劉思月等

摘 要： 研究辣椒花藥中sRNA分布，篩選育性相關(guān)miRNA，通過miRNA及其靶基因的表達(dá)分析探討miRNA對(duì)雄性育性的調(diào)控。利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)辣椒細(xì)胞核雄性不育兩用系處于小孢子單核靠邊期的花藥進(jìn)行sRNA測(cè)序，同時(shí)分析兩材料間miRNA的表達(dá)差異。通過qRT-PCR技術(shù)驗(yàn)證差異分析結(jié)果，并對(duì)miRNA及其靶基因在小孢子發(fā)育不同時(shí)期的表達(dá)模式進(jìn)行分析。在構(gòu)建的不育株和可育株兩個(gè)文庫(kù)中共發(fā)掘出857個(gè)可信度高的miRNA；篩選得到42個(gè)表達(dá)差異顯著的miRNA；通過靶基因預(yù)測(cè)與注釋，預(yù)測(cè)出的差異表達(dá)miRNA的靶基因中與繁殖有關(guān)的基因有152 個(gè)，與生殖過程有關(guān)的基因有151個(gè)。通過qRT-PCR驗(yàn)證了選出的9條miRNA的存在，其表達(dá)差異與測(cè)序分析結(jié)果基本一致；單核靠邊期多數(shù)miRNA負(fù)調(diào)控其靶基因，不同發(fā)育時(shí)期其調(diào)控模式會(huì)發(fā)生變化。本研究為揭示辣椒miRNA與雄性育性的關(guān)系提供了重要信息。

關(guān)鍵詞： 辣椒； 細(xì)胞核雄性不育； miRNA； 高通量測(cè)序； qRT-PCR

Identification and expression analysis of fertility-related miRNAs for the genic male sterile line in pepper （Capsicum annuum L.）

LIU Siyue， LIU Chen， GUO Jinju， DA Fengjiao， SHEN Huolin

（Beijing Key Laboratory of Growth and Developmental Regulation for Protected Vegetable Crops·College of Agriculture and Biotechnology，China Agricultural University，Beijing 100193，China）

Abstract： The objective of this study is to investigate the distribution of sRNAs from anthers of pepper，and to screen miRNAs related to genic male sterility. By expression analysis of miRNAs and their target genes，we discussed the regulation mechanisam of male sterility by miRNAs. Using high-throughput sequencing technology，sRNA populations from anthers in late-uninucleate stage for GMS line in pepper were sequenced. qRT-PCR were performed to validate the results of sRNA sequencing and to analyze the expression profile in different developmental stages of microspore. Of the millions of high-quality sRNAs from 2 libraries，857 miRNAs of high credibility were identified，42 significant differently expressed miRNAs were screened. Prediction and annotation of target genes indicated that there are 152 targets involved in reproduction and 151 involved in reproductive process. qRT-PCR results confirmed the existence of the 9 selected miRNAs，and the expression files of most of the miRNAs is consistent with sequencing results. In late-uninucleate stage，most of miRNAs negatively regulate their targets，but the regulation file differs in different development phase. This study provides important information for uncovering the relation between miRNAs and male fertility in pepper.

Key words： Pepper； Genic male sterility； miRNA； High-throughput sequencing； qRT-PCR

辣椒是世界各地普遍栽培的蔬菜和調(diào)味品。目前，人工授粉是生產(chǎn)辣椒雜交種的主要方式，但這種方式成本高并且種子純度難以保證，而利用雄性不育系則可以克服這些缺點(diǎn)。本研究通過初步分析細(xì)胞核雄性不育辣椒兩用系miRNA和其靶基因的表達(dá)模式，為辣椒miRNA與育性關(guān)系的研究提供參考。辣椒細(xì)胞核雄性不育類型（genetic male sterile，GMS）因敗育徹底，恢復(fù)源廣，在雜交制種過程中發(fā)揮重要作用。迄今為止，世界各國(guó)學(xué)者已發(fā)現(xiàn)的辣椒細(xì)胞核雄性不育基因近20個(gè)，其中由國(guó)內(nèi)學(xué)者發(fā)現(xiàn)的不育基因有2個(gè)[1]?？寺》治龅玫降挠韵嚓P(guān)基因有CaMF2、CaPME1等[2-3]。

sRNA（small RNA）是調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育、抵御逆境的多種小分子RNA的總稱，miRNA（microRNA）是sRNA的一種，是廣泛存在于生物體內(nèi)的一類長(zhǎng)度為20～24 nt的內(nèi)源非編碼小RNA分子，它們能通過沉默靶基因或者抑制翻譯來調(diào)控基因的表達(dá)。Lee等[4]1993年在秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了第一個(gè)miRNA lin-4，它參與線蟲發(fā)育進(jìn)程的調(diào)控。最早發(fā)現(xiàn)的植物miRNA是2002年由Reinhart等[5]從擬南芥（Arabidopsis thaliana）sRNA文庫(kù)中獲得。植物中許多物種都發(fā)現(xiàn)了大量的miRNA，并且大多數(shù)植物miRNA在物種間是高度保守的。據(jù)估計(jì)，編碼miRNA的基因可能占基因總數(shù)的1%～5%[6]。miRNA主要通過與靶基因的特異性堿基互補(bǔ)配對(duì)，從而降解靶基因或抑制其翻譯，在轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)動(dòng)植物的基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控[7-9]。

目前有關(guān)miRNA的研究主要包括調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育、逆境生理以及響應(yīng)激素信號(hào)等方面[10-15]，其中對(duì)miRNA與花粉發(fā)育關(guān)系的研究主要集中在模式植物擬南芥中[16-17]，而對(duì)于miRNA與育性的關(guān)系研究目前還較少。Schwab等[18]研究發(fā)現(xiàn)，過量表達(dá)miR156會(huì)導(dǎo)致植株在短日照條件下開花延遲和育性降低，其作用機(jī)制可能是通過靶向作用于轉(zhuǎn)錄因子SPL；Mallory等[19]在含有5個(gè)沉默突變位點(diǎn)的ARF17 mRNA轉(zhuǎn)基因植株中觀察到，植株表現(xiàn)出多種異常表型，包括畸形葉片產(chǎn)生、開花期提前、育性降低等。這是由于miR160作用的靶標(biāo)——ARF17 mRNA含有5個(gè)沉默突變位點(diǎn)，導(dǎo)致miR160不能正常介導(dǎo)ARF17 mRNA的切割。雖然這些研究初步證明了miRNA與植物育性的相關(guān)性，但是要揭示具體的調(diào)控機(jī)制，目前的研究成果還相當(dāng)匱乏，辣椒中更是未見報(bào)道。

研究表明，辣椒的小孢子單核靠邊期是花粉敗育的重要時(shí)期[20-22]，并且是許多已報(bào)道育性相關(guān)基因表達(dá)差異大的時(shí)期[23-24]。因此，本試驗(yàn)通過對(duì)辣椒GMS小孢子單核靠邊期建立miRNA差異表達(dá)文庫(kù)，研究其與育性的關(guān)系。通過建立辣椒小孢子單核靠邊期差異表達(dá)的miRNA文庫(kù)，篩選差異表達(dá)miRNA并預(yù)測(cè)其靶基因，利用qRT-PCR技術(shù)驗(yàn)證差異分析結(jié)果并鑒定miRNA與靶基因相關(guān)關(guān)系，為辣椒miRNA育性調(diào)控功能研究提供信息。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗(yàn)所用GMS兩用系辣椒材料‘629AB由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)辣椒課題組提供。2014年春在中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)上莊實(shí)驗(yàn)站大棚內(nèi)種植，常規(guī)管理。在開花期，分別收集不育株和可育株的花蕾，根據(jù)小孢子發(fā)育時(shí)期與花器官形態(tài)的相關(guān)性，將收集到的花蕾分為四分體時(shí)期、單核早中期、單核靠邊期和雙核期[25]，剝?nèi)』ㄋ幉⒘⒓从靡旱鋬觯?80 ℃保存待用。

1.2 small RNA文庫(kù)的測(cè)序及生物信息學(xué)分析

1.2.1 總RNA的提取，sRNA文庫(kù)的建立并測(cè)序

Trizol（Invitrogen公司，美國(guó)）法分別提取不育株和可育株單核靠邊期花藥RNA。用NanoDrop紫外分光光度計(jì)檢測(cè)濃度和純度（RNA濃度≥500 mg·L-1，OD260/280為1.8～2.2，260 nm處有正常峰值），1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA完整性（RNA 28S/18S≥1.5）。

樣品檢測(cè)合格后，利用sRNA的3及5端特殊結(jié)構(gòu)（5端有完整的磷酸基團(tuán)，3端有羥基）的特征，以總RNA為起始樣品，在sRNA的3端和5端添加接頭，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。經(jīng)過PCR擴(kuò)增，PAGE凝膠電泳分離目標(biāo)DNA片段，切膠回收得到cDNA文庫(kù)。經(jīng)檢測(cè)合格后，利用HiSeqTM 2500基因分析儀測(cè)序。

1.2.2 miRNA鑒定 原始reads經(jīng)過過濾低質(zhì)量并除去無接頭后長(zhǎng)度小于18 nt和大于30 nt的reads，最終得到clean reads。將clean reads分別與GenBank庫(kù)（http：//www.ncbi.nih.gov./genebank/）、Rfam庫(kù)（http：//rfam.sanger.ac.uk/）比對(duì)，去除其他ncRNA（非編碼RNA，包括rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA）序列，剩下的與參考基因組比對(duì)獲得比對(duì)到基因組的序列。對(duì)于比對(duì)到參考基因組的序列，利用miRDeep2軟件進(jìn)行miRNA前體預(yù)測(cè)，軟件對(duì)star序列、序列數(shù)目、MFE（最小折疊自由能））、cons.seed等分別進(jìn)行打分，最終分?jǐn)?shù)大于0即為前體序列。

預(yù)測(cè)到了前體序列則可以確定前體序列中的成熟序列、環(huán)狀結(jié)構(gòu)、star序列的位置，將比對(duì)到成熟序列位置上的序列提取出來即為成熟的miRNA。

將預(yù)測(cè)到的前體序列和成熟序列與miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)中的所有植物做比對(duì)，來定義保守miRNA和非保守miRNA。

1.2.3 microRNA差異表達(dá)分析 整合2個(gè)樣品中比對(duì)到各miRNA上的reads數(shù)，利用IDEG6，選取FDR<0.01且Fold Change>=2作為標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行差異表達(dá)分析。FDR（False Discovery Rate）表示錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率，它是通過對(duì)p-value進(jìn)行校正得到的。轉(zhuǎn)錄組中的差異miRNA分析是對(duì)大量的miRNA進(jìn)行獨(dú)立的統(tǒng)計(jì)假設(shè)檢驗(yàn)，它會(huì)導(dǎo)致總體假陽性偏高的問題，因此在差異軟件進(jìn)行差異分析過程中，采用Benjamini Hochberg校正方法[26]對(duì)原有假設(shè)檢驗(yàn)得到的p-value進(jìn)行校正，最終采用FDR作為差異基因篩選取得的關(guān)鍵指標(biāo)。

1.2.4 靶基因預(yù)測(cè)及注釋 利用預(yù)測(cè)的miRNA序列信息和辣椒基因組中的序列信息文件，通過TargetFinder軟件進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)。靶基因預(yù)測(cè)的罰分系統(tǒng)如下：1）錯(cuò)配、單堿基缺失和凸起分別罰1分；2）出現(xiàn)G：U配對(duì)罰0.5分；3）microRNA 5端的第2～第13位堿基出現(xiàn)G：U以外的錯(cuò)配罰1分。若配對(duì)出現(xiàn)以下情況則認(rèn)定其不是該miRNA的靶基因：1）多于1個(gè)單堿基缺失或凸起；2）錯(cuò)配、G：U配對(duì)、缺失或凸起的總數(shù)大于7；3）多于4個(gè)錯(cuò)配數(shù)或多于4個(gè)G：U配對(duì)。最終罰分小于或等于3則預(yù)測(cè)其為該miRNA的靶基因。

使用BLAST軟件將預(yù)測(cè)得到的靶基因序列與GO數(shù)據(jù)庫(kù)[27]比對(duì)，獲得靶基因序列的注釋信息。

1.3 qRT-PCR分析

1.3.1 miRNA的qRT-PCR檢測(cè) Trizol法分別提取小孢子四分體時(shí)期、單核早中期、單核靠邊期、雙核期4個(gè)時(shí)期的總RNA。檢測(cè)濃度和完整性后，置于-80 ℃ 貯存?zhèn)溆?。利用miRNA cDNA Kit（康為世紀(jì)，中國(guó)）進(jìn)行miRNA對(duì)應(yīng)的cDNA第一鏈合成：首先在miRNA3末端加多聚A尾的方法來使miRNA具有Poly（A）尾，之后再使用Oligo（dT）-Universal tag通用逆轉(zhuǎn)錄引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，最終合成miRNA對(duì)應(yīng)的第一鏈cDNA。最后用熒光定量 PCR 檢測(cè) miRNA 的表達(dá)情況。實(shí)時(shí)熒光定量利用miRNA Real-Time PCR Assay Kit（康為世紀(jì)，中國(guó)），按照說明冰上配制下列反應(yīng)體系：2×miRNA qPCR premix（With SYBR and ROX） 10 μL，F(xiàn)orward primer（10 μmol·L-1） 0.4 μL，Reverse primer（10 μmol·L-1） 0.4 μL，miRNA第一鏈cDNA模板2.5 μL，RNase-Free Water補(bǔ)足20 μL反應(yīng)體系。利用ABI 7500熒光定量PCR儀執(zhí)行以下反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 10 min，變性95 ℃ 15 s，退火延伸60 ℃ 1 min，45個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)Real Time PCR的擴(kuò)增曲線和溶解曲線，記錄Ct值并計(jì)算2-ΔΔCt。Reverse primer使用試劑盒自帶引物，F(xiàn)orward primer序列列于表1。

1.3.2 靶基因qRT-PCR檢測(cè) 小孢子發(fā)育4個(gè)時(shí)期總RNA的提取方法和檢測(cè)方法同上。利用PrimeScript? II 1st strand cDNA Synthesis Kit（Takara公司，日本）按照說明書進(jìn)行cDNA第一鏈的合成，然后利用Promega GoTaq qPCR Master Mix（Promega公司，美國(guó)）冰上配制反應(yīng)體系：2×GoTaq? qPCR Master Mix 10 μL，F(xiàn)orward primer（10 μmol·L-1） 0.4 μL，Reverse primer（10 μmol·L-1） 0.4 μL，cDNA模板2 μL，RNase-Free Water 7.2 μL共20 μL的反應(yīng)體系。利用ABI 7500熒光定量PCR儀執(zhí)行以下反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 10 min，變性95 ℃ 15 s，退火延伸60 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)Real Time PCR的擴(kuò)增曲線和溶解曲線，記錄Ct值并計(jì)算2-ΔΔCt。引物序列列于表2。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)序結(jié)果統(tǒng)計(jì)

分別對(duì)小孢子發(fā)育單核靠邊期的不育株和可育株的花藥進(jìn)行Illumina測(cè)序。2個(gè)材料通過測(cè)序，過濾低質(zhì)量reads、接頭及過長(zhǎng)過短序列，最終得到clean reads分別為19 852 077、16 503 277條。通常，sRNA庫(kù)的測(cè)序結(jié)果在成分上比較復(fù)雜，除了包括大量miRNA和siRNA，還有來自其他編碼和非編碼序列的降解片段，因此將這些clean reads分別與GenBank庫(kù)、Rfam庫(kù)比對(duì)，提取注釋信息 （表3）。

不育株中匹配到參考基因組（http：//peppersequence.genomics.cn/page/species/index.jsp）的序列有9 489 233條，占總序列數(shù)的47.80%，可育株中可以匹配到的序列有7 464 111條，占總序列數(shù)的45.23%（表3）。

表3 clean reads分類注釋結(jié)果

2個(gè)文庫(kù)的sRNA結(jié)果顯示，不育株和可育株中的sRNA都是以24 nt最多，分別占總數(shù)的51.28%、51.63%。miRDeep2預(yù)測(cè)得到不育株和可育株的miRNA長(zhǎng)度主要在21、22、24 nt。分析miRNA位點(diǎn)對(duì)堿基的偏好發(fā)現(xiàn)，miRNA成熟體序列首位堿基對(duì)堿基U具有很強(qiáng)的偏向性。2個(gè)庫(kù)共發(fā)掘出857個(gè)可信度高的新的miRNA，與miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)后得到保守的miRNA有262個(gè)，非保守的有595個(gè)。

2.2 差異表達(dá)的miRNA

2個(gè)庫(kù)共篩選出42個(gè)差異顯著表達(dá)的miRNA，其中可育株相對(duì)于不育株表達(dá)上調(diào)的有16個(gè)，下調(diào)的有26個(gè)。上調(diào)的16個(gè)miRNA中，有3個(gè)保守的miRNA和13個(gè)非保守miRNA。下調(diào)的miRNA中，有11個(gè)保守miRNA，15個(gè)非保守miRNA。

2.3 靶基因預(yù)測(cè)及注釋

找到miRNA所調(diào)控的mRNA靶標(biāo)對(duì)理解miRNA的生物功能至關(guān)重要。在857個(gè)預(yù)測(cè)得到的miRNA中，有733個(gè)可以預(yù)測(cè)到靶基因，共預(yù)測(cè)到12 374個(gè)靶基因，其中223個(gè)保守的miRNA共預(yù)測(cè)到4 850個(gè)靶基因，510個(gè)非保守的miRNA共預(yù)測(cè)到7 524個(gè)靶基因（表4）。

對(duì)預(yù)測(cè)得到的miRNA的靶基因進(jìn)行GO分類注釋，共注釋到6 879個(gè)靶基因，其中，差異表達(dá)的miRNA靶基因共注釋得到2 176個(gè)，與總的靶基因GO分類相比，差異miRNA的靶基因在細(xì)胞過程和免疫系統(tǒng)過程方面有較多富集。

所有靶基因中與繁殖有關(guān)的注釋到527個(gè)，與生殖過程有關(guān)的基因有523個(gè)。差異miRNA的靶基因在2種分類中分別為152和151個(gè)。經(jīng)過進(jìn)一步的分級(jí)注釋，篩選得到6個(gè)注釋與生殖有關(guān)的靶基因（表5）。其他還包括一系列調(diào)控分生組織營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)轉(zhuǎn)變的基因。

表5 GO注釋與生殖有關(guān)的部分

2.4 qRT-PCR

為了驗(yàn)證新預(yù)測(cè)的miRNA在辣椒中的真實(shí)性、在小孢子發(fā)育的不同時(shí)期表達(dá)量變化情況及其與靶基因的關(guān)系，選取9條miRNA與其相應(yīng)的9條靶基因，根據(jù)序列設(shè)計(jì)引物，用qRT-PCR對(duì)辣椒小孢子發(fā)育的4個(gè)時(shí)期的miRNA和靶基因進(jìn)行檢測(cè)（表6）。為了驗(yàn)證測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性，選取了Capana08g000340、Capana08g000534、Capana00g000886為測(cè)序數(shù)據(jù)顯示有顯著表達(dá)差異的miRNA對(duì)應(yīng)的靶基因。Capana04g001683、Capana06g002954、Capana12g002894為表達(dá)差異大并在GO分類中與生殖相關(guān)的基因，CaSEP1、CaPROF、CaNAC為本實(shí)驗(yàn)室篩選得到的育性相關(guān)候選基因。

[注] CaSEP1、CaPROF、CaNAC在基因組中的編號(hào)分別為Capana02g003249、Capana06g001250、Capana03g003315。

熒光定量融解曲線顯示各miRNA及靶基因擴(kuò)增產(chǎn)物為單峰，表明9條miRNA在辣椒中真實(shí)存在。unconservative_Chr00_6109657、conservative _Chr00_6253770、unconservative_Chr05_2660285在兩樣本中表達(dá)差異大，在單核靠邊期，3條miRNA在不育株中的表達(dá)量分別是可育株的2.74倍、3.83倍、2.74倍，與測(cè)序結(jié)果一致。

9個(gè)miRNA在辣椒小孢子發(fā)育的不同時(shí)期中均有不同程度的表達(dá)，CaSEP1、CaPROF、CaNAC這3個(gè)實(shí)驗(yàn)室篩選到的基因?qū)?yīng)的miRNA呈現(xiàn)一致的表達(dá)趨勢(shì)，即前期表達(dá)量較低，單核靠邊期表達(dá)量顯著增加，達(dá)到最高，雙核期表達(dá)量又迅速下降，不育株和可育株中趨勢(shì)變化一致。GO分類中與育性相關(guān)的靶基因?qū)?yīng)的miRNA表達(dá)趨勢(shì)各不相同，但從總量來看，單核靠邊期都是這3條miRNA大量表達(dá)的時(shí)期，同時(shí)又是unconservative_Chr06_2966220、unconservative_Chr00_6146461這2條miRNA的表達(dá)量顯著差異的時(shí)期，在不育株中的表達(dá)量分別是可育株的13.21倍和2.31倍（圖1）。

分析這些miRNA在4個(gè)時(shí)期表達(dá)趨勢(shì)變化，發(fā)現(xiàn)最多的一類就是四分體時(shí)期、單核早中期表達(dá)量相對(duì)低，單核靠邊期表達(dá)量顯著增高，雙核期又明顯下降。

靶基因方面，在小孢子發(fā)育的不同時(shí)期，選取的9條靶基因呈現(xiàn)各異的表達(dá)趨勢(shì)，并且在不同階段，與其相應(yīng)的miRNA存在的相關(guān)關(guān)系各不相同。從本試驗(yàn)選出做qRT-PCR的miRNA相對(duì)表達(dá)豐度最高且表達(dá)差異比較大的單核靠邊期來看，有 7個(gè)miRNA與其相應(yīng)的靶基因呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)關(guān)系。但這種負(fù)相關(guān)關(guān)系從各個(gè)時(shí)期來看并不嚴(yán)格，會(huì)因?yàn)闀r(shí)期的不同和表達(dá)量變化而呈現(xiàn)其他相關(guān)關(guān)系。例如，unconservative_Chr00_6146461與其靶基因Capana12g002894在單核靠邊期、雙核期表現(xiàn)負(fù)相關(guān)，但在四分體時(shí)期和單核早中期卻呈現(xiàn)正相關(guān)（圖1）。

3 討 論

近年來對(duì)于植物miRNA的研究越來越深入，但主要集中在擬南芥[28-29]、水稻[30]等模式植物上，對(duì)辣椒的miRNA研究少有報(bào)道，關(guān)于辣椒miRNA的測(cè)序研究主要關(guān)注miRNA在不同組織中的表達(dá)[31]。本研究第一次從細(xì)胞核雄性不育兩用系的角度利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)辣椒miRNA進(jìn)行了分析，通過qRT-PCR技術(shù)探討了miRNA及其靶基因在不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)模式以及二者的關(guān)系，為闡明miRNA對(duì)辣椒雄蕊育性的影響提供了依據(jù)。

本試驗(yàn)預(yù)測(cè)得到的sRNA的長(zhǎng)度分布以24 nt最多，這與許多已報(bào)道的物種擬南芥[32]、小麥[33]和棉花[34]中24 nt的sRNA分布最多情況一致。已報(bào)道的辣椒miRNA長(zhǎng)度多在21 nt[35]，本研究的結(jié)果表明，miRNA的序列長(zhǎng)度主要分布在21、22、24 nt，這是對(duì)前人研究結(jié)果的驗(yàn)證和補(bǔ)充。miRNA成熟序列首位堿基對(duì)U具有很強(qiáng)的偏向性，這一結(jié)果符合了前體miRNA（pre-miRNA）在Exportin-5幫助下轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核外，由細(xì)胞質(zhì)Dicer酶對(duì)特異位點(diǎn)進(jìn)行酶切的特性[36]。2個(gè)材料共預(yù)測(cè)出857個(gè)miRNA，其中差異表達(dá)的有42個(gè)，差異表達(dá)miRNA對(duì)應(yīng)的靶基因多富集在辣椒的新陳代謝過程中，說明在辣椒小孢子單核靠邊期，miRNA可能是通過調(diào)節(jié)新陳代謝來調(diào)控育性。

通過對(duì)挑選出的9個(gè)miRNA與其靶基因進(jìn)行qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，多數(shù)miRNA在單核靠邊期表達(dá)差異最大，并負(fù)調(diào)控其靶基因。之前的研究表明unconservative_Chr11_4964464的靶基因與雄蕊發(fā)育有關(guān)，unconservative_Chr12_5488192的靶基因與花粉的萌發(fā)和花粉管的生長(zhǎng)有關(guān)[23]，這2個(gè)miRNA在單核靠邊期均大量表達(dá)并負(fù)調(diào)控其靶基因。這一時(shí)期多數(shù)miRNA與其靶基因的負(fù)相關(guān)關(guān)系一定程度上反映了miRNA與其靶基因的負(fù)調(diào)控模式。miRNA負(fù)調(diào)控其靶基因此前已多有研究[7-9]，其中育性調(diào)控方面也是如此。例如植物過量表達(dá)miR156后，其靶標(biāo)的一類轉(zhuǎn)錄因子基因SPL表達(dá)量減少，出現(xiàn)短日照條件下開花延遲、育性降低的現(xiàn)象[18]。miR160合成減少時(shí)，其靶標(biāo)ARF17會(huì)積累，植株出現(xiàn)育性降低的現(xiàn)象[19]。另外，本試驗(yàn)的結(jié)果顯示，有少數(shù)miRNA與其靶基因并不存在嚴(yán)格的負(fù)相關(guān)關(guān)系，同一miRNA在不同時(shí)期可能呈現(xiàn)不同的相關(guān)關(guān)系，這些結(jié)果可能與之前報(bào)道的miRNA與其靶基因呈現(xiàn)“一對(duì)多”（一個(gè)miRNA對(duì)應(yīng)多個(gè)靶基因）、“多對(duì)一”（多個(gè)miRNA對(duì)應(yīng)一個(gè)靶基因）的對(duì)應(yīng)關(guān)系有關(guān)[19]。因此我們進(jìn)一步推測(cè)不同時(shí)期miRNA側(cè)重調(diào)控的靶基因不同，同一時(shí)期發(fā)揮主要作用的miRNA不同。

本研究證明了前期發(fā)現(xiàn)的育性相關(guān)基因和本試驗(yàn)中預(yù)測(cè)的部分育性相關(guān)基因與其對(duì)應(yīng)miRNA間的負(fù)相關(guān)關(guān)系，說明miRNA可能是通過負(fù)調(diào)控其靶基因進(jìn)而影響辣椒育性。但是，由于目前辣椒育性相關(guān)基因的報(bào)道較少，育性決定基因也沒有被克隆，辣椒細(xì)胞核雄性不育的分子機(jī)理尚不明確，miRNA與育性的確切關(guān)系也還需要進(jìn)一步的驗(yàn)證。

4 結(jié) 論

本研究分析了辣椒細(xì)胞核雄性不育兩用系花藥中sRNA的分布情況，篩選得到了一系列在兩材料中表達(dá)差異顯著的miRNA，這些miRNA的靶基因多富集在新陳代謝過程中，并且與生殖直接相關(guān)的靶基因功能涉及生殖結(jié)構(gòu)發(fā)育、多細(xì)胞生物生殖相關(guān)、生殖中涉及到的細(xì)胞過程、有性生殖等方面，這些miRNA與其靶基因?yàn)槔苯酚匝芯刻峁┝酥匾畔?。本研究初步分析了?xì)胞核雄性不育辣椒中的miRNA和其相應(yīng)靶基因的表達(dá)模式，為辣椒育性相關(guān)miRNA的功能研究提供了參考。

參考文獻(xiàn)

[1] Wang D，Bosland P W. The genes of Capsicum[J]. HortScience，2006，41（5）： 1169-1187.

[2] Chen C，Chen G，Hao X，et al. CaMF2，an anther-specific lipid transfer protein （LTP） gene，affects pollen development in Capsicum annuum L.[J]. Plant Science，2011，181（4）： 439-448.

[3] Chen C M，Liu S Q，Hao X F，et al. Characterization of a pectin methylesterase gene homolog，CaPME1，expressed in anther tissues of Capsicum annuum L.[J]. Plant Molecular Biology Reporter，2011，30（2）： 402-413.

[4] Lee R C，F(xiàn)einbaum R L，Ambros V. The C.elegans heterochronic gene lin-4 small RNAs with antisense complementarity to Lin-14[J]. Cell，1993，75（5）： 843-854.

[5] Reinhart B J，Weinstein E G，Rhoades M W，et al. MicroRNAs in plants[J]. Genes & Development，2002，16（13）： 1616-1626.

[6] 于永生，羅曉彤，金海國(guó)，等. 小鼠胚胎著床相關(guān)基因中mir-21靶基因的初步驗(yàn)證[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，14（3）： 22-26.

[7] Bartel D P. MicroRNAs： Target recognition and regulatory functions[J]. Cell，2009，136（2）： 215-233.

[8] 李素雅，張建宏，陳 文，等. 雞Lpin1基因3-UTR遺傳變異及其對(duì)miRNA結(jié)合位點(diǎn)的潛在效應(yīng)[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，45（8）： 1613-1620.

[9] Jung J H，Seo P J，Park C M. MicroRNA biogenesis and function in higher plants[J]. Plant Biotechnology Reports，2009，3（2）： 111-126.

[10] Wu G，Park M Y，Conway S R，et al. The sequential action of miR156 and miR172 regulates developmental timing in Arabidopsis[J]. Cell，2009，138： 750-759.

[11] Yang J S，Phillips M D，Betel D，et al. Widespread regulatory activity of vertebrate microRNA* species[J]. RNA，2011，17（2）： 312-326.

[12] 鹿 游，馬 超，孟 冬，等. 蘋果‘金冠AGO1基因克隆及與發(fā)育相關(guān)miRNA表達(dá)分析[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，18（5）： 69-76.

[13] Feng J，Lai L，Lin R，et al. Differential effects of Cucumber mosaic virus satellite RNAs in the perturbation of microRNA-regulated gene expression in tomato[J]. Molecular Biology Reports，2012，39（1）： 775-784.

[14] Diermann N，Matou?ek J，Junge M，et al. Characterization of plant miRNAs and small RNAs derived from potato spindle tuber viroid （PSTVd） in infected tomato[J]. Biological Chemistry，2010，391（12）： 1379-1390.

[15] 曹慧穎，王 可，高何瑞，等. 植物激素相關(guān)microRNA 研究進(jìn)展[J]. 植物生理學(xué)報(bào)，2013，49（11）： 1121-1126.

[16] Grant-Downton R，Le Trionnaire G，Schmid R，et al. MicroRNA and tasiRNA diversity in mature pollen of Arabidopsis thaliana[J]. BMC Genomics，2009，10（1）： 1-16.

[17] Chambers C，Shuai B. Profiling microRNA expression in Arabidopsis pollen using microRNA array and real-time PCR[J]. BMC Plant Biology，2009，9（1）： 87-87.

[18] Schwab R，Palatnik J F，Riester M，et al. Specific effects of microRNAs on the plant transcriptome[J]. Developmental Cell，2005，8（4）： 517-527.

[19] Mallory A C，Bartel D P，Bartel B. MicroRNA directed regulation of Arabidopsis AUXIN RESPONSE FACTOR17 is essential for proper development and modulates expression of early auxin response genes[J]. Plant Cell，2005，17（5）： 1360-1375.

[20] 王述彬，羅向東，戴亮芳，等. 辣（甜）椒細(xì)胞質(zhì)雄性不育系減數(shù)分裂和雄配子發(fā)生過程[J]. 園藝學(xué)報(bào)，2004，31（6）： 807-810.

[21] 逯紅棟，鞏振輝，王曉敏，等. 辣椒雄性不育材料小孢子發(fā)生的細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察[J]. 西北植物學(xué)報(bào)，2006，26（9）： 1842-1845.

[22] Hirose T，F(xiàn)ujime Y. Studies on hybrid seed production using a new male sterility line in C.annuum L.[J]. Journal of the Japanese Society for Horticultural Science，1980，48（4）： 453-458.

[23] 劉 辰，馬 寧，付 楠，等. 辣椒GMS育性相關(guān)候選基因的克隆及表達(dá)分析[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，47（16）： 3264-3276.

[24] 韓 清，馮 淼，劉 辰，等. 利用 cDNA-AFLP 技術(shù)研究辣椒核雄性不育兩用系的基因差異表達(dá)[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2012，20（10）： 1117-1125.

[25] 張菊平，鞏振輝，劉珂珂，等. 辣椒小孢子發(fā)育時(shí)期與花器形態(tài)的相關(guān)性[J]. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2007（3）： 153-158.

[26] Benjamini Y，Hochberg Y. Controlling the false discovery rate： a practical and powerful approach to multiple testing[J]. Journal of the Royal Statistical Society. Series B（Statistical Methodological），1995，57（1）： 289-300.

[27] Ashburner M，Ball C A，Blake J A，et al. Gene Ontology： tool for the unification of biology[J]. Nature Genetics，2000，25（1）： 25-29.

[28] Addo-Quaye C，Eshoo T W，Bartel D P，et al.Endogenous siRNA and miRNA targets identified by sequencing of the Arabidopsis degradome[J]. Current Biology，2008，18（10）： 758-762.

[29] Zhan S，Lukens L. Identification of novel miRNAs and miRNA dependent developmental shifts of gene expression in Arabidopsis thaliana[J]. PloS One，2010，5（4）： 10157.

[30] Wei L Q，Yan L F，Wang T. Deep sequencing on genome-wide scale reveals the unique composition and expression patterns of miRNAs in developing pollen of Oryza sativa[J]. Genome Biology，2011，12（6）： 53.

[31] Qin C，Yu C，Shen Y，et al. Whole-genome sequencing of cultivated and wild peppers provides insights into Capsicum domestication and specialization[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2014，111（14）： 5135-5140.

[32] Kasschau K D，F(xiàn)ahlgren N，Chapman E J，et al. Genome-wide profiling and analysis of Arabidopsis siRNAs[J]. PLoS Biology，2007，5（3）： 57.

[33] Wei B，Cai T，Zhang R Z，et al. Novel microRNAs uncovered by deep sequencing of small RNA transcriptomes in bread wheat （Triticum aestivum L.） and Brachypodium distachyon （L.） Beauv[J]. Functional and Integrative Genomics，2009，9（4）： 532-541.

[34] Pang M，Woodward A W，Agarwal V，et al. Genome-wide analysis reveals rapid and dynamic changes in miRNA and siRNA sequence and expression during ovule and fiber development in allotetraploid cotton （Gossypium hirsutum L.） [J]. Genome Biology，2009，10（11）： 122.

[35] Hwang D G，Park J H，Lim J Y，et al. The hot pepper （Capsicum annuum） microRNA transcriptome reveals novel and conserved targets： a foundation for understanding microRNA functional roles in hot pepper[J]. PloS One，2013，8（5）： E64238.

[36] 王永江，李中安，張振臣，等. 利用Solexa測(cè)序技術(shù)鑒定甜橙miRNAs[J]. 果樹學(xué)報(bào)，2013，30（4）： 526-536.