程鴻 孔維萍

摘 要： MLO（mildew resistance locus O）被認(rèn)為是研究植物廣譜抗性的模式基因，它編碼一種7TM跨膜蛋白，對(duì)白粉病菌具有負(fù)調(diào)控作用。野生或者人工突變獲得的mlo基因，對(duì)白粉病具有廣譜抗性，表明MLO在植物白粉病育種方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。就MLO的發(fā)現(xiàn)、結(jié)構(gòu)定位、細(xì)胞學(xué)證據(jù)、突變抗病的機(jī)制等方面的研究現(xiàn)狀及在瓜菜類作物廣譜抗性材料創(chuàng)制中的應(yīng)用進(jìn)行了總結(jié)，并討論了今后的研究重點(diǎn)。

關(guān)鍵詞： 白粉??； MLO； 廣譜抗性

Progress of MLO gene on broad-spectrum resistance to powdery mildew in cucurbits and vegetables

CHENG Hong， KONG Weiping

（Institute of Vegetable， Gansu Academy of Agricultural Science， Lanzhou 730070， China）

Abstract： MLO（mildew resistance locus O）is considered to be a model plant gene suitable for study broad-spectrum resistance，which encodes a transmembrane protein 7TM. It may play a negative regulatory role on powdery mildew，which indicated that it has potential applications in plant breeding for resistance to powdery mildew. This paper depicts progress in powdery mildew research and creation of broad-spectrum resistance material in cucurbits and vegetables. The research direction in the future is also put forward.

Key words： Powdery mildew； MLO； Broad-spectrum

白粉病在我國(guó)分布較為普遍，危害很多農(nóng)作物，為高度?；约纳婢?，可侵染600多種植物[1]。它的主要寄主不僅包括麥類作物，而且還包括了眾多的園藝類作物，在瓜類上發(fā)病尤為嚴(yán)重[2]。近年來(lái)隨著分子生物學(xué)技術(shù)的逐步發(fā)展，人們開始重視利用分子育種技術(shù)從作物資源中挖掘抗白粉病種質(zhì)資源，為品種選育提供支持，在黃瓜、西瓜、甜瓜等很多作物上也相繼發(fā)現(xiàn)了抗白粉病基因[3]，這些基因資源極大地促進(jìn)了瓜類種質(zhì)資源的抗性育種創(chuàng)新。在我國(guó)由于地域廣闊、生態(tài)環(huán)境復(fù)雜，白粉病不僅分布廣泛而且生理小種眾多。在黃瓜、冬瓜、南瓜、甜瓜等作物上均發(fā)現(xiàn)白粉病的生理小種[3-9]。從世界范圍看這些生理小種也在逐漸演替，比如在美國(guó)東南部地區(qū)，瓜類作物上曾發(fā)現(xiàn)Podosphaera. xanthii族群的生理小種2向生理小種1演替[10]，在法國(guó)、西班牙、日本也有甜瓜白粉病生理小種演替的報(bào)道[10-11]。Hosoya等[12]提出為了應(yīng)對(duì)不斷演替的白粉病生理小種對(duì)品種抗性的挑戰(zhàn)，育種者需要挖掘或者創(chuàng)新具有廣譜抗性的種質(zhì)資源，從而保持品種對(duì)白粉病菌的持續(xù)抗性。

MLO被認(rèn)為是研究植物廣譜抗病性的最佳模式基因[13]，普遍認(rèn)為它對(duì)白粉病菌具有負(fù)調(diào)控作用，類似于植物的“感病基因”。無(wú)論在雙子葉植物擬南芥還是單子葉植物大麥上，都有科學(xué)證據(jù)證明MLO突變體對(duì)白粉病菌具有廣譜抗性[14-15]，因此在農(nóng)作物白粉病育種方面具有一定的應(yīng)用價(jià)值。本文在現(xiàn)有研究基礎(chǔ)上綜述MLO基因在瓜菜類作物廣譜抗性方面的最新研究進(jìn)展，并討論該研究領(lǐng)域的發(fā)展方向。

1 MLO基因的發(fā)現(xiàn)

植物存在兩類基本抗性，一類是“基因?qū)颉笔降母叨葘Ｒ坏腞基因抗性，第二類抗性方式即通過(guò)突變寄主植物自身的一個(gè)或者幾個(gè)基因，來(lái)誘導(dǎo)對(duì)某一類或幾類病原物的抗性，大麥mlo基因就屬于這類基因[16]。1937年，德國(guó)人發(fā)現(xiàn)野生的2個(gè)大麥株系對(duì)白粉病菌所有已知的生理小種都具有很高的抗性[17]，造成這種現(xiàn)象的原因是由于MLO基因發(fā)生了突變。研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)人工誘導(dǎo)使大麥MLO基因突變可以使大麥產(chǎn)生對(duì)白粉病菌持久、廣譜的抗性。一般認(rèn)為MLO基因在植物的抗病過(guò)程起負(fù)調(diào)控的作用，在一定程度上相當(dāng)于植物的“感病基因”，它缺失或突變后可能啟動(dòng)類似非寄主的識(shí)別反應(yīng)，進(jìn)而激發(fā)植物增加對(duì)病原菌的廣譜抗性[13-14，18]，可見MLO基因在改善植物抗性方面具有較好的應(yīng)用前景。歐洲的植物育種專家就利用理化誘變的方法獲得了廣譜抗白粉病菌的大麥品種，這類大麥mlo基因是目前唯一在生產(chǎn)上得到大規(guī)模利用的、而且也是最早獲得的具有廣譜抗性的基因[14]，包含有mlo基因的大麥品種能夠高水平的抵抗30多個(gè)大麥白粉病菌生理小種，反應(yīng)型為免疫或者近免疫[19]。雖然在歐洲大多采用粗放的管理栽培模式，但是這種抗病性在田間可以長(zhǎng)久保持，它們幾乎對(duì)絕大多數(shù)已知的大麥白粉病菌的生理小種具有抗性，且抗性水平高[19]。

mlo基因介導(dǎo)的抗性與R基因相比明顯不同，其最顯著的特點(diǎn)就是能抗所有己知的白粉病病原菌生理小種，具有廣譜抗病性。從來(lái)源來(lái)講任何感病的野生型（MLO）都可以通過(guò)化學(xué)、物理或者生物誘變的方法獲得mlo抗性。目前在生產(chǎn)上應(yīng)用的mlo抗病等位基因除mlo-11是自發(fā)天然突變之外，其他的均來(lái)源于人工誘變[14，20-21]。

盡管有學(xué)者發(fā)現(xiàn)白粉病菌Race 1和HL3/4小種在mlo抗性的大麥上具有輕微的侵染性[22]，但MLO基因重要的學(xué)術(shù)理論價(jià)值和廣闊的應(yīng)用前景，促使許多專家學(xué)者利用遺傳學(xué)、分子生物學(xué)方法對(duì)MLO基因以及其編碼蛋白做了大量深入研究，為此類基因在抗白粉病育種工作中的廣泛應(yīng)用提供了重要理論基礎(chǔ)[23]。目前已鑒定出86個(gè)編碼植物MLO同源蛋白基因，包括：擬南芥（15）；水稻（12）；大麥（2）；小麥（3）；玉米（9）；甜瓜（3）番茄（1）；蕪菁（1）；辣椒（1）；百脈根（1）；豌豆（1）；高粱（2）；葡萄（8）；毛果楊（6）；江南卷柏（1）；煙草（1）； 北美云杉（1）和琴葉擬南芥（8）[15，24-29]。

2 MLO基因及其編碼的蛋白結(jié)構(gòu)與細(xì)胞定位

第一個(gè)野生大麥MLO基因在1997年被克隆，為MLO功能研究奠定了良好基礎(chǔ)。研究發(fā)現(xiàn)大麥MLO基因的產(chǎn)物為一個(gè)60 ku的跨膜蛋白[13]，具有7個(gè)跨膜螺旋區(qū)，可能位于質(zhì)膜上[30]。其氨基端和羧基端分別位于胞外和胞內(nèi)，羧基的長(zhǎng)尾上具有酪氨酸激酶的活性位點(diǎn)和核定位序列（NLS）[13]。Hinze等[31]運(yùn)用分子定位標(biāo)記技術(shù)把MLO基因定位到大麥第4條染色體的長(zhǎng)臂上，Devoto等[13]利用MLO-Lep融合蛋白技術(shù)和N-端糖基化突變掃描，發(fā)現(xiàn)大麥品種ingrid的MLO蛋白有一個(gè)羧基端長(zhǎng)尾，同樣具備7個(gè)跨膜螺旋結(jié)構(gòu)，其羧基端長(zhǎng)尾結(jié)構(gòu)與動(dòng)物的G-蛋白偶聯(lián)受體（GCRP）類似，并憑借該受體結(jié)構(gòu)定位于質(zhì)膜上；其N-端位于膜外，C-端位于膜內(nèi)，在靠近第7螺旋的C-端胞質(zhì)尾有一鈣調(diào)素結(jié)合區(qū)域。平均而言，植物MLO家族成員之間相似性大約有70%，同源性大約有45%。蛋白序列平均60% 位于胞質(zhì)內(nèi)，25% 位于質(zhì)膜上，15% 位于胞外。另外，MLO家族成員差異主要體現(xiàn)在只有C-端、N-端以及胞外第1環(huán)區(qū)域的序列長(zhǎng)度上[13，32]。目前，MLO基因只在植物和苔鮮類中被發(fā)現(xiàn)，而酵母、原核生物和動(dòng)物中均未發(fā)現(xiàn)有存在，說(shuō)明MLO基因是植物所特有的[14-15，30]。

最近的研究發(fā)現(xiàn)受到病原菌侵染后，瞬時(shí)表達(dá)的MLO蛋白會(huì)在大麥的細(xì)胞質(zhì)膜上重新分布，并且逐漸匯聚在白粉病菌的侵染釘下方[33]。Shirasu等[34]在具有廣譜抗性的mlo大麥表皮細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)MLO-GFP融合蛋白，在整個(gè)表皮細(xì)胞中均觀察到熒光。Bhat等[33]認(rèn)為在沒(méi)有病原菌入侵時(shí)，大多數(shù)的MLO-YFP融合蛋白分布在表皮細(xì)胞的周圍，另外在核膜和膜內(nèi)也檢測(cè)到了該蛋白；而當(dāng)白粉病菌孢子被接種到葉面后，該融合蛋白就很快聚集到附著胞下方了。Cheng 等[35]在甜瓜上通過(guò)構(gòu)建CmMLO2-GFP融合蛋白，在洋蔥表皮瞬時(shí)表達(dá)甜瓜MLO蛋白，熒光顯示融合蛋白定位在細(xì)胞膜上。

植物表皮細(xì)胞一旦受到白粉病菌入侵，MLO蛋白就開始向侵染點(diǎn)附近匯集，這一行為似乎不依賴于肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架功能。在白粉病菌成功入侵的侵染點(diǎn)周圍，MLO蛋白/CAM大量增加。目前有關(guān)MLO蛋白的結(jié)構(gòu)和定位雖然取得了一些共識(shí)，但是人們對(duì)MLO蛋白在植物細(xì)胞中的動(dòng)態(tài)分布還不是十分了解，因此在單細(xì)胞和超微結(jié)構(gòu)水平上系統(tǒng)分析病原菌侵染過(guò)程中MLO基因的時(shí)空表達(dá)特征，將有助于我們深入了解植物廣譜抗病的機(jī)制。

3 MLO基因突變抗病的細(xì)胞學(xué)證據(jù)

野生型MLO基因和一般意義上的R基因有所不同，它轉(zhuǎn)錄表達(dá)后讓大麥對(duì)白粉病菌開始感病，而當(dāng)其突變?yōu)殡[性mlo基因時(shí)，該突變體對(duì)白粉病菌又表現(xiàn)出非小種專化抗性，在機(jī)制上表現(xiàn)為植物的表皮細(xì)胞壁迅速加厚從而形成堅(jiān)硬的乳突結(jié)構(gòu)并產(chǎn)生新的抑菌化學(xué)組分，提升了白粉病菌入侵細(xì)胞的門檻[36]，從而抵制病原菌的初侵染。人們對(duì)大麥的乳突抗病機(jī)制的細(xì)胞學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，乳突反應(yīng)（papilla response）是其遭到白粉菌侵染時(shí)產(chǎn)生的一種典型的非?；头佬l(wèi)反應(yīng)。乳突指通過(guò)乳突反應(yīng)在入侵位點(diǎn)沉積在細(xì)胞壁與原生質(zhì)膜之間的半球狀體。乳突的形成是病菌能否成功侵染的關(guān)鍵，因此，認(rèn)為乳突具有物化的抑制病菌入侵的作用，即乳突抗性。能夠廣譜高效的抵御白粉病菌的大麥mlo突變品種的特征之一，就是形成乳突[37-38]，對(duì)于mlo 突變基因的大麥品種而言，快速、高頻率的形成乳突是抗初侵入的關(guān)鍵因素[39]。

早期認(rèn)為大麥乳突抗性主要表現(xiàn)在抗機(jī)械入侵，附著胞入侵時(shí)能產(chǎn)生機(jī)械壓力，但實(shí)際上有關(guān)乳突物理特性的研究非常有限。Kunoh[40]認(rèn)為乳突硬且有一定彈性，含有較高濃度硅，所以可以抵抗一定的機(jī)械壓力，只有500 u的分子才能自由出入乳突。由于大多數(shù)病原菌激發(fā)子分子量均在1 ku以上，因此它可以在一定程度上阻止寄主與病原之間的信息交流。由此可見，在乳突物理特性方面，它至少有機(jī)械抵抗和不通透性2種潛在抗病作用。最近研究發(fā)現(xiàn)，MLO蛋白通過(guò)抑制抗真菌基因（avrMla）的防御反應(yīng)，在真菌侵染點(diǎn)產(chǎn)生有這些組分引導(dǎo)的病原物誘導(dǎo)的分子抗病模型（PAMPs）[41]。

通過(guò)熒光漂白恢復(fù)技術(shù)（FRAP）檢測(cè)表明該類蛋白的極化作用是非連續(xù)性的，只是植物在受到白粉病菌侵染后的一次應(yīng)激反應(yīng)。將標(biāo)記紅色熒光的過(guò)氧化物酶體HVADF3肌動(dòng)蛋白分解聚積因子HVADF3能阻止肌動(dòng)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)途徑和標(biāo)記黃色熒光蛋白的MLO一起轉(zhuǎn)入大麥表皮細(xì)胞。觀察發(fā)現(xiàn)，大部分觀測(cè)的細(xì)胞在侵入位點(diǎn)除了聚積的過(guò)氧物化酶體外，仍然有大量蛋白聚積，表明有白粉病菌入侵引發(fā)的MLO蛋白的聚積并不通過(guò)肌動(dòng)蛋白絲介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)途徑，而是來(lái)自于周圍的膜蛋白，并很早就聚集在植物表皮細(xì)胞的質(zhì)膜上[33]。

4 突變體mlo在白粉病廣譜抗性中可能的作用機(jī)制

一直以來(lái)細(xì)胞過(guò)敏性壞死被認(rèn)為是植物抗病性表現(xiàn)的主要作用機(jī)制，因此野生MLO基因可能對(duì)細(xì)胞壞死具有負(fù)向調(diào)控作用，也就是對(duì)細(xì)胞壞死起抑制作用[33，32，42]；類似于其他突變體基因以寄主死亡來(lái)抵抗病原菌的入侵，MLO基因突變?yōu)閙lo基因后，對(duì)細(xì)胞壞死的負(fù)調(diào)控作用被解除，由此引發(fā)了植物的廣譜抗性[30，32，34，42]。也有證據(jù)表明，具有mlo突變的大麥能夠抑制病原菌吸器的形成，但被侵染的表皮細(xì)胞并未立即壞死。

Panstruga[14]在2005年提出了大麥MLO與白粉病菌相互作用的假說(shuō)，白粉病菌萌發(fā)長(zhǎng)出芽管，附著在表皮細(xì)胞上，病原相關(guān)的分子模式PAMP引發(fā)信號(hào)傳導(dǎo)，大麥獲得性免疫系統(tǒng)被激發(fā)，從而啟動(dòng)了一系列的生化免疫反應(yīng)，防衛(wèi)相關(guān)基因開始轉(zhuǎn)錄，MLO在相應(yīng)的生物脅迫位點(diǎn)聚集，在細(xì)胞外圍MLO調(diào)控ROR2介導(dǎo)的抑制防御體制開始形成。MLO開始大量轉(zhuǎn)錄，胞吐作用（exocytosis）的調(diào)控因子匯集，促進(jìn)了附著孢的生長(zhǎng)。Bhat等[33]認(rèn)為在大麥表皮細(xì)胞中首先出現(xiàn)膜蛋白極化現(xiàn)象，然后白粉病分生孢子才長(zhǎng)出初生芽管。MLO相關(guān)蛋白在兩極的高固醇區(qū)域聚集，接著孢子芽管繼續(xù)生長(zhǎng)，在附著胞和附著胞芽管的下方集中了大量的類高固醇物質(zhì)，說(shuō)明膜蛋白位于真菌侵入點(diǎn)的最前沿。

Shirasu等[34]用基因槍轉(zhuǎn)化方法將MLO基因轉(zhuǎn)化到具有mlo突變體基因背景大麥表皮細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)白粉病菌成功侵染了那些能表達(dá)綠色熒光蛋白的細(xì)胞，恢復(fù)了表皮細(xì)胞對(duì)白粉病的易感性。另外，Kim等[43]利用瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)將野生型MLO基因?qū)隡LO大麥葉片，發(fā)現(xiàn)使其感病性近乎100%；而用突變型mlo基因轟擊MLO大麥葉片，其感病性沒(méi)有變化，表明MLO基因是感白粉病所必需的。Schweizer等[44]利用RNAi技術(shù)，將MLO-dsRNA直接導(dǎo)入具有野生型MLO背景的大麥表皮細(xì)胞，結(jié)果使得平均白粉菌侵染率降低了50%。試驗(yàn)表明MLO基因在接菌的3 h內(nèi)被大量誘導(dǎo)，在那些成功導(dǎo)入的細(xì)胞內(nèi)MLO基因的mRNA被大量降解，不能合成正常功能的MLO蛋白，解除了對(duì)細(xì)胞死亡的負(fù)調(diào)控作用，同時(shí)該細(xì)胞獲得具有類似于MLO隱性或突變體植株的白粉病抗性，表明MLO基因和mlo基因具有功能上的互補(bǔ)性[31，30，44]。通過(guò)比較非寄主抗性和mlo免疫的大麥和擬南芥的組織學(xué)和病理學(xué)特征，結(jié)合白粉病發(fā)病的必備條件，顯然2種抗性具有很多共性特點(diǎn)，Humphry等[45]推測(cè)這2種抗性的機(jī)制可能是一樣的，他說(shuō)這就像同一枚硬幣的兩個(gè)面，可見2種抗性之間沒(méi)有本質(zhì)的區(qū)別。在mlo突變體中，由于關(guān)鍵的入侵蛋白MLO的缺失，病菌入侵將面臨嚴(yán)重障礙。這就是為什么mlo具有廣譜和持久抗性的原因。所以，任何影響非寄主抗性的基因突變同樣可能影響mlo免疫。

5 問(wèn)題與展望

MLO基因和已經(jīng)克隆的任何R基因都沒(méi)有同源關(guān)系，是新型感病類基因，它的基因產(chǎn)物是細(xì)胞死亡和植物抗性的負(fù)調(diào)控因子，攜帶mlo突變的大麥在沒(méi)有病原菌存在時(shí)易引發(fā)自發(fā)性的細(xì)胞壞死[46]。MLO被誘變導(dǎo)致基因缺失或移碼突變成為mlo后，不能合成有正常功能的MLO蛋白，因此對(duì)細(xì)胞死亡的負(fù)調(diào)控作用被解除，葉表皮細(xì)胞將積累一些抗真菌活性的酚類物質(zhì)以及H2O2和O2-，H2O2可能直接殺死病原菌和被侵染細(xì)胞，從而加固了細(xì)胞壁，防止了白粉病的侵染[20]，由此引發(fā)廣譜的抗病性。目前人們對(duì)MLO蛋白作用機(jī)制的了解還非常有限，自發(fā)性的細(xì)胞壞死假說(shuō)也不能完全解析mlo對(duì)白粉菌抗性的廣譜和持久抗性機(jī)能。但不管怎樣MLO植物突變?yōu)閙lo之后，表皮細(xì)胞壁明顯快速形成了大量堅(jiān)固的乳突（Papillae），提高了白粉病菌入侵的門檻，抑制了初生菌絲的發(fā)育、次生菌絲和次生吸器的形成，降低了入侵率[23]。

在過(guò)去的很多年里，植物病理學(xué)家和植物育種家都認(rèn)為，mlo的廣譜抗性似乎是單子葉植物大麥所獨(dú)有的[14]，隨著擬南芥基因組測(cè)序工作的完成，人們期待能夠在雙子葉植物中找到類似大麥MLO基因的愿望變成了現(xiàn)實(shí)。在最近的擬南芥MLO基因的研究中，科研人員發(fā)現(xiàn)野生型擬南芥具有15個(gè)MLO家族成員[47]，其中的AtMLO2、AtMLO6和 AtMLO12三突變體可以使擬南芥對(duì)白粉病菌（Golovinomyces and G. orontii）完全免疫[15]。這一重要的研究結(jié)果表明：mlo的廣譜抗性并不是大麥等單子葉植物所獨(dú)有的，在擬南芥等雙子葉植物中也存在MLO基因?qū)Π追鄄〉呢?fù)調(diào)控機(jī)制。越來(lái)越多的研究結(jié)果表明：MLO基因轉(zhuǎn)錄缺失或編碼的cDNA序列的突變均可能導(dǎo)致多肽序列的改變，從而引起白粉病的抗性轉(zhuǎn)換。Bai等[2]在對(duì)白粉病抗性的野生型番茄R26品系中的研究發(fā)現(xiàn)，SlMlo1 cDNA序列有19個(gè)堿基的缺失，這個(gè)序列改變導(dǎo)致SlMlo1在編碼區(qū)移碼，猜測(cè)導(dǎo)致過(guò)早的翻譯終止，從而也導(dǎo)致了番茄R26對(duì)白粉病的廣譜抗性。甜瓜作為白粉病菌的廣泛寄主，很有可能存在對(duì)細(xì)胞死亡負(fù)調(diào)控的類似機(jī)制，基于這種猜想，筆者通過(guò)同源克隆的方法，從感病的甜瓜中克隆分離了3個(gè)MLO家族基因，分別命名為CmMLO1、CmMLO2、CmMLO3。將其與綠色熒光蛋白（GFP）構(gòu)建融合基因，進(jìn)行細(xì)胞定位研究，并通過(guò)real-time PCR定量分析白粉病發(fā)病進(jìn)程中各家族基因的mRNA水平變化，鑒定出參與白粉病調(diào)控的主效基因是CmMLO2，同時(shí)選擇高效RNA干擾載體轉(zhuǎn)化甜瓜，抑制了內(nèi)源MLO基因的表達(dá)，獲得了具有廣譜和持久的甜瓜白粉菌抗性種質(zhì)[24，35，48]。徐堅(jiān)等[49]以黃瓜、甜瓜和西瓜基因組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，利用生物信息學(xué)方法對(duì)其MLO基因家族進(jìn)行鑒定與分析。發(fā)現(xiàn)黃瓜、甜瓜和西瓜基因組中共含有42個(gè)MLO基因家族成員，每個(gè)物種均含有14個(gè)成員，且保守性強(qiáng)。這一研究結(jié)果為揭示黃瓜、甜瓜和西瓜MLO基因的進(jìn)化關(guān)系、功能及克隆表達(dá)分析奠定了基礎(chǔ)。

隨著分子生物學(xué)、植物病理學(xué)和基因工程技術(shù)的迅猛發(fā)展，應(yīng)用基因工程手段創(chuàng)新種質(zhì)、提高植物的抗病性為抗病育種開辟了一條新途徑。在瓜類作物上，白粉病的寄主范圍廣泛，甜瓜、黃瓜、南瓜、西瓜等大部分葫蘆科作物都有不同程度的感染。因此開展具有廣譜抗性的MLO基因研究，對(duì)于創(chuàng)制廣譜抗性的種質(zhì)資源，提高作物抗病育種水平具有重要意義。

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