韓芳　吳愛(ài)萍　孫仁華

[摘要] 目的 探討膿毒癥急性腎損傷的早期診斷指標(biāo)及生大黃對(duì)其的保護(hù)作用。 方法 將60只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組（A）、治療組（B）和對(duì)照組（C）三組，每組20只。模型組腹膜內(nèi)注射脂多糖5 mg/kg誘導(dǎo)建立AKI模型，治療組在腹膜內(nèi)注射脂多糖即刻胃管內(nèi)注入生大黃粉溶液，對(duì)照組腹膜內(nèi)注射等量生理鹽水。三組大鼠分別在處理前即刻（基礎(chǔ)值，0 h），處理后1、6、24 h測(cè)定尿Netrin-1及尿KIM-1含量，同時(shí)采集血樣測(cè)定肌酐含量。 結(jié)果 大鼠注射脂多糖6 h后，血清肌酐及尿KIM-1水平開(kāi)始明顯上升，注射后1 h尿Netrin-1即有明顯上升，6 h達(dá)到峰值，24 h左右逐漸下降；生大黃治療組大鼠各時(shí)間點(diǎn)血清肌酐、尿Netrin-1及尿KIM-1上升程度均較模型組明顯降低（P<0.05）。 結(jié)論 尿Netrin-1對(duì)膿毒癥急性腎損傷有早期診斷作用，生大黃可降低膿毒癥急性腎損傷大鼠Scr、尿Netrin-1及尿KIM-1水平，對(duì)腎臟有保護(hù)作用。

[關(guān)鍵詞] 急性腎損傷；膿毒癥；生大黃；Netrin-1

[中圖分類號(hào)] R692 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2015）16-0004-04

[Abstract] Objective To study early diagnostic index of septic acute kidney injury（AKI） and protective effect of rhubarb on septic AKI. Methods Sixty rats were randomly divided into the following 3 groups： model group （A）， treatment group （B） and control group （C）. Each group contains 20 rats. Rats from group A were received a intraperitoneal injection of lipopolysaccharide （LPS） at a dose of 5 mg/kg to induce AKI. Rats from group B were given rhubarb powder solution by oral administration immediately after LPS injection. Rats from group C were treated with the same volume of normal saline （NS） by intraperitoneal injection. Both serum level of creatinine （Scr） and urinary levels of Netrin-1 and KIM-1 of rats in 3 groups were detected in the different time points of treatment （0 h， 1 h， 6 h and 24 h）. Results The levels of KIM-1 and CR in rats treated with LPS were obviously increased at the time point of 6 h （P<0.05）. The urinary level of Netrin-1 began to increase at the time point of 1 h and reached the highest level at the time point of 6 h， then gradually decreased at the time point of 24 h after the injection of LPS. In group B， the levels of Scr， Netrin-1 and KIM-1 were significantly lower as compared with group A （P<0.05）. Conclusion The urinary level of Netrin-1 might has early diagnostic value in septic acute kidney injury. Rhubarb could protect the kidney of AKI model rats by decreasing the serum level of Scr， urinary levels of Netrin-1 and KIM-1.

[Key words] Acute kidney injury； Sepsis； Rhubarb； Netrin-1

膿毒癥（sepsis）是一種由感染誘發(fā)的全身炎癥反應(yīng)綜合征，可引起多器官損傷。在膿毒癥人群中急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）發(fā)生并不少見(jiàn)，發(fā)生率隨著膿毒癥的嚴(yán)重度上升而增加，在中等程度、重癥膿毒癥和膿毒癥休克患者中，AKI的發(fā)生率分別是19%、23%和51%，和其他原因相比，膿毒癥所致的AKI血流動(dòng)力學(xué)更不穩(wěn)定，需要升壓藥與機(jī)械通氣的患者比例較高，疾病嚴(yán)重度評(píng)分更高，最終導(dǎo)致死亡率也明顯升高[1]。膿毒癥AKI已成為醫(yī)務(wù)工作者面臨的重大醫(yī)療問(wèn)題。近年來(lái)，隨著對(duì)膿毒癥和AKI的發(fā)病機(jī)制認(rèn)識(shí)的深入，容量管理、內(nèi)環(huán)境監(jiān)控、器官支持的水平不斷提高，雖然在膿毒癥合并AKI治療方面有所進(jìn)展，但膿毒癥AKI的病死率仍然居高不下，因此早期診斷及早期治療是防治膿毒癥AKI的最佳策略。本文從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來(lái)探討生大黃對(duì)膿毒癥急性腎損傷的保護(hù)作用以探尋早期診斷急性腎損傷的可靠指標(biāo)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 健康動(dòng)物 60只健康、成年SD大鼠，雄性，體重（253±27）g，由浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，常規(guī)飼養(yǎng)3 d后用于實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 器材 Olympus AU5400全自動(dòng)生化分析儀，美國(guó)bio-rad model 680酶標(biāo)儀（美國(guó)bio-rad公司）。

1.1.3 試劑 大腸桿菌脂多糖（美國(guó)Sigma公司）；血清肌酐檢測(cè)（Scr）試劑（日本Olympus公司）；Netrin-1酶聯(lián)免疫吸附試劑盒及KIM-1酶聯(lián)免疫吸附試劑盒（均由上海卡努生物科技有限公司提供）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 將60只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組（A）、治療組（B）和對(duì)照組（C）三組，每組20只。模型組腹膜內(nèi)注射脂多糖5 mg/kg誘導(dǎo)建立AKI模型，治療組在腹膜內(nèi)注射脂多糖5 mg/kg即刻胃管內(nèi)注入生大黃粉溶液25 g/kg加溫開(kāi)水3 mL，對(duì)照組僅腹膜內(nèi)注射等量生理鹽水。

1.2.2 檢測(cè)方法 三組大鼠分別在處理前即刻（0 h），及處理后1、6、24 h收集尿液（通過(guò)膀胱按摩法），用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定尿軸突導(dǎo)向因子-1（Netrin-1）及尿腎損傷分子-1（kidney injury molecule-1，KIM-1）含量（操作按試劑說(shuō)明書進(jìn)行），上述四個(gè)時(shí)間點(diǎn)同時(shí)采集血樣用苦味酸法使用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血肌酐（Scr）含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，三組間差異及不同時(shí)點(diǎn)比較采用方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠血清肌酐（Scr）的變化

A組大鼠注射脂多糖6 h后，Scr才明顯上升（P<0.05），24 h更高，B組Scr上升時(shí)間與A組相仿，但升高程度較A組明顯下降（P<0.05），C組未見(jiàn)明顯變化見(jiàn)表1。

2.2大鼠尿Netrin-1的變化

A組大鼠尿Netrin-1水平在造模后1 h即有明顯上升（P<0.05），6 h達(dá)到最高值，24 h開(kāi)始逐漸下降，B組尿Netrin-1水平上升時(shí)間與A組相仿，但各點(diǎn)升高程度較A組明顯下降（P<0.05），C組未間明顯變化見(jiàn)表2。

2.3 大鼠尿KIM-1水平的變化

A組0 h、1 h KIM-1基礎(chǔ)水平表達(dá)量無(wú)明顯差異（P>0.05），6 h 開(kāi)始上升明顯（P<0.05），24 h時(shí)更高，此時(shí)上升水平近50倍，B組尿KIM-1水平上升時(shí)間與A組相仿，但各點(diǎn)升高程度較A組明顯下降（P<0.05），C組未間明顯變化見(jiàn)表3。

3 討論

危重病患者中膿毒癥發(fā)病率高，是引起多臟器功能障礙（MODS）和急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）的常見(jiàn)危險(xiǎn)因素[1]。膿毒癥極易并發(fā)急性腎損傷[2-9]，過(guò)去認(rèn)為膿毒癥AKI是由腎臟低灌注引起，但研究發(fā)現(xiàn)在腎臟血流正常甚至增加的情況下仍可能發(fā)生AKI，而炎性因子風(fēng)暴、細(xì)胞凋亡亦可能參與了膿毒癥AKI的發(fā)病過(guò)程。ICU中膿毒癥可引起大約35%～50%的AKI[2]，這些患者液體復(fù)蘇、營(yíng)養(yǎng)支持和抗感染等治療的難度明顯增加，其病死率高達(dá)30%～60%。其癥狀不典型可導(dǎo)致診斷及治療的延遲。膿毒癥AKI的治療包括控制原發(fā)感染、改善腎臟灌注、腎臟替代治療等，但這些對(duì)膿毒癥AKI晚期的患者療效并不明顯，如何早期識(shí)別、提高膿毒癥診斷的敏感性，合理實(shí)施治療策略，準(zhǔn)確評(píng)估預(yù)后是目前面臨的難題。所以發(fā)現(xiàn)敏感標(biāo)記物來(lái)早期診斷膿毒癥AKI，可以為治療提供新的時(shí)間窗，從而降低膿毒癥器官受累率，改善預(yù)后。因此對(duì)膿毒癥AKI早期診斷和治療的研究刻不容緩。

當(dāng)膿毒癥患者發(fā)生AKI 時(shí)，傳統(tǒng)診斷指標(biāo)主要依靠血肌酐的顯著性升高，但是血肌酐在AKI早期不夠敏感，其變化滯后于腎功能的減退，往往要在腎功能損失一半以上時(shí)才會(huì)出現(xiàn)明顯變化，當(dāng)患者血清肌酐升高及尿量明顯減少時(shí)，其有效的治療窗可能已經(jīng)錯(cuò)過(guò)。所以血肌酐水平對(duì)腎功能的急性改變和腎損傷判斷的敏感性和特異性均不佳，并不是一種理想的AKI標(biāo)志物，不能檢測(cè)出早期或潛在進(jìn)行的AKI，因此無(wú)法用于早期診斷。本文資料也顯示動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中造模后0、1 h血肌酐未能在早期就出現(xiàn)變化（P>0.05），6 h時(shí)才開(kāi)始明顯上升（P<0.05），提示血肌酐不能反映腎功能的早期損傷。

目前所研究的生物標(biāo)志物[10-14]主要有尿生物標(biāo)志物和血生物標(biāo)志物兩類，而尿生物標(biāo)志物不僅無(wú)創(chuàng)、方便并且和血標(biāo)志物一樣能夠預(yù)測(cè)急性腎損傷早期診斷和發(fā)展，前途遠(yuǎn)大[3]。軸突導(dǎo)向因子-1（Netrin-1）[4]是一種層粘連蛋白結(jié)構(gòu)相似的分泌蛋白，在神經(jīng)元的發(fā)育分化中占有重要地位，但近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)它在非神經(jīng)組織中如腎臟也有廣泛高表達(dá)[13-16]，Netrin-1在急性腎損傷時(shí)其表達(dá)水平有動(dòng)態(tài)變化[12]，因此已成為AKI生物標(biāo)志物研究的熱點(diǎn)之一[17]。有研究發(fā)現(xiàn)，AKI時(shí)Netrin-1短時(shí)間內(nèi)強(qiáng)烈表達(dá)并分泌于尿液中[5]。本文探討了脂多糖誘導(dǎo)建立AKI大鼠尿Netrin-1的排泄，模型組大鼠注射脂多糖后尿中Netrin-1的排泄在短時(shí)間內(nèi)即有明顯增加，1 h尿中Netrin-1水平即顯著上升，在6 h達(dá)到最高峰（相對(duì)于基礎(chǔ)值上升約17倍），然后緩慢下降，比Scr的增加早5 h。因此，上述結(jié)果提示相對(duì)Scr的變化時(shí)間而言，尿Netrin-1表達(dá)水平的檢測(cè)將更有助于AKI的早期診斷。

腎損傷分子-1（kidney injury molecule-1，KIM-1）[10]是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種跨膜蛋白，在正常腎組織中表達(dá)很少，但在腎組織損傷后表達(dá)明顯增高[15]，且與腎損傷的嚴(yán)重程度相關(guān)，尿中可檢測(cè)到其可溶性片段[6]。本文動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示所有大鼠注射脂多糖后尿內(nèi)0 h、1 h KIM-1基礎(chǔ)水平表達(dá)量均無(wú)明顯差異（P>0.05），6 h時(shí)才可見(jiàn)KIM-1水平上升明顯（P<0.05），24 h時(shí)達(dá)到峰值，此時(shí)模型組上升近50倍。其開(kāi)始上升時(shí)間較Scr并未有明顯提前。研究顯示尿中KIM-1水平與Scr相比未見(jiàn)太大優(yōu)勢(shì)，與Netrin-1相比上升的時(shí)間較后者晚，提示尿中Netrin-1水平可能可以更早期地診斷AKI。

中藥大黃具有瀉下攻積、清熱瀉火、解毒、活血祛淤的功效，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究已經(jīng)證明其具有退熱、抗感染、消炎作用，能排除腸道及體內(nèi)多種有害物質(zhì)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[7]證實(shí)，急性腎損傷早期采用生大黃治療能降低腎臟組織中TNF-α mRNA表達(dá)水平，減輕腎臟組織炎癥程度，促進(jìn)腎功能恢復(fù)。吳同辰等[8]的臨床實(shí)驗(yàn)表明生大黃具有促進(jìn)腸蠕動(dòng)恢復(fù)、緩解中毒性腸麻痹、促進(jìn)腸道細(xì)菌和內(nèi)毒素的排泄、減少腸道菌群及毒素移位、穩(wěn)定腸道微生態(tài)環(huán)境，從而盡快恢復(fù)腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)，保護(hù)胃腸道黏膜，改善患者營(yíng)養(yǎng)狀況；降低過(guò)度炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)免疫，提高危重患者免疫力；還能改善微循環(huán)從而減輕臟器損傷并逐步恢復(fù)臟器功能。本文研究發(fā)現(xiàn)生大黃治療組大鼠血肌酐、尿Netrin-1與尿KIM-1水平的升高程度均較模型組明顯下降（P<0.05），提示急性腎損傷早期采用生大黃治療，可以減輕腎臟損傷程度，防治急性腎功能衰竭，從而起到緩解病情、改善腎臟功能的作用。

本文實(shí)驗(yàn)研究表明，尿Netrin-1水平出現(xiàn)變化時(shí)間早，故可作為膿毒癥AKI的早期診斷指標(biāo)，與Scr及尿KIM-1相比可使AKI診斷明顯提前，有利于我們?cè)缙趯?duì)AKI進(jìn)行干預(yù)。但膿毒癥AKI的發(fā)病機(jī)制比較復(fù)雜，目前仍尚未完全明確，Netrin-1作為新的早期診斷AKI生物標(biāo)志物目前研究不多，其機(jī)制有待進(jìn)一步闡明，其臨床應(yīng)用效果也尚需進(jìn)一步研究證實(shí)。目前尚無(wú)多中心研究證據(jù)支持僅憑某項(xiàng)單一的生物標(biāo)志物可以進(jìn)行早期快速的診斷及準(zhǔn)確的預(yù)后判斷，所以需要多種標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)期待達(dá)到較好效果。本實(shí)驗(yàn)還提示生大黃有希望成為治療膿毒癥AKI的有效藥物。本研究?jī)H為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，雖已展現(xiàn)出令人振奮的前景，但亟待臨床大樣本的多中心隨機(jī)對(duì)照研究，以進(jìn)一步驗(yàn)證尿Netrin-1標(biāo)志物對(duì)早期診斷及生大黃用于治療膿毒癥AKI的價(jià)值。

[參考文獻(xiàn)]

[1] De Mendonca A，Vincent J L，Suter P M，et al. Acute renal failure in the ICU：Risk factors and outcome evaluation by SO-FA score[J]. Intensive Care Med，2000，26（7）：915-921.

[2] Uchino S，Kellum J A，Bellomo R，et al. Acute renal failure in critically ill patients：A multinational，Multicenter study[J]. JAMA，2005，29（7）：813-818.

[3] Dieterle F，Perentes E，Cordier A，et al. Urinary clusterin，cystatin C，beta2-microglobulin and total protein as markers to detect drug-induced kidney injury[J]. Nat Biotechnol，2010，28：463.

[4] Rajasekharan S，Kennedy TE. The netrin protein family[J]. Genome Biol，2009，10（9）：2391-2398.

[5] Ramesh G，Kwon O，Ahn K. Netrin-1：A novel universal biomarker of human kidney injury[J]. Transplant Proc，2010， 42（8）：1519-1522.

[6] Vh Timmeren MM，qkker S J，Vaidya V S，et al. Tubularkidney urymolecule-1 in protein-overload nephropathy[J].AmJ Physiol Renal Physiol，2006，291（2）：F456-F464.

[7] 樊恒，趙宇，宋甫春. 生大黃對(duì)重癥急性胰腺炎并發(fā)腎損傷大鼠的治療作用[J]. 中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合消化雜志，2012， 20（7）：308-310.

[8] 吳同辰，徐建如. 生大黃治療膿毒癥臨床研究[J]. 浙江中西醫(yī)結(jié)合雜志，2009，19（10）：621-622.

[9] Jorres A. Acute kidney injury in sepsis：Transient or intrinsic？ [J]. Crit Care，2013，17（6）：1014.

[10] Parikh CR，Thiessen-Philbrook H，Garg AX，et al. Performance of kidney injury molecule-1 and liver fatty acid-binding protein and combined biomarkers of AKI after cardiac surgery[J]. Clin J Am Soc Nephrol，2013，8（7）：1079-1088.

[11] Jiang C，Qi C，Sun K，et al. Diagnostic value of N-acetyl-beta-D-glucosaminidase for the early prediction of acute kidney injury after percutaneous nephrolithotripsy[J]. Exp Ther Med，2013，5（1）：197-200.

[12] Fang Han，Yuexing Tu，Hui Wang，et al. Urinary netrin-1 and KIM-1 as early biomarkers for septic acute kidney injury[J]. Ren Fail，2014，36（10）：1559-1563.

[13] Ramesh G. Role of netrin-1 beyond the brain：From biomarker of tissue injury to therapy for inflammatory diseases[J]. Recent Pat Biomark，2012，2（3）：202-208.

[14] Evdoxia Tsigou，Vasiliki Psallida，Christos Demponeras，et al. Role of New Biomarkers： Functional and structural damage[J]. Crit Care Res Pract，2013，36（10）：1078-1086.

[15] Venkata S Sabbisetti，Kazumi Ito，Chang Wang，et al. Novel assays for detection of urinary KIM-1 in mouse models of kidney injury[J]. Toxicol Sci，2013，131（1）：13-25.

[16] Ganesan Ramesh. Role of netrin-1 beyond the brain：From biomarker of tissue injury to therapy for inflammatory diseases[J]. Recent Pat Biomark，2012，2（3）：202-208.

[17] Punithavathi Vilapakkam Ranganathan，Calpurnia Jayakumar，Riyaz Mohamed，et al. Netrin-1 regulates the inflammatory response of neutrophils and macrophages，and suppresses ischemic acute kidney injury by inhibiting COX-2 mediated PGE2 production[J]. Kidney Int，2013， 83（6）：1087-1098.

（收稿日期：2015-01-21）