石江濤

摘 要：以鴨腿為原料，選擇嗜酸乳桿菌（L. plantarum）和戊糖片球菌（P. pentosaces）為發(fā)酵菌種，以感官評分為評價指標，采用單因素結合響應面試驗方法優(yōu)化發(fā)酵鴨肉腸的加工工藝，并采用固相微萃取和氣質(zhì)聯(lián)用技術檢測發(fā)酵鴨肉腸中揮發(fā)性風味物質(zhì)的組成。結果表明：發(fā)酵鴨肉腸較佳的加工工藝條件為：發(fā)酵劑添加量106 CFU/g、發(fā)酵時間54 h、發(fā)酵溫度27 ℃，此工藝下制作的發(fā)酵鴨肉腸具有較好的感官品質(zhì)。從發(fā)酵鴨肉腸中檢測出37種揮發(fā)性成分，包括醛類、醇類、烴類、酸類、酯類以及含氮類化合物等。

關鍵詞：發(fā)酵鴨肉腸；加工工藝；響應面試驗；揮發(fā)性風味物質(zhì)；氣質(zhì)聯(lián)用

Abstract： The process optimization using combination of single factor method and response surface methodology （RSM） for the production of fermented duck sausage from duck leg meat using a 1：1 mixture of L. plantarum and P. pentosaces as starter culture was conducted in this study. The response was sensory evaluation score. Volatile compounds in fermented sausage were determined by solid-phase microextraction （SPME） and gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS）. Results indicated that the optimal processing parameters of fermented duck sausage were 106 CFU/g starter culture， 54 h of fermentation time， and 27 ℃ of fermentation temperature. Totally 37 volatile flavor compounds including aldehydes， alcohols， hydrocarbons， acids， esters and nitrogenous compounds were identified in fermented duck sausage.

Key words： fermented duck sausage； processing technology； response surface methodology （RSM）； volatile flavor； gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS）

中圖分類號：TS251.65 文獻標志碼：A 文章編號：1001-8123（2015）11-0019-05

doi： 10.15922/j.cnki.rlyj.2015.11.005

鴨肉具有高蛋白、低脂肪、低膽固醇，富含B族維生素和VE等特點[1-2]，深受消費者歡迎。發(fā)酵香腸是指將肉絞碎，添加發(fā)酵劑、輔料等，腌制灌腸，經(jīng)微生物的自然發(fā)酵或者人工發(fā)酵而制成的具有特殊風味的肉制品[3-5]。

發(fā)酵香腸加工生產(chǎn)及成熟的過程中脂肪水解，經(jīng)過酶和非酶氧化產(chǎn)生直鏈脂肪烴類、醛類、酮類和羧酸等，形成重要的風味物質(zhì)[6-7]。同時微生物酶的存在，蛋白質(zhì)被分解為氨基酸、核苷酸和寡肽等，這些小分子物質(zhì)在改善發(fā)酵香腸的滋味方面發(fā)揮著重要作用[8]。然而，發(fā)酵香腸風味物質(zhì)的來源比較復雜，發(fā)酵香腸的原輔料、發(fā)酵劑的類型和特性、加工條件這些共同決定著發(fā)酵香腸的風味[9-11]。揮發(fā)性風味物質(zhì)是影響香腸風味的重要因素，通過感官評價和色譜技術結合的方法可對風味物質(zhì)進行分析[12-13]。目前，關于傳統(tǒng)發(fā)酵香腸（豬肉、牛肉）的揮發(fā)性風味研究已有報道[14-19]，但對發(fā)酵鴨肉腸的揮發(fā)性風味物質(zhì)的研究較少。本實驗選擇嗜酸乳桿菌

（L. plantarum）和戊糖片球菌（P. pentosaces）為發(fā)酵菌種，對鴨肉腸的發(fā)酵工藝條件進行優(yōu)化，并利用固相微萃取技術和氣質(zhì)聯(lián)用的方法對發(fā)酵鴨肉腸的揮發(fā)性風味成分進行檢測和分析，旨在為鴨肉制品風味產(chǎn)品加工和開發(fā)提供更多的技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

櫻桃谷鴨腿購于合肥家樂福超市；食鹽、白糖、亞硝酸鹽（食品級）、腸衣均為市售；MRS肉湯培養(yǎng)基 北京奧博星生物技術有限責任公司。

1.1854型嗜酸乳桿菌（L.plantarum） 中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；F-1型戊糖片球菌（P.pentosaces） 丹麥科漢森公司。

1.2 儀器與設備

SCION TQ氣質(zhì)聯(lián)用儀 德國布魯克公司；CAR/PDMS固相微萃取針、固相微萃取手柄、螺口樣品瓶 美國Supelco公司；YX280A型高壓蒸汽滅菌鍋 上海三申醫(yī)療器械有限公司；ZWY-100H/240型恒溫搖床 上海

智城分析儀器制造有限公司；CT14RD高速冷凍離心機 上海天美科學儀器有限公司；MGB-120絞肉機 佛山市依家電器實業(yè)有限公司；HHS-S恒溫水浴鍋 江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠；JY60型電子天平 上海精密科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種的活化和發(fā)酵劑制備

將嗜酸乳桿菌和戊糖片球菌分別由干粉接種至MRS培養(yǎng)基中，37 ℃條件下培養(yǎng)24 h，活化2～3 次?；罨蟮木N作為原液按照4%的接種量在37 ℃的恒溫搖床中培養(yǎng)24 h，高速冷凍離心（5 000 r/min、10 min、4 ℃），無菌水稀釋得到所需的液體發(fā)酵劑，通過菌種計數(shù)按照一定的比例接種到肉中。

1.3.2 發(fā)酵鴨肉腸的制作工藝

工藝流程：原料肉預處理→切碎→拌料→腌制→接種→灌腸→培養(yǎng)發(fā)酵→終止發(fā)酵→蒸煮→成品

主要操作要點：1）原料肉預處理：選取鴨腿肉，剔除筋、腱、皮等，將鴨肉切細，并混入一定量的鴨肉脂肪。2）腌制接種：在原料肉中加入一定比例的腌制劑（3.0%食鹽、2.5%白糖、0.1%亞硝酸鈉），使其充分混勻，于4 ℃冰箱中冷藏腌制4 h。將嗜酸乳桿菌和戊糖片球菌（1∶1）接種到配制好的肉餡中，攪拌均勻后，灌入腸衣中。3）發(fā)酵：發(fā)酵溫度33 ℃、相對濕度86.3 %、發(fā)酵時間48 h。終止發(fā)酵宜采用低溫終止方法，即在15 ℃條件下24 h終止發(fā)酵。4）蒸煮：在沸水中煮制20～30 min，然后蒸制15～20 min，即可食用。

1.3.3 單因素試驗

1.3.3.1 發(fā)酵溫度對發(fā)酵鴨肉腸感官品質(zhì)的影響

發(fā)酵劑添加量106 CFU/g、發(fā)酵時間48 h，選取發(fā)酵溫度分別為25、30、35、40 ℃進行試驗，確定發(fā)酵溫度對發(fā)酵鴨肉腸感官品質(zhì)的影響。

1.3.3.2 發(fā)酵劑添加量對發(fā)酵鴨肉腸感官品質(zhì)的影響

發(fā)酵溫度選取上述最佳水平，發(fā)酵時間為48 h，選取的發(fā)酵劑添加量分別為105、106、107、108 CFU/g進行試驗，確定發(fā)酵劑添加量對發(fā)酵鴨肉腸感官品質(zhì)的影響。

1.3.3.3 發(fā)酵時間對發(fā)酵鴨肉腸感官品質(zhì)的影響

發(fā)酵溫度和發(fā)酵劑添加量分別選取上述最佳水平，選取的發(fā)酵時間分別為24、36、48、60、72 h進行試驗，確定發(fā)酵時間對發(fā)酵鴨肉腸感官品質(zhì)的影響。

1.3.4 響應面試驗優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗結果選取發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、發(fā)酵劑添加量三因素，以感官評分為指標，利用Design-Expert 8.0軟件設計三因素三水平共17 點的響應面試驗。

1.4 指標測定

1.4.1 感官評價

感官評價由10 名專家型人員組成，評定過程遵照“雙盲”原則，參照香腸標準GB/T 23493—2009《中式香腸》并稍作修改，分別對顏色、香味、口感、形態(tài)等指標進行評分[20]，感官評價指標及評分標準見表1。

1.4.2 揮發(fā)性風味化合物檢測與分析

將處理好的樣品每組稱取3.0 g于螺口樣品瓶中，并用聚四氟乙烯墊密封。用75 μm CAR/PDMS萃取頭插入樣品瓶中進行萃取，于50 ℃水浴中吸附40 min，然后將萃取頭插入氣質(zhì)聯(lián)用儀進樣口中于250 ℃解吸2 min，啟動儀器采集數(shù)據(jù)。每組平行檢測3 次。

1.4.2.1 檢測條件

色譜條件：DB-5MS毛細管色譜柱（60 m×0.32 mm，1 μm）；升溫程序：起始柱溫40 ℃，保持2 min，以5 ℃/min上升至60 ℃；再以10 ℃/min上升至100 ℃；再以18 ℃/min上升至240 ℃，保持6 min；載氣He氣；流速1 mL/min；不分流，恒壓35 kPa；進樣口溫度與接口溫度均為250 ℃，檢測溫度為240 ℃。

質(zhì)譜條件：離子源溫度200 ℃；電子轟擊（EI）離子源；電子能量70 eV；燈絲電流150 μA；質(zhì)量掃描范圍33～450 m/z。

1.4.2.2 化合物定性與定量分析

化合物通過計算機檢索與NIST Library數(shù)據(jù)庫相匹配，從而確定其化學成分。化合物相對百分含量用峰面積歸一化計算。

1.4.2.3 風味化合物的分析

采用相對氣味活度值（relative odor activity value，ROAV）[21]對發(fā)酵鴨肉腸的揮發(fā)性風味物質(zhì)進行分析。

1.5 數(shù)據(jù)分析

實驗結果采用Excel統(tǒng)計處理，SPSS 19.0統(tǒng)計分析軟件進行顯著性分析，Design-Expert 8.0軟件進行響應面工藝優(yōu)化。

2 結果與分析

2.1 發(fā)酵鴨肉腸加工工藝的單因素試驗結果

2.1.1 發(fā)酵溫度對發(fā)酵鴨肉腸品質(zhì)的影響

由圖1可知，發(fā)酵溫度對發(fā)酵香腸的品質(zhì)影響顯著（P<0.05）。溫度偏低，微生物產(chǎn)酸較慢，在相同發(fā)酵時間下，對香腸品質(zhì)有一定的影響；溫度過高時，微生物產(chǎn)酸迅速，pH值下降劇烈，致使香腸口感變差。因此30 ℃為較佳發(fā)酵溫度，香腸的感官品質(zhì)較好。

2.1.2 發(fā)酵劑添加量對發(fā)酵鴨肉腸品質(zhì)的影響

由圖2可知，發(fā)酵劑添加量對鴨肉腸品質(zhì)的影響顯著（P<0.05），當發(fā)酵劑添加量從105 CFU/g增加到106 CFU/g

過程中，鴨肉腸的固有風味更加濃郁，感官評分也相應升高。嗜酸乳桿菌產(chǎn)酸能力強，戊糖片球菌促進發(fā)色，有效抑制污染雜菌生長，兩者配合使用，能有效促進香腸風味形成。但發(fā)酵劑添加過多時，會使發(fā)酵香腸酸味過重，口感變差。因此較佳的發(fā)酵劑添加量為106 CFU/g。

2.1.3 發(fā)酵時間對發(fā)酵鴨肉腸品質(zhì)的影響

由圖3可知，發(fā)酵時間對發(fā)酵香腸的品質(zhì)影響顯著（P<0.05）。隨著發(fā)酵時間的延長，微生物利用糖類發(fā)酵產(chǎn)酸，同時有利于纖維蛋白變成凝膠狀態(tài)，改善肉品的質(zhì)構。當發(fā)酵時間為48 h時，感官評分最高，香腸的口感合適，味道濃郁。

2.2 發(fā)酵鴨肉腸的加工工藝優(yōu)化

由圖4a可知，響應面坡度較陡，表明響應值對發(fā)酵劑添加量和發(fā)酵溫度的交互作用較敏感，影響顯著，這與方差分析結果一致。隨著發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間和發(fā)酵劑添加量的增加，產(chǎn)品的感官評分先增加后減少。經(jīng)分析得出發(fā)酵鴨肉腸最佳發(fā)酵條件為：發(fā)酵劑添加量106 CFU/g、發(fā)酵時間54 h、發(fā)酵溫度27 ℃，此發(fā)酵條件下感官評分為（93±4） 分。將此發(fā)酵條件與單因素試驗的最佳發(fā)酵條件進行驗證實驗，結果顯示，單因素試驗感官評分為（90±2） 分。綜合分析，發(fā)酵鴨肉腸的最佳發(fā)酵條件為發(fā)酵劑添加量106 CFU/g、發(fā)酵時間54 h、發(fā)酵溫度27 ℃。

2.3 發(fā)酵鴨肉腸風味化合物的檢測

由表4可知，從對照組和發(fā)酵組中共檢測出46 種物質(zhì)，這其中包括醛類8 種、醇類11 種、烴類10 種、酯類7 種、酸類5 種、醚類2 種、酚類1 種、胺類1 種、呋喃類1 種。與生鴨肉相比，發(fā)酵鴨肉中烴類、醛類、醇類、含氮化合物類等揮發(fā)性風味化合物含量顯著增加，這可能與菌種產(chǎn)生的脂肪酶、蛋白酶等有關，它們能引起肉中脂肪、蛋白質(zhì)發(fā)生水解，導致游離氨基酸和脂肪酸增加[23]。糖類和氨基酸在后期加熱過程中，發(fā)生美拉德反應，脂質(zhì)進一步水解，脂質(zhì)水解與美拉德反應相互作用，對鴨肉的整體香味構成起重要作用[24-25]。

對已知氣味閾值的化合物作ROAV方法的分析[21]，結果表明，對發(fā)酵鴨肉腸風味起關鍵作用的物質(zhì)（ROAV≥1）為壬醛、辛醛、檸檬烯、己醛、庚醛、三甲胺、2-戊基呋喃這7 種化合物；對發(fā)酵鴨肉腸總體風味起修飾作用的物質(zhì)（0.1≤ROAV≤1）為苯甲醛、戊醛、α-甲基苯乙醇這3 種化合物。生鴨肉中主體風味物質(zhì)（ROAV≥1）分別是壬醛、辛醛、檸檬烯。醛類是脂肪降解的主要產(chǎn)物，可能與肉品的特征性風味有關，它們擁有較低的氣味閾值，對肉制品的香味產(chǎn)生很大影響[26-28]。本實驗中對發(fā)酵鴨肉腸風味起主要貢獻的物質(zhì)為直鏈醛類較多。直鏈醛類一般來自不飽和脂肪酸的氧化，中等相對分子質(zhì)量的醛具有清香、油香、脂香和牛脂香風味[29]，

這可能會與鴨肉的獨特香味形成有關。此外，通過與生鴨肉對比，發(fā)酵組中還檢測出含氮類化合物和呋喃類化合物，其濃度雖然不高，但它們的閾值非常低，具有重要的感官特性[30]，所以對肉品風味形成有一定的影響。結合發(fā)酵鴨肉腸檢測出的37 種揮發(fā)性成分來看，可認為醛類特別是直鏈醛，為影響發(fā)酵鴨肉腸揮發(fā)性風味的主要化合物。

3 結 論

采用單因素結合響應面試驗對發(fā)酵鴨肉腸加工工藝進行優(yōu)化，結果表明：當發(fā)酵劑添加量為106 CFU/g、發(fā)酵時間為54 h、發(fā)酵溫度為27 ℃時，發(fā)酵鴨肉腸具有較佳的感官品質(zhì)，鴨肉的味道濃郁，口感合適。對最佳工藝下發(fā)酵鴨肉腸進行揮發(fā)性風味物質(zhì)的測定，共檢測出醛類、醇類、烴類、酸類、酯類以及含氮類化合物等揮發(fā)性風味成分37 種。這些揮發(fā)性成分中，醛類物質(zhì)較多，對發(fā)酵鴨肉腸的總體風味貢獻較大，這主要來源于發(fā)酵劑菌種對鴨肉中碳水化合物、脂肪和蛋白質(zhì)等物質(zhì)的水解利用，以及后期加熱中氨基酸熱降解反應和美拉德反應等共同作用。

參考文獻：

[1] 王淑慧， 潘道東， 劉春利， 等. 發(fā)酵鴨肉香腸的加工技術研究[J]. 中國食品學報， 2013， 13（2）： 19-26.

[2] BAEZA E. Recent research results and duck meat on trends in domestic ducks[J]. China Poultry， 2007， 29（10）： 52-53.

[3] GARCIA M L， DOMINGUEZ R， GALVES M D， et al. Utilization of cereal and fruit fibres in low fat dry fermented sausages[J]. Meat Science， 2002， 60（3）： 227-236.

[4] 吳麗紅， 賀稚非. 乳酸菌在發(fā)酵香腸中的研究現(xiàn)狀[J]. 肉類研究， 2005， 19（6）： 45-47.

[5] 徐光域， 王衛(wèi). 發(fā)酵香腸加工中的發(fā)酵劑及其應用進展[J]. 食品科學， 2002， 23（8）： 306-310.

[6] MIELNIK M B， KJERSTI A， KNUT R， et al. Quality of comminuted sausages formulated from mechanically deboned poultry meat[J]. Meat Science， 2002， 61（1）： 73-84.

[7] 喬發(fā)東. 腌臘肉制品脂肪組織食用品質(zhì)的成因分析[J]. 農(nóng)產(chǎn)品加工： 學刊， 2006（11）： 7-10.

[8] BERDAGU? J L， MONTEIL P， MONTEL M C， et al. Effects of starter cultures on the formation of flavour compounds in dry sausage[J]. Meat Science， 1993， 35（3）： 275-287.

[9] 李平蘭， 沈清武， 孫成虎， 等. 微生物酶與肉組織酶對干發(fā)酵香腸中游離氨基酸的影響[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè)， 2005， 31（5）： 134-138.

[10] 張紅梅， 范貴生， 孫寶忠. 蛋白酶在發(fā)酵香腸成熟中的作用及機理[J]. 肉類研究， 2007， 21（4）： 22-23.

[11] 吳治海， 蒲彪. 發(fā)酵香腸風味物質(zhì)研究現(xiàn)狀[J]. 四川食品與發(fā)酵， 2006， 41（3）： 13-16.

[12] 歐全文， 王衛(wèi)， 張崟， 等. 肉類風味的研究進展[J]. 食品科技， 2012（12）： 107-111.

[13] 劉源， 周光宏， 徐幸蓮. 固相微萃取及其在食品分析中的應用[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè)， 2003， 29（7）： 83-87.

[14] GUILLEN M D， SALMERONY J， CASAS C. Volatile and less volatile components in Spanish smoked sausage studied by spme and GC/MS. Role of the casing in the smoking process[C]// 48th ICoMST. Rome， 2002： 812-813.

[15] STAHNKE L H. Volatiles produced by Staphylococcus xylosus and Staphylococcus carnosus during growth in sausage minces part II. The influence of growth parameters[J]. LWT-Food Science and Technology， 1999， 32（6）： 365-371.

[16] SIDIRA M， KANDYLIS P， KANELLAKI M， et al. Effect of immobilized Lactobacillus casei on volatile compounds of heat treated probiotic dry-fermented sausages[J]. Food Chemistry， 2015， 178： 201-207.

[17] 張春暉. 發(fā)酵香腸成熟前后揮發(fā)性成分的固相微萃取GC-MS分析[J]. 分析測試學報， 2005， 23（6）： 40-43.

[18] 牛爽. 發(fā)酵干香腸生產(chǎn)過程中揮發(fā)性風味成分變化的研究[D]. 北京： 中國農(nóng)業(yè)大學， 2004.

[19] 趙冰， 李素， 成曉瑜， 等. 廣式臘肉揮發(fā)性風味物質(zhì)分析[J]. 肉類研究， 2013， 27（10）： 12-16.

[20] 中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局， 中國國家標準化管理委員會. GB/T 23493—2009 中式香腸[S]. 北京： 中國標準出版社， 1986.

[21] 劉登勇， 周光宏， 徐幸蓮. 確定食品關鍵風味化合物的一種新方法： “ROAV”法[J]. 食品科學， 2008， 29（7）： 370-374.

[22] 孫寶國. 食用調(diào)香術[M]. 北京： 化學工業(yè)出版社， 2003： 23-32.

[23] 宋煥祿. 食品風味化學[M]. 北京： 化學工業(yè)出版社， 2007： 34-36.

[24] 高堯來， 朱晶瑩. 美拉德反應與肉的風味[J]. 廣州食品工業(yè)科技， 2004， 20（1）： 91-93.

[25] van BOEKEL M. Formation of flavour compounds in the Maillard reaction[J]. Biotechnology Advances， 2006， 24（2）： 230-233.

[26] VENTANAS J， C?RDOBA J J， ANTEQUERA T， et al. Hydrolysis and Maillard reactions during ripening of Iberian ham[J]. Journal of Food Science， 1992， 57（4）： 813-815.

[27] MOTTRAM D S. Flavour formation in meat and meat products： a review[J]. Food Chemistry， 1998， 62（4）： 415-424.

[28] ELMORE J S， MOTTRAM D S， ENSER M， et al. Effect of the polyunsaturated fatty acid composition of beef muscle on the profile of aroma volatiles[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 1999， 47（4）： 1619-1625.

[29] STAHNKE L H. Dried sausages fermented with Staphylococcus xylosus at different temperatures and with different ingredient levels： Part III. Sensory evaluation[J]. Meat Science， 1995， 41（2）： 211-223.

[30] DRUMM T D， SPANIER A M. Changes in the content of lipid autoxidation and sulphur-containing compounds in cooked beef during storage[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 1991， 39： 336-343.