金真 王康麗 梁佳惠 梁樹(shù)樂(lè)

摘要：為獲得高效的適合‘章姬草莓莖尖培養(yǎng)的技術(shù)方案，試驗(yàn)通過(guò)不同培養(yǎng)基和外源激素對(duì)‘章姬草莓莖尖培養(yǎng)的研究，建立其組培快繁體系，結(jié)果表明：在不同的處理中，最適宜的培養(yǎng)基和培養(yǎng)方式如下：（1）剝?nèi)〉那o尖越大，萌發(fā)率越高。（2）在改良White培養(yǎng)基配方+蔗糖40 g/L，pH 5.8的培養(yǎng)基培養(yǎng)下的莖尖成活率最高（80%）。（3）綜合增殖系數(shù)與增殖苗的品質(zhì)等多重因素獲得增殖培養(yǎng)適合培養(yǎng)基為MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.05mg/L+蔗糖30g/L，增殖系數(shù)為3.8。（4）生根培養(yǎng)基以1/2MS+蔗糖30g/L為宜。采用各項(xiàng)最適的方案進(jìn)行‘章姬草莓的培養(yǎng)，可以達(dá)到優(yōu)質(zhì)高效的目的。

關(guān)鍵詞：草莓；章姬；莖尖培養(yǎng)

中圖分類(lèi)號(hào)：S668.4 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 論文編號(hào)：2014-0643

0 引言

草莓是薔薇科（Rosoideae）草莓屬（Fragaria L.）多年生草本植物，果實(shí)酸甜可口，營(yíng)養(yǎng)豐富，是經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高的天然高檔食品，市場(chǎng)需求量極大，中國(guó)已成為栽培草莓最多的國(guó)家之一。草莓是靠匍匐莖進(jìn)行無(wú)性繁殖的作物，經(jīng)過(guò)幾代繁殖之后，容易感染多種病毒而患病。患病的草莓生長(zhǎng)緩慢、葉片皺縮、果實(shí)小而畸形、品質(zhì)變差，并且病情逐年加重。在國(guó)內(nèi)已造成損失的草莓病毒主要有草莓斑駁病毒（SMoV）、草莓輕型黃邊病毒（sMYEV）、草莓鑲脈病毒（SVBV）、草莓皺縮病毒（SCrV）等4種。草莓植株一旦感染病毒，通過(guò)常規(guī)的藥劑很難進(jìn)行防治，這極大地制約了草莓產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

由于國(guó)內(nèi)對(duì)草莓病毒病的研究起步較晚，關(guān)于草莓病毒病方面一些研究?jī)?nèi)容仍顯不足。目前草莓無(wú)病毒苗的培育方法，主要有熱處理法、花藥培養(yǎng)法和莖尖組織培養(yǎng)法等。其中莖尖培養(yǎng)不僅可以有效脫除病毒，而且可以快速繁殖、工廠化培育草莓苗，對(duì)草莓新品種的推廣起重要作用。近幾年來(lái)這一領(lǐng)域的研究已經(jīng)有較多報(bào)道，也建立了一些重要草莓品種的生產(chǎn)技術(shù)體系。不過(guò)，在草莓無(wú)病毒苗工廠化生產(chǎn)過(guò)程中，依然存在著增殖速度慢、培養(yǎng)進(jìn)程長(zhǎng)等缺陷。

為了取得較好的脫毒效果，在保證成活的前提下盡量切取較小的莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)，生長(zhǎng)點(diǎn)太小也增加培養(yǎng)的難度，所以微莖尖的啟動(dòng)培養(yǎng)是莖尖脫毒培養(yǎng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，文獻(xiàn)上也多有報(bào)道，但方法不一，培養(yǎng)基的外源激素的種類(lèi)及濃度差異較大。此外，微環(huán)境的控制對(duì)莖尖的培育也有很大的影響，Kozai等研究表明，改變組培微環(huán)境使其更接近自然條件，有利于移栽的試管苗加速馴化。

‘章姬草莓在國(guó)內(nèi)栽培面積大，據(jù)中國(guó)園藝協(xié)會(huì)草莓分會(huì)的統(tǒng)計(jì)顯示，2011年‘章姬在中國(guó)的栽培面積超過(guò)4300 hm²，位列主栽品種第7位。縮短周期從脫毒苗獲取的數(shù)量而言能達(dá)到成倍的增加，因此，探究草莓脫毒技術(shù)對(duì)草莓產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重大意義。試驗(yàn)以莖尖培養(yǎng)法為基礎(chǔ)，通過(guò)探究不同培養(yǎng)基及激素組合，以期得到高效的適合‘章姬草莓莖尖培養(yǎng)的技術(shù)方案。

1 材料與方法

供試材料采自中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)（煙臺(tái)）學(xué)?；?，選擇草莓品種‘章姬6—9月萌發(fā)的草莓匍匐莖作為試驗(yàn)材料，此階段匍匐莖要求生長(zhǎng)充實(shí)，小葉尚未展開(kāi)，剪取4～5 cm長(zhǎng)的匍匐莖頂部。

1.1 材料的滅菌消毒

先用洗潔精洗刷草莓匍匐莖表面污物及絨毛，再用流水沖洗30 min～1 h。在超凈操作臺(tái)上，將沖洗后的材料留匍匐莖2～3 cm長(zhǎng)，先后用75%酒精消毒30 s、用0.1%的升汞溶液消毒6～7 min，并分別用無(wú)菌水沖洗3～5次。

1.2 莖尖的剝離與培養(yǎng)

將消毒后的草莓匍匐莖用鑷子夾到經(jīng)過(guò)高壓滅菌的盛有濾紙的培養(yǎng)皿中，置于雙筒解剖鏡下，剝離幼葉，切取不同大小的莖尖，保留1～2個(gè)葉原基以提高莖尖的成活率。將切取后的莖尖立即置于莖尖啟動(dòng)培養(yǎng)基上，蔗糖30 g/L，經(jīng)121℃壓力滅菌15 min后置于溫度25℃，光照1500～2000 1x、日照時(shí)數(shù)16 h的培養(yǎng)條件下進(jìn)行啟動(dòng)培養(yǎng)。試驗(yàn)采用6組培養(yǎng)基，按GA、IBA、6-BA、NAA、IAA等激素進(jìn)行不同濃度的配比，維持培養(yǎng)基pH 5.8，并附加有蔗糖30～40 g/L，瓊脂6～7.5 g/L。培養(yǎng)基的組成分別如下：①M(fèi)S+6-BA 1.0 mg/L+IBA0.2 m/L+GA 0.5 mg/L+蔗糖30/L；②MS+6-BA0.5 m/L+NAA 0.05 mg/L+蔗糖30/L；③MS+6-BA1.0 mg/L+NAA 0.05 m/L+蔗糖30 g/L；④MS+6-BA1.0 m/L+GA 0.5 mg/L+蔗糖30 g/L；⑤改良White培養(yǎng)基+蔗糖40 g/L；⑥MS培養(yǎng)基+蔗糖30g/L。

1.3 增殖與生根培養(yǎng)

切取無(wú)根植株轉(zhuǎn)入以MS為基本培養(yǎng)基，增加不同生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素濃度，pH 5.8的培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)，每20天轉(zhuǎn)換1次培養(yǎng)基。

取增殖后生長(zhǎng)健壯的無(wú)根植株插入1/2 MS+蔗糖30 g/L，pH 5.8，瓊脂6～7.5/L的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，2周后上述無(wú)根植株100%生根，3周后，根系的長(zhǎng)度均≥2 cm，達(dá)到移栽對(duì)根系的要求。

1.4 試管苗的移栽

將根系長(zhǎng)度超過(guò)2 cm的植株，移栽于穴盤(pán)，基質(zhì)成分為德國(guó)大漢草炭土：珍珠巖=2：1，觀察其煉苗移栽情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 莖尖大小對(duì)成活率的影響

從草莓‘章姬品種的匍匐莖上分別剝?nèi)　?.2、0.2～0.4、≥0.4 mm大小的莖尖，采用啟動(dòng)培養(yǎng)基MS+GA0.5 mg/L+6-BA 1.0 mg/L+IBA 0.2 mg/L進(jìn)行莖尖的培養(yǎng)，2周后，莖尖生長(zhǎng)至1 mm，剝?nèi)∏o尖的大小直接影響莖尖的成活率，結(jié)果如表1。莖尖越大，成活率越高，反之，莖尖越小，成活率越低。在同樣的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，莖尖≤0.2 mm的成活率僅為20%，莖尖≥0.4mm的成活率達(dá)75%，莖尖0.2～0.4mm成活率為62.5%。通過(guò)SSR法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)后可以更直觀地得出，莖尖i>0.4 mm的成活率顯著高于莖尖0.2～0.4 mm的成活率，極顯著高于莖尖≤0.2 mm的成活率，而0.2～0.4 mm的莖尖成活率也極顯著高于≤0.2 mm莖尖的成活率。從脫毒的角度來(lái)看，在保證外植體成活的前提下，莖尖的生長(zhǎng)點(diǎn)應(yīng)越小越好。

根據(jù)激素對(duì)植物影響的不同，將有利于莖尖啟動(dòng)的各種激素進(jìn)行配比，探究最優(yōu)的啟動(dòng)培養(yǎng)基，從表2中可以得出，以⑤改良White培養(yǎng)基+蔗糖40g/L，pH 5.8，加入瓊脂6～6.5 g/L的培養(yǎng)基培養(yǎng)下的莖尖成活率最高，達(dá)80%，經(jīng)顯著性檢驗(yàn)后也可以得出應(yīng)用此培養(yǎng)基培養(yǎng)的莖尖成活率極顯著高于其他培養(yǎng)基。⑤培養(yǎng)基采用MS培養(yǎng)基中的有機(jī)物和鐵源配方，其他配方均采用原White培養(yǎng)基配方。⑤培養(yǎng)基中僅含激素IAA，且無(wú)機(jī)鹽濃度相對(duì)MS培養(yǎng)基較低，蔗糖濃度相對(duì)較高。①M(fèi)S+GA 0.5 mg/L+IBA 0.2 mg/L+6-BA 1.0 mg/L+蔗糖30g/L培養(yǎng)基的莖尖成活率僅次于⑤，達(dá)65%，顯著高于②培養(yǎng)基，極顯著高于其他培養(yǎng)基，與培養(yǎng)基④以及空白對(duì)照培養(yǎng)基⑥相比，可以得出，適宜濃度的激素IBA對(duì)莖尖的成活有促進(jìn)作用。培養(yǎng)基②莖尖成活率也比較高，達(dá)55%，極顯著高于其他培養(yǎng)基，與培養(yǎng)基③以及空白對(duì)照培養(yǎng)基⑥相比可得，在莖尖啟動(dòng)培養(yǎng)時(shí)，高濃度的6-BA在一定程度上對(duì)莖尖的成活產(chǎn)生了一定的抑制作用。已啟動(dòng)的莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)呈現(xiàn)鮮嫩的綠色，每4周更換1次新鮮培養(yǎng)基，培養(yǎng)基配方不變，3個(gè)月后，莖尖可生長(zhǎng)分化成直徑3～5 cm的芽叢。

2.2 增殖培養(yǎng)

采用表3的不同的培養(yǎng)基組合，觀察到在相同的低濃度的NAA條件下，隨著6-BA濃度的增加，增殖系數(shù)增大，但在①6-BA 2.0 mg/L、NAA 0.05 mg/L的培養(yǎng)下，出現(xiàn)玻璃化苗加重，畸形苗多，并且隨著繼代次數(shù)的增多，玻璃化苗有加重的趨勢(shì)。當(dāng)在②6-BA 1.0 mg/L、NAA0.05 mg/L時(shí)，幼苗的玻璃化現(xiàn)象有所減輕，只零星出現(xiàn)玻璃化苗。而在③MS+6-BA0.5 mg/L+NAA0.05 mg/L中，草莓苗生長(zhǎng)健壯，沒(méi)有玻璃化苗出現(xiàn)的情況，經(jīng)30天左右轉(zhuǎn)換1次新鮮培養(yǎng)基，增殖系數(shù)能達(dá)到3.8，也可以滿足生產(chǎn)的要求。

2.3 組培苗的生根培養(yǎng)

鄧群仙等采用不同的培養(yǎng)基配方進(jìn)行生根誘導(dǎo)后，得出最適生根培養(yǎng)基為1/2 MS+蔗糖30g/L和1/2 MS+IBA0.2 mg/L+蔗糖30g/L。試驗(yàn)對(duì)此2種培養(yǎng)基做進(jìn)一步的探究，2周后調(diào)查生根情況，試驗(yàn)結(jié)果（表4）表明，同樣作為根系誘導(dǎo)的高效配方，不添加激素的培養(yǎng)基①1/2 MS+蔗糖30 g/L對(duì)根系的誘導(dǎo)反而高于添加激素的培養(yǎng)基②1/2MS+IBA 0.2 mg/L+蔗糖30 gm，并且無(wú)激素苗根系生長(zhǎng)健壯。

2.4 試管苗的移栽

當(dāng)生根培養(yǎng)的植株根系長(zhǎng)到2 cm時(shí)，將瓶放到溫室中進(jìn)行1～2天煉苗，然后打開(kāi)瓶蓋，在瓶中加入少量清水，2天后洗凈根系培養(yǎng)基，移栽到基質(zhì)成分為德國(guó)大漢草炭土+珍珠巖（2：1）中，上方蓋塑料薄膜保濕，根據(jù)氣候及溫度情況加蓋遮蔭網(wǎng)，植株生長(zhǎng)健壯，成活率可達(dá)90%以上。

3 結(jié)論

研究表明，剝?nèi)∏o尖的大小對(duì)莖尖的成活率有明顯的影響，剝?nèi)〉那o尖越大，莖尖的成活率越高；培養(yǎng)基的激素配比對(duì)莖尖的成活也有很大的影響，在改良White培養(yǎng)基、蔗糖40 gm、pH 5.8的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)的莖尖，成活率高達(dá)80%，該配方對(duì)莖尖的誘導(dǎo)效果顯著優(yōu)于其他配方；試驗(yàn)研究表明，6-BA濃度對(duì)幼苗的增殖系數(shù)有很大的影響，在0.5-2.0mg/L范圍內(nèi)，隨著濃度的升高，增值系數(shù)增大，但高濃度高增殖系數(shù)條件下的幼苗玻璃化嚴(yán)重，品質(zhì)變劣，綜合增殖系數(shù)與增殖苗的品質(zhì)等多重因素獲得增殖培養(yǎng)適合的培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.05 mg/L+蔗糖30 g/L；生根培養(yǎng)基以1/2 MS+蔗糖30g/L為宜，在此條件下，根系生長(zhǎng)健壯，利于幼苗的生長(zhǎng)?？刹捎蒙鲜龈黜?xiàng)最適的方案進(jìn)行‘章姬草莓莖尖的優(yōu)化培養(yǎng)。

4 討論

4.1 外植體的滅菌與脫毒

在草莓莖尖培養(yǎng)過(guò)程中，表面消毒是組培成功的前提，嚴(yán)格控制75%酒精滅菌的時(shí)間，不要超過(guò)30 s，同時(shí)用0.1%升汞滅菌6～7 min，以達(dá)到最佳的滅菌效果。此滅菌方法與夏瑾等的研究結(jié)果相符。這樣既保證外植體的滅菌效果，也減少對(duì)材料的傷害，從而提高莖尖成活率，保證莖尖的質(zhì)量。

植物病毒在植物體內(nèi)主要沿著輸導(dǎo)組織蔓延發(fā)展，由于莖尖沒(méi)有導(dǎo)管和篩管的分化，頂端分生組織一般沒(méi)有病毒，離頂端越遠(yuǎn)，病毒侵入的可能性越大。取材過(guò)小，會(huì)增加剝離和培養(yǎng)的難度。何歡樂(lè)等試驗(yàn)所用的冷處理、熱處理與莖尖培養(yǎng)相結(jié)合的脫毒方法，獲得的試管苗脫毒率可達(dá)100%，但剝?nèi)〉那o尖都為0.5 mm大小，且溫度處理對(duì)莖尖均存在不同程度的傷害，較難控制。因而要保證莖尖免受逆境脅迫的前提下，試驗(yàn)中要可切取適當(dāng)大小的莖尖，以取材0.2～0.4mm為宜。

4.2 低鹽環(huán)境與莖尖的成活

雖然花藥和葉片作為外植體分化率也很高，董莉等利用葉片作為外植體誘導(dǎo)率達(dá)到了90%。但草莓莖尖培養(yǎng)不需要形成愈傷和再分化，培養(yǎng)時(shí)間較短，變異率低，是一條非常有價(jià)值的組織培養(yǎng)快繁途徑。本試驗(yàn)以‘章姬草莓莖尖為外植體，在初代培養(yǎng)基⑤的培養(yǎng)條件下，莖尖成活率高達(dá)80%。試驗(yàn)中所應(yīng)用的⑤培養(yǎng)基較之MS基本培養(yǎng)基而言，無(wú)機(jī)鹽濃度相對(duì)較低，其高成活率可能與低鹽環(huán)境有密不可分的關(guān)系，經(jīng)過(guò)試驗(yàn)觀察，筆者認(rèn)為低鹽環(huán)境可能對(duì)莖尖的滲透作用影響較小，有利于莖尖的誘導(dǎo)成活，在這方面前人未有提及。

4.3 幼苗玻璃化的規(guī)避

試管苗玻璃化現(xiàn)象是植物組織培養(yǎng)中普遍發(fā)生的特有的一種生理性病變，草本植物更易出現(xiàn)玻璃化。草莓屬于草本植物，在組織培養(yǎng)的過(guò)程中也常出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象，前人多是通過(guò)一些影響草莓組培苗玻璃化的單因子試驗(yàn)來(lái)研究草莓組培苗玻璃化的問(wèn)題。增加培養(yǎng)基中細(xì)胞分裂素6-BA的濃度，草毒試管苗的玻璃化率有明顯的提高，這與李海剛對(duì)牡丹和趙佐敏對(duì)非洲菊的研究相似。Kevers等認(rèn)為，玻璃化的發(fā)生較易受到培養(yǎng)基中的細(xì)胞分裂素的影響。因細(xì)胞分裂素而引起的玻璃化苗，往往具有蓮節(jié)短、分枝多等特點(diǎn)。這可能是因?yàn)榧?xì)胞分裂素促進(jìn)細(xì)胞的分裂，細(xì)胞大量生長(zhǎng)。此外，據(jù)Gaspar報(bào)道，大量的乙烯產(chǎn)生于石竹試管苗玻璃化過(guò)程中，乙烯在玻璃苗中的產(chǎn)生量在各個(gè)階段總是高于正常苗的乙烯產(chǎn)生量，但當(dāng)乙烯以及乙烯前體ACC在組培容器中的含量提高時(shí)不會(huì)誘導(dǎo)玻璃苗的產(chǎn)生，這表明可能不是因?yàn)橐蚁┑拇罅慨a(chǎn)生而誘發(fā)組培苗玻璃化的發(fā)生。因而，玻璃化現(xiàn)象的出現(xiàn)也可能與植物體多代培養(yǎng)時(shí)內(nèi)源激素的累積有關(guān)，內(nèi)源激素的累積導(dǎo)致植物生長(zhǎng)后期品質(zhì)變劣，營(yíng)養(yǎng)元素供應(yīng)不上，生長(zhǎng)勢(shì)弱，抵抗力差，從而表現(xiàn)出玻璃化。

在增殖培養(yǎng)中，研究發(fā)現(xiàn)，隨著繼代次數(shù)的增加，組培苗玻璃化程度加重。當(dāng)6-BA 2.0 mg/L時(shí)，增殖系數(shù)很高，但苗細(xì)、黃弱，玻璃化嚴(yán)重。6-BA濃度高而引起組培苗玻璃化并且褐化是草莓組培中較常出現(xiàn)又較難解決的問(wèn)題，往往易造成組培苗死亡率過(guò)高，性狀難以穩(wěn)定。為有效規(guī)避草莓幼苗玻璃化現(xiàn)象，研究表明，草莓繼代增殖的適宜培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.05 mg/L+蔗糖30 g/L，，這與牟彤等的研究結(jié)果相符。本試驗(yàn)在繼代培養(yǎng)時(shí)，通過(guò)減少細(xì)胞分裂素水平，逐步降低6-BA的濃度，或者轉(zhuǎn)接到MS空白培養(yǎng)基中過(guò)渡，再轉(zhuǎn)到含有低濃度細(xì)胞分裂素的培養(yǎng)基中，既保證了較高的增殖系數(shù)，又獲得了健壯的種苗為后期的移栽做準(zhǔn)備。

4.4 外源激素與生根培養(yǎng)

很多研究表明，添加激素有利于發(fā)根，但是本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，不添加激素的1/2MS+蔗糖30g/L培養(yǎng)基不僅能夠同樣滿足草莓苗生根的要求，而且根系粗壯，須狀根系少，有利于后期的移栽成活，同時(shí)也減少了幼苗因長(zhǎng)期的激素富集而引起的質(zhì)量下降；而添加激素的1/2 MS+IBA0.2 mg/L+蔗糖30 g/L培養(yǎng)基培養(yǎng)的幼苗，其根系細(xì)弱、密集，從試管苗的繼代與移栽成活的角度考慮是不利的。