黃國(guó)文　管天球　趙雨云　陳莫林　劉宏輝

摘要 [目的]研究何首烏葉片原生質(zhì)體的制備和融合方法。[方法]用機(jī)械法制備何首烏葉片的原生質(zhì)體，用PEG結(jié)合高Ca2+高pH誘導(dǎo)融合法來誘導(dǎo)其原生質(zhì)體，研究原生質(zhì)體的融合現(xiàn)象。[結(jié)果]何首烏葉片在25 ℃和35%的蔗糖溶液中處理30 min能夠制備出較多的完整原生質(zhì)體。用20 %PEG融合液處理原生質(zhì)體20min能夠有效地誘導(dǎo)何首烏原生質(zhì)體的融合，2個(gè)細(xì)胞的融合效率為117%，表明用機(jī)械法制備的原生質(zhì)體也是有活性的。[結(jié)論]該技術(shù)為何首烏原生質(zhì)體培育奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 何首烏；原生質(zhì)體；制備；融合

中圖分類號(hào) S188 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2015）27-008-03

何首烏[Fallopia multiflora （Thunb.）Harald]為雙子葉蓼科多年生草本植物，分布在我國(guó)廣東、四川、湖南等省區(qū)，生長(zhǎng)于灌木叢中、山腳陰處或石隙中。莖纏繞，基部中空，多分枝，基部木質(zhì)化。葉心形，兩面光滑，有膜質(zhì)短筒狀的托葉鞘，圓錐狀花序。瘦果橢圓形，光滑，黑色[1]。塊莖供藥用，有滋補(bǔ)強(qiáng)壯作用，莖藤可治失眠癥[2]。野生何首烏的塊莖生長(zhǎng)緩慢，不能滿足人類對(duì)藥物的開發(fā)利用。植物原生質(zhì)體培育和融合是植物育種的重要技術(shù)之一。目前分離原生質(zhì)體的方法有機(jī)械法和酶法，常用的方法是酶法。筆者用機(jī)械法制備何首烏葉片的原生質(zhì)體，用PEG結(jié)合高Ca2+高pH誘導(dǎo)融合法來融合其原生質(zhì)體，以期為何首烏多倍體植株的培育奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料。何首烏新鮮成熟葉片。

1.1.2 主要儀器。血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，光學(xué)顯微鏡，離心機(jī)，數(shù)碼相機(jī)。

1.2 方法

1.2.1 原生質(zhì)體制備。用機(jī)械法制備原生質(zhì)體，具體操作步驟見文獻(xiàn)[3]。何首烏葉片經(jīng)過質(zhì)壁分離一定時(shí)間后切成0.5 cm寬的長(zhǎng)條，轉(zhuǎn)入到25%蔗糖溶液中放置8 min，過濾后得到原生質(zhì)體溶液。原生質(zhì)體經(jīng)過27%蔗糖溶液洗滌一次，再用13%甘露醇CPW溶液懸浮。懸浮液原生質(zhì)體可用牛氏記數(shù)板記數(shù)和細(xì)胞融合。原生質(zhì)體得率=記數(shù)室大方格原生質(zhì)體的平均個(gè)數(shù)×104個(gè)（FW）。

1.2.2 滲透劑的選擇。

以0.9 mol/L NaCl、6%KNO3和35%蔗糖溶液作為高滲溶液，在35 ℃水浴鍋中處理何首烏葉片30 min后，制備原生質(zhì)體，計(jì)算原生質(zhì)體的得率，確定制備原生質(zhì)體的滲透劑類型。

1.2.3 影響原生質(zhì)體得率的測(cè)定方法。

設(shè)定原生質(zhì)體質(zhì)壁分離的蔗糖濃度為25%、30%、35%、40%、45%，處理溫度為4、15、25、35、45 ℃，處理時(shí)間為10、30、50、70、90 min。將何首烏葉片放置在特定蔗糖濃度和特定溫度的條件下處理一定時(shí)間，葉片經(jīng)過切條后獲得原生質(zhì)體，測(cè)定原生質(zhì)體的得率。

1.2.4 PEG結(jié)合高Ca2+高pH誘導(dǎo)法融合原生質(zhì)體的方法。經(jīng)過質(zhì)壁分離法獲得的原生質(zhì)體溶液，1 500 r/min下離心8 min，沉淀用少量13%甘露醇CPW溶液懸浮，為原生質(zhì)體溶液。用吸管取原生質(zhì)體懸浮液滴兩滴在載玻片上，靜置幾分鐘，使原生質(zhì)體在載玻片上產(chǎn)生一薄層。取特定濃度PEG融合液兩滴，緩慢滴加到載玻片上的原生質(zhì)體溶液中，再靜置一定時(shí)間，觀察載玻片原生質(zhì)體間的粘連。每隔5 min，用吸管向原生質(zhì)體液中滴兩滴高Ca2+高pH溶液，共3次。蓋上蓋玻片，用吸水紙吸去多余的溶液即成臨時(shí)裝片。用顯微鏡觀察細(xì)胞融合，統(tǒng)計(jì)融合百分?jǐn)?shù)。用數(shù)碼照相機(jī)在顯微鏡下拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 滲透劑對(duì)原生質(zhì)體得率的影響

用0.9 mol/L NaCl、6%KNO3和35%蔗糖溶液作為何首烏葉片質(zhì)壁分離的高滲溶液，在25 ℃下制備的原生質(zhì)體數(shù)量分別為0.9×105、3.8×105和5.8×102個(gè)/g（FW）；且KNO3溶液會(huì)引起葉片流出物大量成塊，可能是原生質(zhì)體數(shù)量減少的原因。NaCl溶液處理的葉片制備的原生質(zhì)體溶液雖然雜物少，但相對(duì)蔗糖溶液而言細(xì)胞也較少。因此，以35%蔗糖溶液作為高滲溶液處理何首烏葉片制備的原生質(zhì)體數(shù)量較多，可用于制備原生質(zhì)體的條件優(yōu)化。

2.2 蔗糖濃度對(duì)原生質(zhì)體得率的影響

在25 ℃水浴鍋中用濃度分別為25%、30%、35%、40%、45%蔗糖溶液處理何首烏成熟葉片30 min后，制備原生質(zhì)體。測(cè)定原生質(zhì)體得率分別為100、2.3×104、3.5×105、2.2×105、0.5×104?？梢姡|(zhì)體數(shù)目隨著蔗糖濃度的增加先升高后降低。25%蔗糖溶液處理制備的原生質(zhì)體得率最少，為何首烏葉片細(xì)胞的低滲溶液。35%蔗糖溶液處理制備的原生質(zhì)體得率最多。當(dāng)蔗糖濃度高于35%時(shí)，得到的原生質(zhì)體數(shù)量逐漸減少，可能是細(xì)胞失水過快過多導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)壁分離復(fù)原活性降低的原因。

2.3 溫度對(duì)原生質(zhì)體得率的影響

在5份35%蔗糖溶液燒杯中加入等量何首烏成熟葉片，分別放在4、15、25、35、45 ℃的水浴鍋中處理30 min后，制備原生質(zhì)體。測(cè)定原生質(zhì)體得率分別為70、0.4×103、5.7×105、2.3×105、1.3×103。可見，質(zhì)壁分離溫度影響原生質(zhì)體得率，在25 ℃時(shí)處理的材料得到的原生質(zhì)體數(shù)量最多，溫度過高或者過低得到的原生質(zhì)體數(shù)量減少。說明溫度影響細(xì)胞內(nèi)滲透壓的變化。溫度過低，細(xì)胞活性低，導(dǎo)致細(xì)胞失水少，質(zhì)壁分離的細(xì)胞數(shù)目少，因此制備的原生質(zhì)體數(shù)目少；溫度過高，細(xì)胞內(nèi)的活性過高，導(dǎo)致細(xì)胞失水過快過多，質(zhì)壁分離的細(xì)胞數(shù)目多，但細(xì)胞復(fù)原活性降低，甚至引起細(xì)胞活性喪失，因此制備的原生質(zhì)體數(shù)量少。

2.4 質(zhì)壁分離時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體得率的影響

用35%蔗糖溶液在25 ℃下處理何首烏葉片10、30、50、70、90 min后，制備原生質(zhì)體。測(cè)定的原生質(zhì)體的得率分別為2.7×102、3.2×105、3.4×105、4.1×105、3×104。表明蔗糖處理時(shí)間影響原生質(zhì)體得率。蔗糖處理時(shí)間過短或者過長(zhǎng)，原生質(zhì)體的得率減少。因此質(zhì)壁分離時(shí)間決定原生質(zhì)體質(zhì)壁分離復(fù)原的活性，從而影響原生質(zhì)體的產(chǎn)率。在35%蔗糖溶液處理70 min時(shí)原生質(zhì)體得率最多（圖1A）?？紤]到原生質(zhì)體脫水時(shí)的生理活性變化，為了更好地保持原生質(zhì)體的活力，選擇以35%蔗糖溶液在25 ℃下處理30 min時(shí)制備的原生質(zhì)體，經(jīng)過離心用13%甘露醇CPW溶液懸浮后用于融合研究。

2.5 融合液PEG濃度和處理時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體融合的影響

以PEG結(jié)合高Ca2+高pH方法融合原生質(zhì)體，變化PEG融合液中PEG溶度，分別為10%、20%、30%、40%，分別處理35%蔗糖溶液制備的原生質(zhì)體15、20、25、30 min，觀察各種條件下原生質(zhì)體的融合效果（表1）。在20%PEG溶液條件下，融合20 min后，原生質(zhì)體的融合效率最高，為117%。PEG之所以能介導(dǎo)原生質(zhì)體融合，是因?yàn)樵诟邼舛鹊腜EG溶液中，PEG與水之間的氫鍵結(jié)合，使溶液中自由水消失，導(dǎo)致原生質(zhì)體發(fā)生膜結(jié)構(gòu)變化，促使其發(fā)生融合[4]。當(dāng)PEG濃度大于20%時(shí)，PEG濃度越高和處理時(shí)間越長(zhǎng)，融合率越低。PEG濃度過高和時(shí)間過長(zhǎng)，可能使原生質(zhì)體反應(yīng)液環(huán)境黏滯度過高，阻礙高鈣-高PH溶液的洗滌作用，導(dǎo)致細(xì)胞融合減少。另外，PEG濃度過高，可能會(huì)使細(xì)胞體積減小，導(dǎo)致各細(xì)胞之間膜的接觸面減少，細(xì)胞融合效率降低。

20%PEG融合液融合原生質(zhì)體20 min，在顯微鏡（400×）下觀察到原生質(zhì)體粘連在一起（圖1B）。經(jīng)過3次高Ca2+高pH 溶液洗滌后，在顯微鏡下觀察到2個(gè)原生質(zhì)體融合現(xiàn)象（圖1C），融合率為11.7%，沒有觀察到3個(gè)細(xì)胞的融合現(xiàn)象。但在各種條件下用高Ca2+高pH溶液洗滌聚集的原生質(zhì)體時(shí)都發(fā)現(xiàn)大部分原生質(zhì)體被成塊地沖向一邊，只有少量的原生質(zhì)體在原位，這可能是原生質(zhì)體融合效率不高的原因。

3 討論

植物原生質(zhì)體的制備有機(jī)械法和酶法[5]。由于酶解法操作簡(jiǎn)單方便，獲得的細(xì)胞數(shù)量多，大多數(shù)研究采用酶解法，但酶解法中使用的各種酶可能對(duì)分離的原生質(zhì)體及其成分有作用會(huì)引起不良后果[6]。機(jī)械法是將葉片放入高滲溶液中進(jìn)行質(zhì)壁分離一段時(shí)間，然后采用切條或者研磨的方法將葉片破裂，然后將碎塊放入低滲溶液中使細(xì)胞分離出來的方法。用此種方法制備原生質(zhì)體所用的時(shí)間短，成本低，沒有受到酶等化學(xué)試劑的影響，能夠保持細(xì)胞的原有狀態(tài)，是一種值得研究的方法。但目前認(rèn)為機(jī)械法制備原生質(zhì)體數(shù)量少，不能用于細(xì)胞下游試驗(yàn)。該研究根據(jù)細(xì)胞質(zhì)壁分離和復(fù)原的原理[7-8]，以蔗糖溶液作為葉片細(xì)胞質(zhì)壁分離的滲透劑，對(duì)蔗糖濃度、質(zhì)壁分離時(shí)間和溫度進(jìn)行了多個(gè)水平試驗(yàn)，用切條辦法破碎細(xì)胞，用能夠保持原生質(zhì)體活性的溶液13%甘露醇CPW溶液作為質(zhì)壁分離復(fù)原的試劑，分離到數(shù)量較多的原生質(zhì)體。該試驗(yàn)結(jié)果表明，在25 ℃條件下將何首烏葉片浸入35%蔗糖溶液處理30 min能夠分離3.2×105個(gè)/g（FW）。這些原生質(zhì)體經(jīng)過20%PEG融合液作用20 min，用高Ca2+高pH溶液洗滌誘導(dǎo)融合，能夠得到11.7%的2個(gè)原生質(zhì)體融合的細(xì)胞融合體，說明用此種方法制備的原生質(zhì)體也是有活性的；同時(shí)說明融合效率不高，有待于進(jìn)一步研究。該研究結(jié)果為何首烏植株的細(xì)胞育種研究奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

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