李兵兵 溫志強

摘要 [目的]探討鏈霉菌Js-1T的發(fā)酵條件及防治效果。[方法]通過單因素試驗優(yōu)化鏈霉菌菌株Js-1T防治疣孢霉病的發(fā)酵培養(yǎng)基和條件，測定其發(fā)酵液對疣孢霉菌（Mycogone perniciosa）的田間防治效果。[結(jié)果] Js-1T菌株的最佳培養(yǎng)基配方為：甘露糖30.0 g，KNO3 20 g，MgSO4 1.5 g，K2HPO4 1.0 g，NaCl 0.1 g，水1 000 ml；最佳發(fā)酵條件為：30 ℃，pH=8，250 ml三角瓶裝液量為100 ml。發(fā)酵液對疣孢霉菌的田間防治效果顯著，對Ⅰ類、Ⅱ類、Ⅲ類3個類群疣孢霉菌引起的疣孢霉病的防治效果分別達68.77%、83.84%、85.62%。[結(jié)論]鏈霉菌Js-1T在疣孢霉病防治上具有很好的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞 鏈霉菌Js-1T；發(fā)酵優(yōu)化；疣孢霉菌；生物防治

中圖分類號 S436.46 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2015）27-094-03

Optimization on Fermentation Conditions of Streptomyces Js-1T and Inhibition of the Fermented Liquid against Mycogone perniciosa

LI Bing-bing1，2， WEN Zhi-qiang1*

（1. Fujian Agriculture and Forestry University，F(xiàn)uzhou， Fujian 350002； 2. Huaian Center for Disease Control and Prevention，Huaian， Jiangsu 223001）

Abstract [Objective] The aim was to study fermentation conditions and control effect of Streptomyces Js-1T. [Method] In order to increase the productivity of activities substance of strain Js-1T， the composition of fermenting solution and fermenting conditions were optimized by single factor. The inhibition of its fermented liquid against Mycogone perniciosa was also tested. [Result] The optimum fermenting solution were Mannose 30.0 g， KNO3 2.0 g， MgSO4 1.5 g， K2HPO4 1.0 g， NaCl 0.1 g， and water 1 000 ml； the optimal fermenting conditions were temperature 30 ℃， pH=8， and 100 ml liquid medium in 250 ml flake. The inhibition of its fermented liquid against Mycogone perniciosa Ⅰ， Ⅱ and Ⅲ were 68.77%， 83.84% and 85.62%， respectively. [Conclusion] Streptomyces strain Js-1T had certain application prospect in control of Mycogone perniciosa.

Key words Streptomyces strain Js-1T； Fermenting optimization； Mycogone perniciosa； Biological control

雙孢蘑菇疣孢霉病是由疣孢霉菌侵染引起的一種世界性病害[1-2]，近年來我國雙孢蘑菇疣孢霉病發(fā)生日趨嚴重，已成為制約我國雙孢蘑菇生產(chǎn)發(fā)展的重要因素之一[3]。目前，疣孢霉病主要使用化學(xué)藥劑來防治，但化學(xué)藥劑容易造成農(nóng)藥殘留和環(huán)境污染。目前利用生物防治控制疣孢霉病的研究較少，蔡少芬等[4]分離到一株對疣孢霉菌有抑制作用的枯草芽孢桿菌，王勇等[5]研究發(fā)現(xiàn)裂褶菌發(fā)酵液對疣孢霉菌絲生長的抑制率達48.96%。Js-1T菌株是從銀耳栽培料中分離得到的一株鏈霉菌，初步研究發(fā)現(xiàn)該菌株對疣孢霉菌具有很強的抑制作用。筆者對Js-1T菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基和條件進行了初步優(yōu)化，并測定了發(fā)酵液對疣孢霉菌的防治效果，以期為Js-1T菌株的進一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株。

鏈霉菌Js-1T菌株，從銀耳楊梅霜病發(fā)病菌筒分離獲得并保存于中國典型培養(yǎng)物保藏中心（保藏號：CCTCCM2011365）。

疣孢霉菌、雙孢蘑菇2796菌株均由福建農(nóng)林大學(xué)菌物研究中心提供。

1.1.2 培養(yǎng)基。

葡萄糖馬鈴薯培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯200.0 g，葡萄糖20.0 g，瓊脂20.0 g，水1 000 ml，pH自然。

Bennett培養(yǎng)基：葡萄糖10.0 g，酵母浸膏1.0 g，牛肉浸膏1.0 g，酶水解酪素2.0 g，水1 000 ml。

發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基：碳源25.0 g，氮源3.0 g，MgSO4 1.5 g，K2HPO4 1.0 g，NaCl 0.1 g，水1 000 ml，pH 7。

1.2 方法

1.2.1 菌株活化。將Js-1T菌株接種于液體Bennett培養(yǎng)基中，在轉(zhuǎn)速為160 r/min、溫度為30 ℃的恒溫搖床中培養(yǎng)4 d。吸取50 μl培養(yǎng)好的液體菌種涂布于PDA平板上，30 ℃培養(yǎng)7 d，供試驗用。

1.2.2 發(fā)酵液活性測定。以疣孢霉菌作為指示菌，采用生長速率法[5-6]測定發(fā)酵液的活性。用直徑為0.22 μm的一次性細菌過濾器過濾發(fā)酵液，取13 ml上述無菌發(fā)酵液添加到100 ml溫度為40 ℃左右的固體PDA中，充分混合均勻后倒平板。待培養(yǎng)基凝固后，接種直徑為1 cm的疣孢霉菌菌餅，每個處理5次重復(fù)。同時，以添加13 ml無菌水的培養(yǎng)基作為對照。25 ℃下培養(yǎng)，待空白對照接近長滿培養(yǎng)皿時，測量菌落半徑，并計算抑菌率。

抑制率=（對照組菌落直徑-處理組菌落直徑）/（對照組菌落直徑-原菌餅直徑）×100%[7]

1.2.3 種子培養(yǎng)液的制備。用無菌接種環(huán)挑取Js-1T菌株的孢子接到裝有100 ml發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基的250 ml三角瓶中，160 r/min、30 ℃培養(yǎng)4 d。

1.2.4 碳源篩選。在發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添加2%（W/V）的可溶性淀粉、蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、甘露醇、甘油作為唯一碳源，按6 ml/100 ml接種量接種種子發(fā)酵液，30 ℃培養(yǎng)14 d。按照“1.2.2”方法測定發(fā)酵液的抑菌活性。

1.2.5 氮源篩選。在發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添加0.3%（W/V）的蛋白胨、硫酸銨、硝酸鉀、酵母提取物作為唯一氮源，按6 ml/100 ml接種量接種種子發(fā)酵液，30 ℃培養(yǎng)14 d。按照“1.2.2”方法測定發(fā)酵液的抑菌活性。

1.2.6 碳源添加量試驗。將“1.2.4”篩選出的碳源按1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、4.0%、5.0%（W/V）添加量加入培養(yǎng)基，按6 ml/100 ml接種量接種種子發(fā)酵液，30 ℃培養(yǎng)14 d。篩選出最適碳源添加量。

1.2.7 氮源添加量試驗。將“1.2.5”篩選出的氮源按0.1%、0.2%、0.3%、0.5%、0.6%（W/V）添加量加入培養(yǎng)基，按6 ml/100 ml接種量接種種子發(fā)酵液，30 ℃培養(yǎng)14 d。篩選出最適氮源添加量。

1.2.8 溫度對發(fā)酵液活性的影響試驗。以篩選出的碳源、氮源按照最適添加量配制培養(yǎng)基，按100 ml/250 ml裝液量接種6 ml種子發(fā)酵液，分別測定20、25、28、30、35 ℃條件下發(fā)酵液的抑菌活性。

1.2.9 初始pH對發(fā)酵液活性的影響試驗。將最適培養(yǎng)基的pH分別調(diào)節(jié)至5、6、7、8、9，接種6 ml種子發(fā)酵液，30 ℃恒溫培養(yǎng)14 d。培養(yǎng)結(jié)束后將發(fā)酵液的pH調(diào)至中性，測定發(fā)酵液的活性。

1.2.10 裝液量對發(fā)酵液活性的影響試驗。分別將50、100、150、200 ml的培養(yǎng)基裝入250 ml三角瓶中。按選出的最佳接種量接入種子發(fā)酵液，30 ℃恒溫培養(yǎng)14 d。測定發(fā)酵液的活性。

1.2.11 發(fā)酵液對3個類群疣孢霉菌的田間防治試驗。

分別用3個類群疣孢霉菌的孢子懸液感染雙孢蘑菇覆土，然后用Js-1T菌株發(fā)酵液處理覆土，每個處理設(shè)置20 m2的出菇面積，10 d后按5點取樣法統(tǒng)計新長出雙孢蘑菇子實體的病菇和健菇的數(shù)目，計算發(fā)病率和防治效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳源篩選 由圖1可知，甘油作為碳源時，發(fā)酵液對疣孢霉抑制作用最低（2.01%）；甘露糖作為碳源時，發(fā)酵液抑菌活性最高（23.43%）；其余依次為麥芽糖、淀粉、蔗糖和葡萄糖。

2.2 氮源篩選 由圖2可見，在供篩選的4種氮源中，（NH4）2SO4、KNO3 2種無機氮源比有機氮源酵母提取物和蛋白胨抑菌效果好，氮源為KNO3時Js-1T菌株發(fā)酵液的抑菌活性最強，抑菌率為15.20%。

2.3 碳源添加量 碳源添加量對發(fā)酵液的抑菌活性有顯著影響（圖3），添加量在10～30 g/L時，隨著添加量的增加，發(fā)酵液抑菌活性逐漸增強，添加量為30 g/L時發(fā)酵液抑菌活性達到最高（17.64%）。繼續(xù)添加甘露糖，發(fā)酵液抑菌活性開始下降。

2.4 氮源添加量 根據(jù)“2.2”試驗結(jié)果選擇KNO3作為氮源，添加量為2.0 g/L時，發(fā)酵液對疣孢霉抑菌效果最佳，抑菌率為20.76%（圖4），之后隨添加量的增加，發(fā)酵液的抑菌活性開始降低。

2.5 溫度對Js-1T菌株發(fā)酵液抑菌活性的影響

由圖5可知，30 ℃為Js-1T菌株發(fā)酵產(chǎn)生活性物質(zhì)的最佳溫度，此時發(fā)酵液的抑菌活性為26.28%。

2.6 初始pH對Js-1T菌株發(fā)酵液抑菌活性的影響

初始pH對Js-1T菌株發(fā)酵液的抑菌活性有顯著影響。在酸性和強堿環(huán)境中發(fā)酵液的抑菌活性較低，初始pH為8時發(fā)酵液的抑菌活性最強，但當發(fā)酵液初始pH等于9時，發(fā)酵液對疣孢霉幾乎沒有抑制作用（圖6）。

圖6 初始pH對發(fā)酵液抑菌活性的影響

2.7 裝液量對Js-1T菌株發(fā)酵液抑菌活性的影響 在250 ml三角瓶中裝100 ml發(fā)酵液時，對疣孢霉菌的抑制活性最強，再增加裝液量，抑菌活性則降低（圖7），說明Js-1T菌株發(fā)酵時對氧氣需求較高。因此，Js-1T菌株發(fā)酵時的裝液量選擇100 ml/250 ml。

圖7 裝液量對發(fā)酵液抑菌活性的影響

2.8 發(fā)酵液對3個類群疣孢霉菌的田間防治效果

由表1可知，Js-1T菌株發(fā)酵液使雙孢蘑菇的疣孢霉病發(fā)病率明顯降低。其中，對疣孢霉Ⅰ類引起的栽培中雙孢蘑菇2796的防治效果相對較低，為68.77%，對Ⅱ類和Ⅲ類疣孢霉病的防治效果較高，分別達83.84%、85.62%。由此可見，Js-1T菌株發(fā)酵液在孢霉菌的防治方面具有很好的應(yīng)用價值。

3 結(jié)論與討論

通過單因素篩選初步確定了Js-1T菌株發(fā)酵的最佳培養(yǎng)基配方為：甘露糖30.0 g，KNO3 2.0 g，MgSO4 1.5 g，K2HPO4

1.0 g，NaCl 0.1 g，水1 000 ml；最佳發(fā)酵條件為：溫度30 ℃，

pH=8，250 ml三角瓶中裝100 ml發(fā)酵液。田間防治試驗結(jié)果表明，Js-1T菌株發(fā)酵液對Ⅰ類、Ⅱ類、Ⅲ類3個類群疣孢霉菌引起的栽培中雙孢蘑菇2796的疣孢霉病的防治效果顯著，防治效果分別達68.77%、83.84%、85.62%。發(fā)酵是一個十分復(fù)雜的過程，許多因素會影響到最終試驗結(jié)果[6-7]。該研究通過單因素試驗方法確定了Js-1T菌株的最佳發(fā)酵條件，提高了Js-1T菌株代謝產(chǎn)生拮抗物質(zhì)的能力，但是還需通過正交或響應(yīng)面法進一步優(yōu)化發(fā)酵條件。

自1943年Waksman首先發(fā)現(xiàn)鏈霉菌可以產(chǎn)生鏈霉素以來，放線菌已經(jīng)成為公認的新抗生素產(chǎn)生菌的主要來源[8]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的抗生素有80%以上是由放線菌產(chǎn)生的，其中又以鏈霉菌屬的菌株產(chǎn)生的最多[9]。農(nóng)用抗生素作為抗生素的一類，具有活性高、對使用環(huán)境的污染少、在環(huán)境中不易積累、來源廣、可再生等優(yōu)點[10]，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中有很好的應(yīng)用前景。Js-1T菌株是從銀耳發(fā)病菌筒中分離到的鏈霉菌，并且福建農(nóng)林大學(xué)菌物研究中心已經(jīng)利用多相分類鑒定該菌株為鏈霉菌屬的一個新種，因此，該菌株產(chǎn)生新的抑菌活性物質(zhì)的可能性較高。從Js-1T菌株發(fā)酵液中提取、鑒定有效活性物是下一步研究的重點。此外，利用鏈霉菌防治疣孢霉病的研究目前尚未見報道，該試驗結(jié)果對后續(xù)發(fā)酵中試放大、有效活性物質(zhì)的分離純化以及疣孢霉病的防治具有重要意義。

參考文獻

[1] UMAR M H，GEELS F P，VAN GRIENSVEN L J L D，et al.Pathology and pathogenesis of Mycogone perniciosa infection of Agaricus bisporus[C]//Proceedings of the 15th International Congress on the Science and Cultivation of Edible Fungi.Maastricht，2000：561-567.

[2] 黃清鏵，王慶福，劉新銳，等.雙孢蘑菇疣孢霉病研究進展[J].食用菌學(xué)報，2013，20（2）：69-74.

[3] 范建奇，張暉，張振偉，等.雙孢蘑菇疣孢霉病的綜合防治技術(shù)[J].北方園藝，2012（6）：168-170.

[4] 蔡少芬，溫志強，張婷，等.對一種可以抑制疣孢霉生長的細菌的鑒定[J].食用菌學(xué)報，2009，16（1）：92-94.

[5] 王勇，杜東兵，陳杭，等.幾種高等真菌菌絲及發(fā)酵產(chǎn)物對有害疣孢霉菌絲作用研究[J].食用菌，2009（1）：57-59.

[6] 隋麗，徐文靜，杜茜，等.放線菌769防治水稻稻瘟病的發(fā)酵條件研究[J].吉林農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，35（4）：36-40，55.

[7] 郭小芳，宗兆鋒.5株生防放線菌發(fā)酵條件初探[J].西藏大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2010，25（1）：112-116.

[8] 徐麗華，李文均，劉志恒，等.放線菌系統(tǒng)學(xué)[M].北京：科學(xué)出版社，2007：19-20.

[9] 阮繼生，劉志恒，楊德成.放線菌研究及應(yīng)用[M].北京：科學(xué)出版社，1990：479.

[10] 張寧波.農(nóng)用抗生素研究進展[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，45（6）：830-833.

責任編輯 劉月娟 責任校對 李巖