王健勝 賀軍虎 陳華蕊 陳業(yè)淵

摘 ?要 ?利用RAPD分子標記對來自9個不同國家或區(qū)域47份菠蘿種質(zhì)的遺傳多樣性進行分析，結(jié)果表明，RAPD標記在菠蘿種質(zhì)中具有較好的多態(tài)性，引物多態(tài)性條帶百分比平均達到82.26%，引物的有效等位基因數(shù)（Ne）、Neis基因多樣性指數(shù)（H）、Shannons信息指數(shù)（I）和多態(tài)性信息含量（PIC）表現(xiàn)都較好，其平均值分別為1.46、0.26、0.39和0.24。基于RAPD分子檢測數(shù)據(jù)對菠蘿種質(zhì)進行聚類分析，在GS=0.66水平上，47份菠蘿種質(zhì)被劃分為4大類群。菠蘿種質(zhì)的主成分分析獲得了與聚類分析基本一致的結(jié)論。

關(guān)鍵詞 ?菠蘿;遺傳多樣性;RAPD標記

中圖分類號 ?S668.3 ? ? ? ? ?文獻標識碼 ?A

Genetic Diversity Analysis of Forty Seven Pineapple

[Ananas comosus（L.）Merr]Germplasm

with RAPD Marker

WANG Jiansheng2， HE Junhu1 *， CHEN Huarui1， CHEN Yeyuan1

1 Tropical Crops Genetic Resources Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Science， Danzhou， Hainan 571737， China

2 Pingdingshan University， Pingdingshan， Henan 467000， China

Abstract ?The genetic diversity of forty seven pineapple germplasm originated from nine countries/regions was analyzed using RAPD molecular markers. Results showed that RAPD had better polymorphsim in pineapple and the mean value for the percentage of polymorphism bands was 82.26%. RAPD primers had better performance on other genetic parameters as well， the mean value for effective number of allele， Neis gene diversity， Shannons information index and polymorphism information content was 1.46， 0.26， 0.39 and 0.24， respectively. Based on the genetic similarity coefficient between pineapple germplasm generated from RAPD markers， all the germplasms were clustered into four groups at the genetic similarity of 0.66. The similar results were also obtained by principal component analysis. All these results would provide an important scientific basis for breeding， preservation and effective utilization of pineapple in China.

Key words ?Pineapple; Genetic diversity; RAPD marker

doi ?10.3969/j.issn.1000-2561.2015.08.005

菠蘿[Ananas comosus（L.）Merr]屬鳳梨科鳳梨屬，是一種重要的多年生常綠草本植物，與香蕉、芒果、椰子并稱四大熱帶水果。菠蘿在中國也具有較長的種植歷史，其主要分布于臺灣、海南、廣西、云南等熱帶亞熱帶地區(qū)，據(jù)最新統(tǒng)計顯示，中國菠蘿種植面積在2013年已達到5.8×104 hm2（Faostat 2013），這也使中國成為世界上菠蘿的主要生產(chǎn)國之一。雖然如此，與其他菠蘿主要種植國相比，我國的菠蘿產(chǎn)業(yè)發(fā)展相對滯后，而加快菠蘿育種是提升菠蘿產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要工作。

種質(zhì)研究是菠蘿育種的重要基礎(chǔ)。雖然我國不是菠蘿的起源國，但經(jīng)過多年的有效引種，我國已保存了較為豐富的菠蘿種質(zhì)資源，因此，開展菠蘿種質(zhì)研究已顯得尤為重要。目前，菠蘿種質(zhì)研究中有關(guān)田間表型性狀的研究較多[1-5]，利用分子標記進行菠蘿種質(zhì)研究的報道較少。劉衛(wèi)國等[6]利用8對AFLP引物對39份菠蘿種質(zhì)作了研究，結(jié)果表明，菠蘿種質(zhì)間的遺傳關(guān)系較近，其遺傳相似系數(shù)為0.73～0.98，基于遺傳相似系數(shù)，39份菠蘿種質(zhì)被分為4類。竇美安等[7]利用SRAP標記研究了61份菠蘿種質(zhì)的遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)供試菠蘿品種的多態(tài)性比率都較低，其分布在47.32%～68.90%之間，菠蘿種質(zhì)之間遺傳差異也較小，其遺傳相似系數(shù)都在0.80以上，61份菠蘿種質(zhì)最終被劃分為5種類型。童和林等[8]利用菠蘿EST-SSR標記構(gòu)建了31份菠蘿種質(zhì)DNA指紋圖譜。陳香玲等[9]、張如蓮等[10]分別利用SCoT和ISSR對菠蘿種質(zhì)進行了分子鑒定及親緣關(guān)系分析。國外學者在相關(guān)方面也作了較好的研究[11-12]。

RAPD標記是一種較早開發(fā)的分子標記技術(shù)，由于其具有易擴增、多態(tài)性高、操作簡便、無種屬限制等優(yōu)點而被廣泛應(yīng)用于不同類型植物遺傳多樣性研究中，另外，由于菠蘿其他類型分子標記開發(fā)數(shù)量仍較少，因此，本研究采用RAPD分子標記技術(shù)對來自不同國家的47份菠蘿栽培種質(zhì)進行了遺傳多樣性分析，在初步掌握不同菠蘿種質(zhì)間親緣關(guān)系的同時，發(fā)現(xiàn)具有優(yōu)良變異的菠蘿種質(zhì)，為我國菠蘿種質(zhì)的科學鑒定、保護和高效利用提供一定的基礎(chǔ)。

1 ?材料與方法

本實驗于2013年在中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶作物品種資源研究所農(nóng)業(yè)部熱帶作物資源遺傳改良與創(chuàng)新重點實驗室完成。

1.1 ?材料

試驗所利用的47份菠蘿種質(zhì)材料來源于9個不同國家或區(qū)域（表1），主要包括中國臺灣、中國海南、巴西、日本、印度尼西亞、澳大利亞、泰國、哥斯達黎加、毛里求斯。試驗材料由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶作物品種資源研究所提供。

1.2 ?方法

1.2.1 ?DNA提取 ? 每份材料隨機選取10～15個單株幼嫩葉片等量混合，采用改良的SDS法[13]混合提取基因組總DNA，經(jīng)紫外分光光度計測定濃度后，稀釋至適合工作濃度，備用。

1.2.2 ?RAPD標記[12]檢測 ? PCR擴增反應(yīng)在Eppendorf PCR擴增儀上完成。PCR反應(yīng)總體積為20 μL，包括1.5 μL基因組DNA 40 ng，1.5 μL引物（20 mmol/L），2.0 μL 10×PCR緩沖液（含Mg2+），2.0 μL底物dNTPs（2.5 mmol/L），1.0 μL Taq酶（2 U/μL）和12 μL ddH2O。

RAPD-PCR擴增程序為：3個循環(huán)（94 ℃ 1 min，37 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min），37個循環(huán)（94 ℃ 30 s，37 ℃ 40 s，72 ℃ 2 min），最后72 ℃ 5 min。擴增產(chǎn)物用濃度為1.8%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，并在紫外凝膠成像系統(tǒng)上保存分析，同時為了保證實驗的準確性，每個RAPD反應(yīng)都需要重復3次以上。用于菠蘿RAPD分析的引物序列見表2。

1.3 ?數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析

以0、1、9統(tǒng)計RAPD擴增帶型，在相同遷移率位置上，有帶記為“1”，無帶記為“0”，缺失記為“9”，并建立分子數(shù)據(jù)矩陣。利用NTSYS-pc2.10[14]軟件通過非加權(quán)平均法（UPMGA）計算菠蘿種質(zhì)間的遺傳相似系數(shù)，并在此基礎(chǔ)上作聚類分析及主成分分析。采用POPGEN32軟件估算RAPD標記的主要遺傳多樣性參數(shù)，包括引物擴增總條帶數(shù)（TNB）、多態(tài)性條帶數(shù)（NPB）、多態(tài)性條帶百分比（PPB）、有效等位基因數(shù)（Ne）、Neis基因多樣性指數(shù)（H）、Shannons信息指數(shù)（I）和多態(tài)性信息含量（PIC）。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?菠蘿種質(zhì)RAPD多態(tài)性分析

從表3可以看出，不同RAPD引物在菠蘿基因組擴增中存在較大差異。單個引物擴增總條帶分布在43～227之間，平均為113.13，擴增多態(tài)性條帶分布范圍為68～140，平均為94，多態(tài)性條帶百分比分布在58.59%～100.00%之間，平均為82.26%，可見，RAPD引物在菠蘿基因組擴增中多態(tài)性表現(xiàn)較好。在其他參數(shù)方面，不同引物間的差異也比較明顯。有效等位基因數(shù)（Ne）分布范圍為1.03～1.66、Neis基因多樣性指數(shù)（H）變異范圍為0.02～0.41，Shannons信息指數(shù)（I）變化主要在0.06～0.59之間，其平均值分別為1.46、0.26和0.39。多態(tài)性信息含量（PIC）是評價引物的一個重要參數(shù)，從表3可以看出，RAPD引物的多態(tài)性信息含量差異較大，其變異范圍為0.07～0.38，平均為0.24。從引物所有參數(shù)的綜合分析來看，OPA4和OPU18表現(xiàn)相對最好，其在菠蘿遺傳多樣性檢測分析中效率最高。

2.2 ?不同菠蘿種質(zhì)親緣關(guān)系分析

基于RAPD分子檢測數(shù)據(jù)獲得了菠蘿種質(zhì)間的Neis遺傳相似系數(shù)，菠蘿種質(zhì)間遺傳相似系數(shù)的差異較大，其變化范圍為0.156～0.969，平均為0.716。在所有菠蘿種質(zhì)中，來自哥斯達黎加的MD2-2分別與來自中國臺灣的Creampine、來自日本的Bogoul間的遺傳相似系數(shù)最小，只有0.156，這說明MD2-2與Creampine、Bogoul的親緣關(guān)系最遠。另一方面，臺農(nóng)16-1與巴厘-1、巴厘-2與臺農(nóng)18間的遺傳相似系數(shù)最大，達到了0.969，這表明其親緣關(guān)系最近。從菠蘿種質(zhì)間的遺傳相似系數(shù)平均表現(xiàn)來看，我國菠蘿種質(zhì)的遺傳差異水平相對較高。

2.3 ?不同菠蘿種質(zhì)聚類分析

利用Neis遺傳相似系數(shù)對47份菠蘿種質(zhì)進行了聚類分析，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，在遺傳系數(shù)0.66處，47份菠蘿種質(zhì)可被劃分為4個類群，即類群Ⅰ、類群Ⅱ、類群Ⅲ和類群Ⅳ，其中第Ⅰ類群最大，共包括42份菠蘿種質(zhì)，占研究菠蘿種質(zhì)總數(shù)的89.36%。由于第Ⅰ類群包含的菠蘿種質(zhì)數(shù)量龐大，因此其又可被劃分為3個亞群，分別為Ⅰ-1亞群、Ⅰ-2亞群和Ⅰ-3亞群，其中第Ⅰ-1亞群包括的菠蘿種質(zhì)最多，達到了38個，而第Ⅰ-2亞群和Ⅰ-3亞群分別有1個和3個種質(zhì)。第Ⅱ類群共包括了2個菠蘿種質(zhì)，即來自日本的OK-2和來自巴西的Perola-2，第Ⅲ類群也由兩個菠蘿種質(zhì)組成，其分別是來自印度尼西亞的紅西班牙和來自中國臺灣的珍珠-2，與其他類群不同，第Ⅳ類群是由1個菠蘿種質(zhì)構(gòu)成的，即來自哥斯達黎加的MD2-2，這表明該種質(zhì)與其余菠蘿種質(zhì)的親緣關(guān)系相對最遠，可以看出，該聚類結(jié)果與上述親緣關(guān)系分析結(jié)果基本一致。

2.4 ?菠蘿種質(zhì)主成分分析

基于RAPD標記數(shù)據(jù)對47份菠蘿種質(zhì)作了主成分分析（圖2）。在主成分分析中，前3個主成分能解釋的總遺傳變異為41.77%。從圖2可看出，主成分分析獲得了與聚類分析基本一致的結(jié)果，聚類分析中被聚為同一類群的菠蘿種質(zhì)在主成分分析中也具有較近的物理距離，而物理位置的大小也直接反映了其親緣關(guān)系的遠近，可見，主成分分析在直接反映菠蘿種質(zhì)間親緣關(guān)系的同時，也在一定程度上印證了聚類分析結(jié)果的準確性。從圖2還可見，編號為30的MD2-2與其余菠蘿種質(zhì)間都具有較遠的物理位置，這表明MD2-2與其他菠蘿種質(zhì)間的親緣關(guān)系最遠，該結(jié)果與前述分析結(jié)果也基本一致。

3 ?討論與結(jié)論

目前，菠蘿品種在園藝學上的分類仍主要依據(jù)菠蘿在果實、葉片、植株性狀等方面的差異來進行，根據(jù)差異菠蘿品種主要被分為5大類，即無刺卡因類、皇后類、西班牙類、伯南布哥類、佩羅萊拉類。從本研究所獲得的菠蘿種質(zhì)資源親緣關(guān)系聚類圖上可以看出，該結(jié)果與現(xiàn)行的經(jīng)典分類結(jié)論既有一致的部分，也存在一定的差異，其主要原因可能是地區(qū)及國際間種質(zhì)頻繁交流而導致的同名異物、同物異名現(xiàn)象存在，造成了菠蘿品種名稱的混亂，而本研究對菠蘿品種的分類主要是依據(jù)其在分子水平的差異來進行。另外，本研究在研究材料中也加入了部分國內(nèi)近年來選育的菠蘿新品系，初步確定了部分國內(nèi)新品系與國外引進菠蘿品種間的親緣關(guān)系，在菠蘿新種質(zhì)中，“紅皮菠蘿”是近年來發(fā)現(xiàn)的一個新的菠蘿種質(zhì)，田間性狀初步評價認為，其顏色鮮艷、果肉細膩，可溶性固形物含量高（TSS=14.3），接近國際流行品種金菠蘿（TSS=14.5），聚類結(jié)果表明，“紅皮菠蘿”與國外引進品種“珍珠”間具有較近親緣關(guān)系（GS=0.937 5），這表明該種質(zhì)選育可能來自“珍珠”的基因突變株系或與“珍珠”具有遺傳關(guān)系相近的親本;新種質(zhì)“新品系-1”和“新品系-2”均與臺農(nóng)系列品種親緣關(guān)系較近，這說明它們的選育很可能來自臺農(nóng)系列品種。分子標記技術(shù)在菠蘿種質(zhì)鑒定和生物多樣性分析研究中具有很大的優(yōu)勢，相對傳統(tǒng)的形態(tài)學和生理生化指標分類鑒定，它具有不受取材部位、發(fā)育階段和環(huán)境因素影響的獨特優(yōu)勢，結(jié)果可靠，尤其是 RAPD技術(shù)，具有簡單、快速、不涉及同位素和多態(tài)性高等優(yōu)點，應(yīng)用更廣泛，其彌補了菠蘿傳統(tǒng)分類方法的不足，為菠蘿資源的收集、保存和科學利用提供了依據(jù)。

遺傳多樣性研究是菠蘿育種的重要基礎(chǔ)，通過對菠蘿種質(zhì)的遺傳多樣性分析，不僅可以較為準確的掌握不同菠蘿種質(zhì)的親緣關(guān)系，為菠蘿雜交育種中親本的選配提供重要科學依據(jù)，同時，也可以從已有菠蘿種質(zhì)中有效發(fā)現(xiàn)存在的優(yōu)良變異，為菠蘿育種提供豐富的優(yōu)異種質(zhì)材料。本研究利用RAPD分子標記技術(shù)對47份菠蘿種質(zhì)的遺傳多樣性進行了分析，結(jié)果表明，我國菠蘿種質(zhì)的遺傳多樣性水平較高，種質(zhì)間遺傳相似系數(shù)平均值達到了0.715 5，該結(jié)果與前人利用AFLP[6，15]、RFLP[11]、ISSR[10]和RAPD[12]等對菠蘿種質(zhì)的研究存在一定差異，這可能與本研究菠蘿種質(zhì)的來源較廣有關(guān)，這些菠蘿種質(zhì)來自世界上9個不同國家或地區(qū)，而地理位置的遠近對菠蘿遺傳多樣性具有較大影響。通過聚類分析和主成分分析，47份菠蘿種質(zhì)大致都可被劃分為4個類群，該結(jié)果也比較準確直觀的反映了不同菠蘿種質(zhì)間親緣關(guān)系的基本狀況。在47份菠蘿種質(zhì)中，MD2-2表現(xiàn)出了較大的遺傳變異，其與其他菠蘿種質(zhì)間親緣關(guān)系最遠，這表明MD2-2是菠蘿育種的良好材料，如果選用其作親本配制雜交組合將獲得較好的育種效果。臺農(nóng)16-1與巴厘-1雖然在植物學性狀上存在一定的差異，前者為無刺，后者為有刺，但在本研究中卻被聚為一類，且具有很高的遺傳相似系數(shù)（0.812 5），這可能與這兩個品種均來自同一父母本有關(guān)，這與竇美安等[7]的研究結(jié)果基本一致?！坝∧嵊写獭焙汀坝∧釤o刺”在植物學性狀上的差異主要是葉刺的有無，因此推測其可能來自同一菠蘿種質(zhì)在控制葉刺基因位點上的變異，本研究的分析結(jié)果較好的驗證了這一點，這兩個種質(zhì)的遺傳相似系數(shù)較高，達到0.875 0。由此可見，分子標記更能從本質(zhì)上揭示不同菠蘿種質(zhì)間的差異及親緣關(guān)系。菠蘿遺傳多樣性研究不僅在菠蘿育種中發(fā)揮著重要作用，其在菠蘿種質(zhì)的有效保存、分類和科學利用中也具有十分重要的功能。因此，本研究結(jié)果將為未來我國菠蘿種質(zhì)的深入研究和菠蘿高效育種提供一定的研究基礎(chǔ)。

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