李曉舟

[摘 要] 目前，生防細菌中應(yīng)用較多的主要有：芽孢桿菌、假單胞桿菌、土壤放射桿菌等。其中，芽孢桿菌因其能夠產(chǎn)生耐熱、耐旱、抗紫外線和有機溶劑的內(nèi)生孢子，是研究較多的一類生防細菌，是理想的生防菌篩選對象。枯草芽孢桿菌因其抑菌譜廣且對多種植物病害具較好防效而得到廣泛關(guān)注和研究。本實驗主要是利用傳統(tǒng)方法對枯草芽孢桿菌B504的細胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)及生理生化特性進行鑒定。

[關(guān)鍵詞] 枯草芽孢桿菌 革蘭氏染色

[中圖分類號] S436 [文獻標識碼] A [文章編號] 1003-1650 （2015）10-0075-02

1 材料與方法

1.1 材料

枯草芽孢桿菌B504由遼寧省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所分離保存?？莶菅挎邨U菌標準菌株Bacillus subtilis 168，對照菌株大腸桿菌 E. coli Top10由遼寧省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所保存。

1.2 菌株形態(tài)觀察及生理生化鑒定方法

利用負染色，通過透射電鏡觀察菌體的形態(tài)、大小、鞭毛及其著生位置。以常規(guī)細菌學方法分析其形態(tài)和生理生化性狀。

1.2.1 形態(tài)學特征

①革蘭氏染色：接種針取適量菌苔，涂布于干凈玻片上一滴蒸餾水中，風干固定；用結(jié)晶紫混合液（結(jié)晶紫 2 g，草酸銨 0.8 g，95%乙醇20mL，蒸餾水80mL）染色1min，用水沖洗后碘液（碘 1 g，碘化鉀 2 g，蒸餾水300mL）作用1分鐘，經(jīng)過水洗、吸干； 95%乙醇或丙酮乙醇溶液脫色，流滴至無色；番紅液染色3分鐘，再次水洗、風干，鏡檢。

②鞭毛染色：接種環(huán)取已于斜面上培養(yǎng)18-24h的菌苔適量，置于干凈玻片蒸餾水中，傾斜玻片，使菌液緩慢流淌，均勻分布于玻片上，然后平放于空氣中自然干燥。涂片干燥后，先加甲液染色（丹寧酸 5g， FeCl31.5g ， 1.5%甲醛2mL，1%NaOH1mL， 蒸餾水 l00mL）10min，用蒸餾水沖洗，干燥。再加乙液（2%AgNO3）染色30～60s，加熱，使其稍冒蒸氣而染液不干，冷卻后用蒸餾水沖洗，干燥、鏡檢。

③芽孢染色：孔雀綠染色法，按革蘭氏染色涂片后，加孔雀綠染色液3-4滴，用木莢夾住載玻片，在火焰上加熱，使有蒸汽產(chǎn)生，但勿使沸騰，如此反復染色10min。在染色中，依據(jù)蒸發(fā)情況隨時添加染色液或水，使涂面上保持不干。用清水沖洗約半分鐘，至無多余染色液流下為止。用2%番紅染色3min，水洗，晾干。鏡檢。芽孢呈綠色，菌體和芽孢囊呈微紅色。

④莢膜染色：將結(jié)晶紫自研缽中研磨后，加入95%酒精，繼續(xù)研磨使之溶解，配成A液（結(jié)晶紫2.5g，95%酒精25mL）。將草酸銨溶解在蒸餾水中，配成B液（草酸銨1.0g，蒸餾水100mL） 。將A和B液混合既成。加2-3滴結(jié)晶紫染色液，放置3min，水洗，晾干。鏡檢，菌體周圍透明部分為莢膜。

⑤菌落形態(tài)：用劃線法將菌種接在平板培養(yǎng)基上，適溫培養(yǎng)66h，出現(xiàn)單菌落開始觀察，觀察內(nèi)容包括形狀和大小、邊緣、表面、隆起形狀、透明度、菌落和培養(yǎng)基的顏色等。

1.3 生理生化特征

①芽孢厭氧性測定：將菌種用接種環(huán)穿刺接種在RA培養(yǎng)基（酪素水解物20g，NaCl5g，巰基醋酸鈉2g，甲基次硫酸鈉1g，瓊脂15g，蒸餾水1000mL），30℃培養(yǎng)，3d和7d分別觀察，若表面生長者為好氧菌，沿線生長或下部生長者為兼性厭氧菌或厭氧菌。

②耐鹽性和需鹽性：將菌種接種在含3%、5%、7%、10%的肉汁胨液體培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)，培養(yǎng)3d、7d目測生長情況（培養(yǎng)基要十分澄清）。

③1.3.3檸檬酸鹽利用：將菌株接種在檸檬酸鹽斜面培養(yǎng)基（氯化鈉5g，水合硫酸鎂0.2g，磷酸氫銨1g，水合磷酸氫鉀1g，檸檬酸鈉2g，0.04%酚紅10mL，瓊脂12g，蒸餾水1000mL）上，28℃培養(yǎng)3-7d，培養(yǎng)基變?yōu)樘壹t色者為陽性，否則為陰性。

④丙酸鹽利用：將菌株接在丙酸鹽培養(yǎng)基（丙酸鈉2g，氯化鈉5g，水合硫酸鎂0.2g，磷酸氫銨 1g，水合磷酸氫鉀1g，0.04%酚紅10mL，瓊脂12g，蒸餾水1000mL）上，28℃培養(yǎng)3～7d，培養(yǎng)基變?yōu)樘壹t色者為陽性，否則為陰性。

⑤1.3.5氧化酶：置濾紙一張于干凈培養(yǎng)皿中，滴少許四甲基對苯二胺的1%水溶液至濾紙濕潤。用接種環(huán)取18～24h的菌苔，涂抹在濕潤的濾紙上，在10s內(nèi)涂抹的菌苔現(xiàn)藍色者為陽性，60s以上現(xiàn)藍色者不計，按陰性處理。

⑥接觸酶：將培養(yǎng)24h的斜面菌種，用接種環(huán)取少許，涂抹于滴有3%過氧化氫的玻片上，觀察有無氣泡產(chǎn)生：有，陽性；無，陰性。

⑦甲基紅（M.R）：在試管培養(yǎng)液（蛋白胨5g，葡萄糖5g，氯化鈉5g，蒸餾水1000mL，pH7.0）中接種菌種，置適溫培養(yǎng)48h。滴入甲基紅試劑（甲基紅0.1g，95%乙醇300mL，蒸餾水200mL）觀察：紅色，陽性；黃色，陰性。

⑧ V-P測定：接種菌種至試管培養(yǎng)液（蛋白胨5g，葡萄糖5g，氯化鈉5g，蒸餾水1000mL，pH7.0）中，培養(yǎng)24h。 取培養(yǎng)液和40%氫氧化鈉溶液等量混合。加入適量肌酸，靜置10min，觀察：培養(yǎng)液紅色，陽性（偶爾出現(xiàn)延長靜置時間，培養(yǎng)液才出現(xiàn)紅色）。

⑨淀粉水解：將菌種接種在淀粉瓊脂培養(yǎng)基（在肉汁胨中加0.2%可溶性淀粉）上培養(yǎng)2-5d，形成明顯菌落后，在其上滴加碘液（碘1 g， 碘化鉀2 g， 蒸餾水300mL），觀察菌落周圍有無透明圈：有，淀粉水解陽性；仍呈藍黑色，陰性。

⑩菌株對糖類物質(zhì)的利用：參照任新正（1994）的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 B504菌株的形態(tài)學特征

經(jīng)透射電鏡觀察，菌株B504菌體呈桿狀，細胞大?。?.93～1.4）μm×（3.3～3.9）μm，周生鞭毛（圖3-1-A）。革蘭氏染色呈陽性（圖3-1-B、C），芽孢非圓形，不膨大（圖3-1-D），無伴孢晶體，有莢膜（圖3-1-E）。LB平板培養(yǎng)基上菌落近似圓形，邊緣整齊，呈乳脂色，不透明，前期表面光滑（圖3-1-F），后期表面褶皺明顯（圖3-1-G）。

圖3-1 菌株B504的菌體形態(tài)和菌落形態(tài)

2.2 菌株B504生理生化特征

菌株B504的生理生化特征（表3-1）與標準菌株Bacillus subtilis 168對比，各項指標的陰性、陽性反應(yīng)結(jié)果相同，部分生理生化反應(yīng)特征圖（圖3-2）。

表3-1 菌株B504的生理生化特征

注：+ 為陽性反應(yīng)；- 為陰性反應(yīng)

圖3-2 菌株B504部分生理生化性狀

A：甲基紅；B：V-P測定；C：檸檬酸鹽利用；D：淀粉水解

結(jié)論

通過電鏡觀察，明確觀察到了其菌體形態(tài)、大小和鞭毛著生狀態(tài)及其在LB平板培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)。結(jié)合B504菌株的硝酸鹽還原、葡萄糖產(chǎn)酸等生理生化特征，將B504菌株初步鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。