解銀麗　馬琪　李志勇

摘要 為構(gòu)建并表達(dá)O型口蹄疫病毒（ Foot-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDV）的空衣殼蛋白的重組桿狀病毒并鑒定其抗原性。以質(zhì)粒pMD19-P12A3C為模板，擴(kuò)增出編碼O型FMDV衣殼蛋白前體P12A及其蛋白酶3C的P12A3C基因，插入至桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFastBacDual PH啟動(dòng)子下，構(gòu)建出重組轉(zhuǎn)移載體pFastBacDual-P12A3C，并轉(zhuǎn)化DH10BacTM大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，構(gòu)建重組轉(zhuǎn)座子Bacmid-P12A3C，將其轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞，獲得表達(dá)O型FMDV衣殼蛋白的重組桿狀病毒rBac-P12A3C。增殖重組桿狀病毒然后用其感染Sf9細(xì)胞，最后通過(guò)間接免疫熒光檢測(cè)外源蛋白的表達(dá)。結(jié)果表明，表達(dá)產(chǎn)物能夠被O型FMDV VP1多克隆抗體識(shí)別，并具有良好的反應(yīng)原性，表明表達(dá)O型FMDV衣殼蛋白的重組桿狀病毒rBac-P12A3C構(gòu)建成功。該研究為進(jìn)一步研究O型FMDV空衣殼的體外組裝提供前期實(shí)驗(yàn)材料，并為后期研制出口蹄疫的基因工程亞單位疫苗奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：O型口蹄疫病毒；衣殼蛋白；重組桿狀病毒

中圖分類(lèi)號(hào)：S855 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2015）08-095-03

口蹄疫（Foot-and-mouth disease，F(xiàn)MD）是口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDV）引發(fā)牛、羊、豬等偶蹄動(dòng)物易感染的一種動(dòng)物疫病，其傳播速度快、感染率高[1-2]，被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（Office International Des Epizooties，OIE）列為必須上報(bào)的傳染病，被我國(guó)列為一類(lèi)動(dòng)物傳染病[3-4]。FMDV屬于小RNA病毒科口蹄疫病毒屬，是單股的正鏈RNA病毒，基因組全長(zhǎng)約8.5 kb，包含編碼1個(gè)多聚蛋白的開(kāi)放閱讀框（ORF）。其中，在非結(jié)構(gòu)蛋白3C蛋白酶作用下，P1結(jié)構(gòu)蛋白被解離成單體蛋白VP0、VP3、VP1，然后VP0進(jìn)一步解離成單體蛋白VP4 和VP2，F(xiàn)MDV基因組 RNA 能與解離后的單體蛋白組裝成為成熟的146S病毒粒子[1]。接種疫苗是FMD防控最為有效的措施，在控制FMD暴發(fā)的過(guò)程中，口蹄疫滅活疫苗起到了極為重要的防控作用，但是由于其在生產(chǎn)的過(guò)程中需要大量增殖FMD強(qiáng)毒，存在散毒的風(fēng)險(xiǎn)。據(jù)報(bào)道，F(xiàn)MDV空衣殼蛋白75S具有與完整FMDV 146S粒子非常相似的抗原特性，可以引起與完整FMDV病毒粒子極其相似的免疫反應(yīng)，由于病毒空衣殼不含核酸成分，安全性好，不存在散毒風(fēng)險(xiǎn)[5]。因此，研制FMDV空衣殼疫苗顯得極為重要。

目前，桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)Bac-to-Bac是桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中最常用的一種，具有高效、快速的特性，其表達(dá)的外源目的蛋白，可以在細(xì)胞內(nèi)完成翻譯后的修飾和加工，因此生物功能和天然的目的蛋白更為接近。筆者采用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)Bac-to-Bac，成功構(gòu)建并表達(dá)了O型FMDV衣殼蛋白的重組桿狀病毒，然后鑒定了所表達(dá)衣殼蛋白的抗原性，以期為研究基因工程亞單位疫苗奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病毒和細(xì)胞 質(zhì)粒pMD19-P12A3C為家畜疫病病原生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存；Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞為家畜疫病病原生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 質(zhì)粒、抗體及試劑 pFastBacDual載體、DH10BacTM感受態(tài)細(xì)胞、轉(zhuǎn)染試劑CellfectinII Reagent、細(xì)胞培養(yǎng)基Sf900-II SFM、PureLinkTM Hipure Plasmid Miniprep Kit、購(gòu)自Invitrogen公司；JM109感受態(tài)細(xì)胞、GXL高保真DNA聚合酶及DNA Marker等均購(gòu)自大連寶生物公司；T4 DNA連接酶、限制性核酸內(nèi)切酶Hind III、Spe I購(gòu)自美國(guó)NEB公司；切膠回收試劑盒、PCR清潔試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒，均購(gòu)自杭州愛(ài)思進(jìn)生物技術(shù)有限公司；FITC標(biāo)記羊抗兔IgG，購(gòu)自中杉金橋公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)家畜疫病病原生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存質(zhì)粒pMD19-P12A3C中基因序列設(shè)計(jì)1對(duì)擴(kuò)增P12A3C基因的特異性引物，上游引物P12A3CF：5′-CGCAAGCTTGCCACCATGGGCGCCGGGCAATCCA-3′和下游引物P12A3CR：5′-CGCACTAGTTCACTCGTGGTGTGGTTC-3′，下劃線(xiàn)分別為Hind III和Spe Ⅰ限制性?xún)?nèi)切酶酶切位點(diǎn)。M13通用引物為Invitrogen公司推薦的通用引物，引物由蘇州金唯智生物技術(shù)有限公司合成。

1.4 重組轉(zhuǎn)移載體pFastBacDual-P12A3C的構(gòu)建 以質(zhì)粒pMD19-P12A3C為模板，利用特異性引物P12A3CF和P12A3CR在GXL高保真DNA聚合酶作用下進(jìn)行PCR擴(kuò)增P12A3C基因，用限制性?xún)?nèi)切酶Spe I和Hind III分別將PCR產(chǎn)物P12A3C和供體質(zhì)粒pFastBacDual雙酶切后回收，然后用T4連接酶將P12A3C切膠回收產(chǎn)物與線(xiàn)性化的載體pFastBacDual連接，以使P12A3C定向插入到供體質(zhì)粒pFastBacDual。然后，轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)胞，利用α-互補(bǔ)篩選、酶切鑒定與PCR鑒定得到疑似陽(yáng)性克隆，命名為pFastBacDual-P12A3C，由蘇州金唯智生物技術(shù)有限公司對(duì)疑似陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序。

1.5 重組轉(zhuǎn)座子Bacmid-P12A3C的構(gòu)建 將重組轉(zhuǎn)移pFastBacDual-P12A3C轉(zhuǎn)化入DH10BacTM感受態(tài)細(xì)胞，然后利用四環(huán)霉素、慶大霉素、卡那霉素以及α-互補(bǔ)篩選出重組的轉(zhuǎn)座子Bacmid-P12A3C。同時(shí)，將無(wú)外源基因插入的供體質(zhì)粒pFastBacDual轉(zhuǎn)化DH10BacTM感受態(tài)細(xì)胞篩選出重組轉(zhuǎn)座子Bacmid-NC為陰性對(duì)照。用PureLinkTM Hipure Plasmid Miniprep Kit對(duì)重組轉(zhuǎn)座子進(jìn)行質(zhì)粒提取，采用通用引物M13F和M13R PCR鑒定外源基因的插入情況。

1.6 重組桿狀病毒rBac-P12A3C的構(gòu)建 在轉(zhuǎn)染試劑CellfectinII Reagent的介導(dǎo)下，將重組轉(zhuǎn)座子Bacmid-P12A3C和Bacmid-NC轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞，并作僅含CellfectinII Reagent的陰性對(duì)照，將細(xì)胞放置于28 ℃下培養(yǎng)并觀(guān)察。當(dāng)轉(zhuǎn)染的Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞出現(xiàn)病變時(shí)，收取病變的細(xì)胞培養(yǎng)上清，將收取的上清作為第1代的重組桿狀病毒rBac-P12A3C和rBac-NC。

1.7 間接免疫熒光（IFA）實(shí)驗(yàn)檢測(cè)目的蛋白表達(dá) 將重組的桿狀病毒rBac-P12A3C及rBac-NC接種Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞，細(xì)胞病變后，利用4%多聚甲醛固定，一抗為O型口蹄疫VP1多克隆抗體（1∶300），用FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1∶300）作為熒光二抗，進(jìn)行IFA試驗(yàn)檢測(cè)，置于熒光顯微鏡下觀(guān)察熒光產(chǎn)生情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 P12A3C基因的克隆及鑒定 以質(zhì)粒pMD19-P12A3C為模板，利用特異性引物P12A3CF和P12A3CR在GXL高保真DNA聚合酶作用下進(jìn)行PCR擴(kuò)增P12A3C基因得到大小約3 000 bp的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符（圖1）。

2.2 重組轉(zhuǎn)移載體pFastBacDual-P12A3C的構(gòu)建及鑒定 以重組轉(zhuǎn)移載體pFastBacDual-P12A3C為模板，利用特異性引物P12A3CF和P12A3CR在GXL高保真DNA聚合酶作用下進(jìn)行PCR擴(kuò)增P12A3C基因得到大小約3 000 bp的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符（圖2）；重組轉(zhuǎn)移載體pFastBacDual-P12A3C由限制性?xún)?nèi)切酶Spe I和Hind III雙酶切得到大小分別約5 238 bp 和約3 000 bp 的條帶，與預(yù)計(jì)條帶大小相符（圖3），說(shuō)明目的基因正確克隆入供體質(zhì)粒上。將疑似陽(yáng)性克隆質(zhì)粒，寄送至南京金斯瑞生物技術(shù)有限公司測(cè)序。結(jié)果表明，重組轉(zhuǎn)移載體pFastBacDual-P12A3C 攜帶正確的O型FMDV毒株空衣殼的蛋白編碼基因P12A3C，進(jìn)一步證明了包含完整的編碼口蹄病毒疫空衣殼蛋白表達(dá)基因P12A3C的重組轉(zhuǎn)移載體pFastBacDual-P12A3C構(gòu)建成功。

2.3 重組桿狀病毒轉(zhuǎn)座子Bacmid-P12A3C的構(gòu)建與鑒定 以重組轉(zhuǎn)座子Bacmid-P12A3C和Bacmid-NC為模板，采用通用引物M13F和M13R 進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到分別約5 560 bp和2 560 bp大小的條帶（圖4～5），說(shuō)明重組轉(zhuǎn)座子構(gòu)建成功。

2.4 重組桿狀病毒rBac-P12A3C的構(gòu)建 轉(zhuǎn)染后的Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞在28 ℃培養(yǎng)5 d后，出現(xiàn)細(xì)胞變大、脫落等明顯的細(xì)胞病變效應(yīng)（圖6），而陰性對(duì)照細(xì)胞未出現(xiàn)相應(yīng)的病變。收取病變的Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞培養(yǎng)上清為第1代的重組病毒rBac-P12A3C和rBac-NC。

2.5 IFA檢測(cè)外源基因的表達(dá) 重組桿狀病毒rBac-P12A3C和rBac-NC感染Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞3 d后，用O型FMDV VP1多克隆抗體進(jìn)行IFA檢測(cè)。結(jié)果表明，感染rBac-P12A3C的Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞，檢測(cè)到明顯的黃綠色熒光，而感染rBac-NC的Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞未檢測(cè)到特異性黃綠色熒光（圖7）。這表明重組桿狀病rBac-P12A3C中P123CA基因在Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)成功。

3 討論

FMD是全球范圍重點(diǎn)防控的動(dòng)物傳染病之一，該病的預(yù)防和控制主要以疫苗接種為主，同時(shí)結(jié)合撲殺病畜、隔離疑似病畜、定期消毒等綜合防控措施，但其對(duì)畜牧業(yè)的危害仍然不容忽視。研究FMDV衣殼蛋白的表達(dá)，然后以所表達(dá)

的以殼蛋白研制疫苗，是許多科學(xué)家關(guān)注的焦點(diǎn)。很多表達(dá)系統(tǒng)已經(jīng)被用于表達(dá)FMDV 空衣殼蛋白，但大都存在免疫原性不好、組裝效率不高以及成本高等缺點(diǎn)，生產(chǎn)的FMDV 空衣殼蛋白不足以用作FMDV亞單位疫苗的研制[6-7]。

Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)是通過(guò)轉(zhuǎn)座子原理構(gòu)建重組轉(zhuǎn)座子。該系統(tǒng)的轉(zhuǎn)座過(guò)程全部在大腸桿菌內(nèi)完成，重組轉(zhuǎn)座子可直接用于轉(zhuǎn)染，此系統(tǒng)還利用α-互補(bǔ)原理篩選重組轉(zhuǎn)座子，不會(huì)造成非重組型病毒和野生型病毒交叉污染。Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)作為真核表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)的外源目的蛋白在昆蟲(chóng)細(xì)胞中可以進(jìn)行翻譯后修飾以及加工，所得目的蛋白的生物學(xué)功能與天然的目的蛋白更接近[8]?；钶d體疫苗的研究也是FMD基因工程疫苗研究的熱點(diǎn)，此前有學(xué)者嘗試過(guò)用痘病毒[6]、大腸桿菌[9]、轉(zhuǎn)基因植物[10]、腺病毒載體[11]和畢赤酵母[12]等表達(dá)FMDV衣殼蛋白，但經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)是大規(guī)模生產(chǎn)表達(dá)FMDV空衣殼蛋白的最優(yōu)體系之一。曹軼梅等在Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中構(gòu)建并表達(dá)了Asia 1型FMDV 的P12A基因和3C蛋白酶基因，然后成功組裝了其空衣殼，并用以免疫豚鼠，產(chǎn)生了良好的免疫效果[13]。

該研究將O型FMDV的P12A3C基因克隆至桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFastBacDual中，并在大腸桿菌中進(jìn)行轉(zhuǎn)座重組，轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞后構(gòu)建了重組桿狀病毒rBac-P12A3C。經(jīng)IFA試驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，O 型FMDV P12A3C 基因在Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)成功，且具有良好的反應(yīng)原性。該研究為O型FMDV空衣殼蛋白的體外組裝及其基因工程亞單位疫苗的研究奠定了基礎(chǔ)。

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