到最大值(460 mg/g).

2.3 等溫吸附

圖2 染料初始質(zhì)量濃度與溫度對殼聚糖-生物炭微球制劑吸附甲基紅的影響Fig.2 Effects of initial dye concentration and temperature on the adsorption capacity ofchitosan-biocharmicrosphere for methyl red

Langmuir［8］等溫吸附方程和 Freundlich［9］等溫吸附方程已廣泛用于研究染料的等溫吸附特性.吸附過程適合何種方程主要取決于決定系數(shù)R2值，當(dāng)R2＞0.99時擬合方程成立.

式中:Ce為平衡時溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，mg/g;qe為吸附量，mg/g;KL為朗繆爾吸附平衡常數(shù)，L/mg;Qmax為最大吸附量，mg/g;KF為Freundlich常數(shù)，L/g;n為Freundlich常數(shù).

殼聚糖-生物炭微球?qū)谆t的等溫吸附實驗數(shù)據(jù)見表1.分析發(fā)現(xiàn)本研究的等溫吸附過程符合Freundlich方程，R2均在0.99以上.Freundlich方程中的參數(shù)KF隨溫度升高而降低，表示吸附能力隨溫度升高而減弱.據(jù) Yang等［10］報道，F(xiàn)reundlich方程中的參數(shù)n值在2～10的范圍內(nèi)表示有良好的吸附過程發(fā)生.在本試驗中只有當(dāng)溫度為20℃時，n值才在這一范圍內(nèi)，同時吸附量達(dá)到最大，進(jìn)一步證實低溫更有利于吸附過程發(fā)生.

2.4 吸附熱力學(xué)

吸附熱力學(xué)參數(shù)可以反映殼聚糖-生物炭微球吸附甲基紅的熱力學(xué)性質(zhì)及吸附機(jī)制.相關(guān)的熱力學(xué)參數(shù)可以通過以下方程［11］計算:

表1 殼聚糖-生物炭微球吸附甲基紅的等溫吸附常數(shù)Table 1 Adsorption isotherm constants for the adsorption of methyl red onto the chitosan-biochar microsphere at various temperatures

式中:ΔG0、ΔS0和ΔH0分別表示系統(tǒng)吉布斯自由能變化、熵變化和焓變化;T為絕對溫度，K;K為反應(yīng)平衡常數(shù);R為氣體常數(shù)，J/(mol?K).

從表2中可以看出:ΔG0值均為負(fù)值，說明殼聚糖-生物炭微球制劑對甲基紅的吸附為自發(fā)過程［12］;隨著溫度逐步升高(從20 ℃到 40 ℃)，微球制劑對甲基紅吸附的自發(fā)度降低;ΔS0均大于0，意味著溫度升高將增加微球吸附甲基紅系統(tǒng)的無序性，因而不利于反應(yīng)的進(jìn)行;ΔH0均為負(fù)值，表明此過程為放熱過程，溫度升高可抑制甲基紅在微球上的吸附［13］.該試驗數(shù)據(jù)進(jìn)一步從熱力學(xué)角度解釋了較低溫度有利于吸附進(jìn)行的原因.

表2 殼聚糖-生物炭微球在吸附甲基紅過程中的熱力學(xué)參數(shù)Table 2 Thermo-dynamic parameters for the adsorption of methyl redonto the chitosan-biochar microsphere

2.5 吸附動力學(xué)

2.5.1 動力學(xué)方程 應(yīng)用Lagergren準(zhǔn)一級動力學(xué)方程與準(zhǔn)二級動力學(xué)方程模型對圖3的吸附動力學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析［14-15］.2種動力學(xué)模型的線性方程分別表達(dá)如下:

式中:qt為t時刻的吸附量，mg/g;qe為達(dá)到平衡時的吸附量，mg/g;k1為準(zhǔn)一級動力學(xué)速率常數(shù)，min-1;k2為準(zhǔn)二級動力學(xué)速率常數(shù)，g/(mg?min).數(shù)據(jù)擬合后的結(jié)果如表3所示.試驗結(jié)果與

Lagergren準(zhǔn)二級動力學(xué)方程擬合效果較好，R2均大于0.99.隨著甲基紅初始質(zhì)量濃度的增大，吸附量和吸附速率均增加.

2.5.2 Elovich方程［16］該方程是對吸附過程中的吸附作用與解吸附作用進(jìn)行研究，表達(dá)如下:

式中:qt為t時刻的吸附量，mg/g;α為吸附速率常數(shù)，g/(mg?min);β 為解吸附常數(shù)，g/mg.

結(jié)果(表4)顯示:試驗所得數(shù)據(jù)與Elovich方程有良好的擬合，R2均在0.99以上;隨著染料初始質(zhì)量濃度的增加，吸附常數(shù)α逐漸增大，解吸附常數(shù)β逐漸降低，吸附常數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于解吸附常數(shù)，表明在該過程中吸附作用遠(yuǎn)大于解吸附作用，即吸附占據(jù)主導(dǎo)地位，進(jìn)一步證明了殼聚糖-生物炭微球具有優(yōu)良的吸附性能.

表3 Lagergren準(zhǔn)一級和準(zhǔn)二級動力學(xué)方程模型參數(shù)Table 3 Parameters for pseudo-first-order and pseudo-second-order kinetic models

表4 Elovich方程參數(shù)和內(nèi)部擴(kuò)散模型參數(shù)Table 4 Parameters for elovich equation and inter-diffusion models

2.5.3 顆粒內(nèi)擴(kuò)散方程 在顆粒內(nèi)擴(kuò)散方程中，當(dāng)qt與t0.5呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系時，顆粒內(nèi)擴(kuò)散為吸附過程的限速步驟，方程［17］表達(dá)如下:

式中:Kd為內(nèi)部擴(kuò)散速率常數(shù)，mg/(g?min0.5)，qt為t時刻(t/min)的吸附量，mg/g.

吸附劑從液相中吸附被吸附物時，可以分為吸附劑周圍流體界膜中吸附質(zhì)的遷移和在吸附劑顆粒內(nèi)的擴(kuò)散.從圖3中可以看出:qt與t0.5存在良好的線性關(guān)系(R2＞0.99)，說明顆粒內(nèi)擴(kuò)散為該吸附過程的限速步驟，吸附并不是僅僅發(fā)生在微球表面;隨著染料初始質(zhì)量濃度的增大，Kd值越大，表明甲基紅在微粒內(nèi)部的擴(kuò)散速率隨著染料初始質(zhì)量濃度的增加逐漸增大.

2.6 人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型

由圖4A可見，吸附試驗的實測值與構(gòu)建函數(shù)的預(yù)測值呈良好的線性關(guān)系(R2=0.996)，說明該人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型訓(xùn)練有效.輸入層的4個因素對輸出層-吸附量的影響程度結(jié)果(圖4B)表明，溫度對吸附過程的影響最大，相對重要性為32.76%，時間次之(25.56%)，其余依次為pH(23.36%)和染料初始質(zhì)量濃度(18.32%).

圖3 殼聚糖-生物炭微球吸附甲基紅的內(nèi)部擴(kuò)散模型Fig.3 Inter-diffusion model for the adsorption of methyl red onto the chitosan-biochar microsphere

2.7 微球菌劑的增益脫色試驗

圖4 吸附量實測值與預(yù)測值的回歸分析(A)和使用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行的敏感度分析(B)Fig.4 Regression analysis of measured and predicted adsorption capacity(A)and sensitivity analysis using artificial neural network(B)

圖5表明，與單純殼聚糖-生物炭材料制劑和純微生物菌劑相比，制得的殼聚糖-生物炭-微生物菌劑具有明顯的增益效應(yīng)，脫色效果大大提高.在較高質(zhì)量濃度的甲基紅液相中只添加微生物，20min后脫色率為8%，且隨著時間的延長，脫色率不再增加.其余2組處理20min后脫色率為15%，之后隨著時間的延長脫色率迅速攀升，80min后增幅減緩并趨于平穩(wěn).殼聚糖-生物炭-微生物菌劑與微生物單獨脫色作用相比，脫色率提高了67%;與無微生物的微球相比，脫色率提高了29%.將進(jìn)行脫色試驗后的殼聚糖-生物炭-微生物菌劑進(jìn)行破碎，用無菌水溶解，將溶解液稀釋1×108倍后涂布于LB培養(yǎng)基平板上計數(shù).結(jié)果發(fā)現(xiàn)仍有大量菌落長出，16S rDNA驗證表明，菌落為試驗時所加的高效降解菌株Bacillus sp.UN2，說明菌劑使用后仍具有一定的生命活性.雖然高質(zhì)量濃度甲基紅對微生物本身具有較強(qiáng)的毒害作用，但利用殼聚糖對微生物進(jìn)行包埋固定，可以提高微生物對污染物的耐受度，這也許是微球菌劑增益脫色的原因之一［18］.

圖5 微球-微生物菌劑、殼聚糖-生物炭微球和菌株UN2的脫色率比較Fig.5 decolorization rate comparisons of microsphere-microbial inoculum，chitosan-biochar microsphere and strain UN2

3 討論

物理吸附因為費(fèi)用廉價、操作易行，而被認(rèn)為是處理染料污染最為有效的途徑之一［19-21］.目前，可供選擇的吸附材料很多，但其效果卻大相徑庭.如Arslan［22］用乙烯對苯二酸酯纖維吸附剛果紅，最大吸附量僅為16.6 mg/g.生物炭因其空隙豐富、表面積大、吸附性強(qiáng)成為近年來的研究熱點.有學(xué)者用水稻、玉米等植物秸稈制成生物炭用來吸附孔雀石綠、甲基藍(lán)和甲基紫，結(jié)果證實均有不同程度的吸附效果，其中用水稻制得的生物炭對孔雀石綠的吸附率最高，為148.74 mg/g［23-25］.殼聚糖因其可降解、生物兼容性好的優(yōu)點已成為生物吸附材料的又一重要補(bǔ)充，研究發(fā)現(xiàn)殼聚糖對甲基紅的吸附率為150 mg/g［26］.本研究將殼聚糖與生物炭混合制備了新材料殼聚糖-生物炭微球制劑，在該制劑中生物炭不僅可自身吸附，同時起到了致孔劑的作用，提高了殼聚糖微球的孔隙率.以該制劑吸附甲基紅發(fā)現(xiàn)，其吸附效率大大增加，可達(dá)460 mg/g，比單純使用殼聚糖的吸附率提高3倍以上，與殼聚糖-納米管水凝膠微球吸附剛果紅的吸附效率相當(dāng)［27］.而相對納米管材料，生物炭的原材料來源更廣泛，價格低廉，更適合用于環(huán)境修復(fù)和污水處理.可見，新制得的微球制劑是一種新型有效的吸附制劑，具有巨大的應(yīng)用潛力.

利用殼聚糖-生物炭微球吸附溶液中的甲基紅，結(jié)果顯示當(dāng)pH值為3時，該微球?qū)谆t的吸附量達(dá)到最大值.在殼聚糖-生物炭微球制劑中，生物炭不僅能自身吸附，同時增加了微球表面孔隙數(shù)量，而殼聚糖的主要作用是提供表面官能團(tuán).由于殼聚糖具有獨特的分子結(jié)構(gòu)，在酸性條件下表面游離的氧基容易質(zhì)子化，從而對陰離子型的染料如偶氮類染料甲基紅具有較強(qiáng)的吸附性，所以在pH值呈酸性時有利于吸附的進(jìn)行.這也許是殼聚糖-生物炭微球制劑在pH值為3時吸附效果最好的原因之一［26］，但深入的作用機(jī)制目前尚無相關(guān)報道.

吸附結(jié)果表明，高的初始濃度和低溫有利于微球制劑對甲基紅的吸附.熱力學(xué)分析證實殼聚糖-生物炭微球制劑吸附甲基紅的過程為自發(fā)的放熱過程，在該過程中，溫度升高將增加系統(tǒng)的無序性，因而不利于吸附反應(yīng)的進(jìn)行.

物理吸附盡管廉價、高效，卻仍有局限，比如吸附作用只能將染料分子從液相向吸附劑轉(zhuǎn)移，不能將其徹底降解而使之無害化.由微生物發(fā)揮主導(dǎo)作用的生物降解解決了這一難題.通過體內(nèi)的新陳代謝，微生物可將這些染料分子分解、利用，最終使之變成無害的小分子釋放到環(huán)境中［3］.然而，在高濃度條件下，微生物因為無法抵抗染料的毒害作用而喪失生物降解的優(yōu)越性，如在本研究中，在初始質(zhì)量濃度為1000 mg/L條件下，添加甲基紅高效脫色菌株的脫色率在20min后僅為8%，且隨著時間延長脫色率不再增加.當(dāng)實驗利用無生物毒性、性能優(yōu)良的殼聚糖-生物炭微球為載體，將該菌株包埋其中制成菌劑時，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與純材料制劑和純菌制劑相比，脫色率大大提高，而且處理污水的甲基紅質(zhì)量濃度(1000 mg/L)也高于篩選菌株所用的甲基紅質(zhì)量濃度(400 mg/L).可見，微球?qū)ξ⑸锲鸬搅艘欢ǖ谋Ｗo(hù)作用，吸附劑與微生物相結(jié)合產(chǎn)生的吸附增益效應(yīng)為生物降解與物理吸附相結(jié)合去除染料的環(huán)境污染提供了初步的理論依據(jù).

4 結(jié)論

利用玉米秸稈制備的生物炭與殼聚糖結(jié)合制備微球，在染料初始質(zhì)量濃度為500 mg/L、pH 3.0和20℃條件下，微球?qū)谆t的最大吸附量為460 mg/g.吸附過程與Freundlich等溫方程和準(zhǔn)二級動力學(xué)方程擬合良好.吸附熱力學(xué)研究表明，該過程為放熱過程，低溫有利于吸附的發(fā)生.Elovich方程與顆粒內(nèi)部擴(kuò)散方程研究發(fā)現(xiàn):吸附作用為自發(fā)行為，內(nèi)部擴(kuò)散是吸附過程的限速步驟.隨著染料初始質(zhì)量濃度的增加，內(nèi)部擴(kuò)散速率增大，吸附性增強(qiáng).利用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)對影響吸附的4個因素進(jìn)行建模分析，結(jié)果顯示溫度對吸附過程的影響最大，相對重要性為32.76%，時間次之(25.56%)，其余依次為pH(23.36%)和染料初始質(zhì)量濃度(18.32%).在高質(zhì)量濃度的甲基紅溶液中，包埋微生物的殼聚糖-生物炭微球菌劑與無微生物的微球相比，脫色率提高了29%，與微生物單獨脫色作用相比，脫色率提高了67%.

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