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        鏈霉菌Js—1T發(fā)酵條件及其對疣孢霉病的防治效果研究

        2015-05-30 15:15:31李兵兵溫志強
        安徽農(nóng)業(yè)科學(xué) 2015年27期
        關(guān)鍵詞:雙孢霉病氮源

        李兵兵 溫志強

        摘要 [目的]探討鏈霉菌Js-1T的發(fā)酵條件及防治效果。[方法]通過單因素試驗優(yōu)化鏈霉菌菌株Js-1T防治疣孢霉病的發(fā)酵培養(yǎng)基和條件,測定其發(fā)酵液對疣孢霉菌(Mycogone perniciosa)的田間防治效果。[結(jié)果] Js-1T菌株的最佳培養(yǎng)基配方為:甘露糖30.0 g,KNO3 20 g,MgSO4 1.5 g,K2HPO4 1.0 g,NaCl 0.1 g,水1 000 ml;最佳發(fā)酵條件為:30 ℃,pH=8,250 ml三角瓶裝液量為100 ml。發(fā)酵液對疣孢霉菌的田間防治效果顯著,對Ⅰ類、Ⅱ類、Ⅲ類3個類群疣孢霉菌引起的疣孢霉病的防治效果分別達68.77%、83.84%、85.62%。[結(jié)論]鏈霉菌Js-1T在疣孢霉病防治上具有很好的應(yīng)用前景。

        關(guān)鍵詞 鏈霉菌Js-1T;發(fā)酵優(yōu)化;疣孢霉菌;生物防治

        中圖分類號 S436.46 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611(2015)27-094-03

        Optimization on Fermentation Conditions of Streptomyces Js-1T and Inhibition of the Fermented Liquid against Mycogone perniciosa

        LI Bing-bing1,2, WEN Zhi-qiang1*

        (1. Fujian Agriculture and Forestry University,F(xiàn)uzhou, Fujian 350002; 2. Huaian Center for Disease Control and Prevention,Huaian, Jiangsu 223001)

        Abstract [Objective] The aim was to study fermentation conditions and control effect of Streptomyces Js-1T. [Method] In order to increase the productivity of activities substance of strain Js-1T, the composition of fermenting solution and fermenting conditions were optimized by single factor. The inhibition of its fermented liquid against Mycogone perniciosa was also tested. [Result] The optimum fermenting solution were Mannose 30.0 g, KNO3 2.0 g, MgSO4 1.5 g, K2HPO4 1.0 g, NaCl 0.1 g, and water 1 000 ml; the optimal fermenting conditions were temperature 30 ℃, pH=8, and 100 ml liquid medium in 250 ml flake. The inhibition of its fermented liquid against Mycogone perniciosa Ⅰ, Ⅱ and Ⅲ were 68.77%, 83.84% and 85.62%, respectively. [Conclusion] Streptomyces strain Js-1T had certain application prospect in control of Mycogone perniciosa.

        Key words Streptomyces strain Js-1T; Fermenting optimization; Mycogone perniciosa; Biological control

        雙孢蘑菇疣孢霉病是由疣孢霉菌侵染引起的一種世界性病害[1-2],近年來我國雙孢蘑菇疣孢霉病發(fā)生日趨嚴重,已成為制約我國雙孢蘑菇生產(chǎn)發(fā)展的重要因素之一[3]。目前,疣孢霉病主要使用化學(xué)藥劑來防治,但化學(xué)藥劑容易造成農(nóng)藥殘留和環(huán)境污染。目前利用生物防治控制疣孢霉病的研究較少,蔡少芬等[4]分離到一株對疣孢霉菌有抑制作用的枯草芽孢桿菌,王勇等[5]研究發(fā)現(xiàn)裂褶菌發(fā)酵液對疣孢霉菌絲生長的抑制率達48.96%。Js-1T菌株是從銀耳栽培料中分離得到的一株鏈霉菌,初步研究發(fā)現(xiàn)該菌株對疣孢霉菌具有很強的抑制作用。筆者對Js-1T菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基和條件進行了初步優(yōu)化,并測定了發(fā)酵液對疣孢霉菌的防治效果,以期為Js-1T菌株的進一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        1.1.1 菌株。

        鏈霉菌Js-1T菌株,從銀耳楊梅霜病發(fā)病菌筒分離獲得并保存于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(保藏號:CCTCCM2011365)。

        疣孢霉菌、雙孢蘑菇2796菌株均由福建農(nóng)林大學(xué)菌物研究中心提供。

        1.1.2 培養(yǎng)基。

        葡萄糖馬鈴薯培養(yǎng)基(PDA):馬鈴薯200.0 g,葡萄糖20.0 g,瓊脂20.0 g,水1 000 ml,pH自然。

        Bennett培養(yǎng)基:葡萄糖10.0 g,酵母浸膏1.0 g,牛肉浸膏1.0 g,酶水解酪素2.0 g,水1 000 ml。

        發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基:碳源25.0 g,氮源3.0 g,MgSO4 1.5 g,K2HPO4 1.0 g,NaCl 0.1 g,水1 000 ml,pH 7。

        1.2 方法

        1.2.1 菌株活化。將Js-1T菌株接種于液體Bennett培養(yǎng)基中,在轉(zhuǎn)速為160 r/min、溫度為30 ℃的恒溫搖床中培養(yǎng)4 d。吸取50 μl培養(yǎng)好的液體菌種涂布于PDA平板上,30 ℃培養(yǎng)7 d,供試驗用。

        1.2.2 發(fā)酵液活性測定。以疣孢霉菌作為指示菌,采用生長速率法[5-6]測定發(fā)酵液的活性。用直徑為0.22 μm的一次性細菌過濾器過濾發(fā)酵液,取13 ml上述無菌發(fā)酵液添加到100 ml溫度為40 ℃左右的固體PDA中,充分混合均勻后倒平板。待培養(yǎng)基凝固后,接種直徑為1 cm的疣孢霉菌菌餅,每個處理5次重復(fù)。同時,以添加13 ml無菌水的培養(yǎng)基作為對照。25 ℃下培養(yǎng),待空白對照接近長滿培養(yǎng)皿時,測量菌落半徑,并計算抑菌率。

        抑制率=(對照組菌落直徑-處理組菌落直徑)/(對照組菌落直徑-原菌餅直徑)×100%[7]

        1.2.3 種子培養(yǎng)液的制備。用無菌接種環(huán)挑取Js-1T菌株的孢子接到裝有100 ml發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基的250 ml三角瓶中,160 r/min、30 ℃培養(yǎng)4 d。

        1.2.4 碳源篩選。在發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添加2%(W/V)的可溶性淀粉、蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、甘露醇、甘油作為唯一碳源,按6 ml/100 ml接種量接種種子發(fā)酵液,30 ℃培養(yǎng)14 d。按照“1.2.2”方法測定發(fā)酵液的抑菌活性。

        1.2.5 氮源篩選。在發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添加0.3%(W/V)的蛋白胨、硫酸銨、硝酸鉀、酵母提取物作為唯一氮源,按6 ml/100 ml接種量接種種子發(fā)酵液,30 ℃培養(yǎng)14 d。按照“1.2.2”方法測定發(fā)酵液的抑菌活性。

        1.2.6 碳源添加量試驗。將“1.2.4”篩選出的碳源按1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、4.0%、5.0%(W/V)添加量加入培養(yǎng)基,按6 ml/100 ml接種量接種種子發(fā)酵液,30 ℃培養(yǎng)14 d。篩選出最適碳源添加量。

        1.2.7 氮源添加量試驗。將“1.2.5”篩選出的氮源按0.1%、0.2%、0.3%、0.5%、0.6%(W/V)添加量加入培養(yǎng)基,按6 ml/100 ml接種量接種種子發(fā)酵液,30 ℃培養(yǎng)14 d。篩選出最適氮源添加量。

        1.2.8 溫度對發(fā)酵液活性的影響試驗。以篩選出的碳源、氮源按照最適添加量配制培養(yǎng)基,按100 ml/250 ml裝液量接種6 ml種子發(fā)酵液,分別測定20、25、28、30、35 ℃條件下發(fā)酵液的抑菌活性。

        1.2.9 初始pH對發(fā)酵液活性的影響試驗。將最適培養(yǎng)基的pH分別調(diào)節(jié)至5、6、7、8、9,接種6 ml種子發(fā)酵液,30 ℃恒溫培養(yǎng)14 d。培養(yǎng)結(jié)束后將發(fā)酵液的pH調(diào)至中性,測定發(fā)酵液的活性。

        1.2.10 裝液量對發(fā)酵液活性的影響試驗。分別將50、100、150、200 ml的培養(yǎng)基裝入250 ml三角瓶中。按選出的最佳接種量接入種子發(fā)酵液,30 ℃恒溫培養(yǎng)14 d。測定發(fā)酵液的活性。

        1.2.11 發(fā)酵液對3個類群疣孢霉菌的田間防治試驗。

        分別用3個類群疣孢霉菌的孢子懸液感染雙孢蘑菇覆土,然后用Js-1T菌株發(fā)酵液處理覆土,每個處理設(shè)置20 m2的出菇面積,10 d后按5點取樣法統(tǒng)計新長出雙孢蘑菇子實體的病菇和健菇的數(shù)目,計算發(fā)病率和防治效果。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 碳源篩選 由圖1可知,甘油作為碳源時,發(fā)酵液對疣孢霉抑制作用最低(2.01%);甘露糖作為碳源時,發(fā)酵液抑菌活性最高(23.43%);其余依次為麥芽糖、淀粉、蔗糖和葡萄糖。

        2.2 氮源篩選 由圖2可見,在供篩選的4種氮源中,(NH4)2SO4、KNO3 2種無機氮源比有機氮源酵母提取物和蛋白胨抑菌效果好,氮源為KNO3時Js-1T菌株發(fā)酵液的抑菌活性最強,抑菌率為15.20%。

        2.3 碳源添加量 碳源添加量對發(fā)酵液的抑菌活性有顯著影響(圖3),添加量在10~30 g/L時,隨著添加量的增加,發(fā)酵液抑菌活性逐漸增強,添加量為30 g/L時發(fā)酵液抑菌活性達到最高(17.64%)。繼續(xù)添加甘露糖,發(fā)酵液抑菌活性開始下降。

        2.4 氮源添加量 根據(jù)“2.2”試驗結(jié)果選擇KNO3作為氮源,添加量為2.0 g/L時,發(fā)酵液對疣孢霉抑菌效果最佳,抑菌率為20.76%(圖4),之后隨添加量的增加,發(fā)酵液的抑菌活性開始降低。

        2.5 溫度對Js-1T菌株發(fā)酵液抑菌活性的影響

        由圖5可知,30 ℃為Js-1T菌株發(fā)酵產(chǎn)生活性物質(zhì)的最佳溫度,此時發(fā)酵液的抑菌活性為26.28%。

        2.6 初始pH對Js-1T菌株發(fā)酵液抑菌活性的影響

        初始pH對Js-1T菌株發(fā)酵液的抑菌活性有顯著影響。在酸性和強堿環(huán)境中發(fā)酵液的抑菌活性較低,初始pH為8時發(fā)酵液的抑菌活性最強,但當發(fā)酵液初始pH等于9時,發(fā)酵液對疣孢霉幾乎沒有抑制作用(圖6)。

        圖6 初始pH對發(fā)酵液抑菌活性的影響

        2.7 裝液量對Js-1T菌株發(fā)酵液抑菌活性的影響 在250 ml三角瓶中裝100 ml發(fā)酵液時,對疣孢霉菌的抑制活性最強,再增加裝液量,抑菌活性則降低(圖7),說明Js-1T菌株發(fā)酵時對氧氣需求較高。因此,Js-1T菌株發(fā)酵時的裝液量選擇100 ml/250 ml。

        圖7 裝液量對發(fā)酵液抑菌活性的影響

        2.8 發(fā)酵液對3個類群疣孢霉菌的田間防治效果

        由表1可知,Js-1T菌株發(fā)酵液使雙孢蘑菇的疣孢霉病發(fā)病率明顯降低。其中,對疣孢霉Ⅰ類引起的栽培中雙孢蘑菇2796的防治效果相對較低,為68.77%,對Ⅱ類和Ⅲ類疣孢霉病的防治效果較高,分別達83.84%、85.62%。由此可見,Js-1T菌株發(fā)酵液在孢霉菌的防治方面具有很好的應(yīng)用價值。

        3 結(jié)論與討論

        通過單因素篩選初步確定了Js-1T菌株發(fā)酵的最佳培養(yǎng)基配方為:甘露糖30.0 g,KNO3 2.0 g,MgSO4 1.5 g,K2HPO4

        1.0 g,NaCl 0.1 g,水1 000 ml;最佳發(fā)酵條件為:溫度30 ℃,

        pH=8,250 ml三角瓶中裝100 ml發(fā)酵液。田間防治試驗結(jié)果表明,Js-1T菌株發(fā)酵液對Ⅰ類、Ⅱ類、Ⅲ類3個類群疣孢霉菌引起的栽培中雙孢蘑菇2796的疣孢霉病的防治效果顯著,防治效果分別達68.77%、83.84%、85.62%。發(fā)酵是一個十分復(fù)雜的過程,許多因素會影響到最終試驗結(jié)果[6-7]。該研究通過單因素試驗方法確定了Js-1T菌株的最佳發(fā)酵條件,提高了Js-1T菌株代謝產(chǎn)生拮抗物質(zhì)的能力,但是還需通過正交或響應(yīng)面法進一步優(yōu)化發(fā)酵條件。

        自1943年Waksman首先發(fā)現(xiàn)鏈霉菌可以產(chǎn)生鏈霉素以來,放線菌已經(jīng)成為公認的新抗生素產(chǎn)生菌的主要來源[8]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的抗生素有80%以上是由放線菌產(chǎn)生的,其中又以鏈霉菌屬的菌株產(chǎn)生的最多[9]。農(nóng)用抗生素作為抗生素的一類,具有活性高、對使用環(huán)境的污染少、在環(huán)境中不易積累、來源廣、可再生等優(yōu)點[10],在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中有很好的應(yīng)用前景。Js-1T菌株是從銀耳發(fā)病菌筒中分離到的鏈霉菌,并且福建農(nóng)林大學(xué)菌物研究中心已經(jīng)利用多相分類鑒定該菌株為鏈霉菌屬的一個新種,因此,該菌株產(chǎn)生新的抑菌活性物質(zhì)的可能性較高。從Js-1T菌株發(fā)酵液中提取、鑒定有效活性物是下一步研究的重點。此外,利用鏈霉菌防治疣孢霉病的研究目前尚未見報道,該試驗結(jié)果對后續(xù)發(fā)酵中試放大、有效活性物質(zhì)的分離純化以及疣孢霉病的防治具有重要意義。

        參考文獻

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        責任編輯 劉月娟 責任校對 李巖

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