摘要 介紹了小麥的品質(zhì)及品質(zhì)的形成、小麥的儲藏蛋白及儲藏蛋白的分類。綜述了近年來關于類燕麥儲藏蛋白Avenin-like基因發(fā)現(xiàn)、Avenin-like基因的胚乳特異性表達的時空表達模式以及Avenin-like基因的啟動子的作用元件和時空表達特異性研究。

關鍵詞：Avenin-like基因；胚乳特異性表達；啟動子

中圖分類號：S188 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2015）08-040-03

小麥的品質(zhì)主要包含營養(yǎng)品質(zhì)和加工品質(zhì)[1]。其中小麥的營養(yǎng)品質(zhì)主要是指所含的營養(yǎng)物質(zhì)對生物體營養(yǎng)需要的適合性和滿足程度，包括營養(yǎng)成分含量的多少和各種營養(yǎng)成分是否全面和均衡。小麥的加工品質(zhì)是指小麥籽粒對制粉以及制作不同食品的適應性和滿足程度，主要包括一次加工品質(zhì)即磨粉品質(zhì)和二次加工品質(zhì)即食品加工品質(zhì)。磨粉品質(zhì)是指籽粒在輾磨為面粉的過程中，品質(zhì)對磨粉工藝的滿足程度，主要包括籽粒容重、灰分、硬度、出粉率、面粉白度等。小麥的食品加工品質(zhì)包括烘烤和蒸煮后的質(zhì)量，烘烤品質(zhì)主要指出粉率、灰分、粉色、細度、沉降值、α-淀粉酶活性等指標，蒸煮品質(zhì)主要指吸水率、攪拌特性、面筋延伸性和抗延性[2]。物質(zhì)組成決定加工品質(zhì)，小麥加工品質(zhì)很大程度上取決于面團流變學特性，與小麥儲藏蛋白的組分關聯(lián)密切[3-8]。

面粉加水之后經(jīng)過攪拌后形成面團，其大致的分子機理為：谷蛋白亞基通過分子間二硫鍵交聯(lián)，然后形成纖維狀大分子聚合體，從宏觀上表現(xiàn)為彈性的形成。醇溶蛋白在分子內(nèi)在二硫鍵、氫鍵等的共同作用下形成球狀結(jié)構(gòu)，通過非共價鍵穿插在谷蛋白網(wǎng)絡構(gòu)架中，在宏觀上表現(xiàn)為面團具有延展性[9]。面團的彈性和黏性用面團的流變學特性來描述。

1924年，Osborne[10]根據(jù)種子中貯藏蛋白的溶解條件，將貯藏蛋白分為兩大類。其中第一大類為面筋蛋白，主要含有麥谷蛋白和麥醇溶蛋白。麥谷蛋白約占45%，可以溶于稀酸或稀堿，由17～20條多肽鏈構(gòu)成，呈纖維狀，水合時無黏性，彈性好，決定面團彈性。麥醇溶蛋白約占40%，醇溶性，由一條多肽鏈構(gòu)成，僅有分子內(nèi)二硫鍵和較緊密的三維結(jié)構(gòu)，呈球形，多由非極性氨基酸組成，富含谷氨酰胺和脯氨酸，故水合時黏性好，參與面團延展性[11]。第二大類主要為非面筋蛋白，主要包括清蛋白和球蛋白。清蛋白可溶于水或低濃度鹽溶液，約占蛋白總量的2.5%；球蛋白可溶于稀釋的鹽溶液中但不能溶于水，約占蛋白總量的5%。

1 類燕麥儲藏蛋白Avenin-like基因及蛋白的發(fā)現(xiàn)

1.1 類燕麥儲藏蛋白Avenin-like基因的發(fā)現(xiàn) 2001年，Anderson等[12]將小麥授粉后的種子與種子胚乳特異性EST進行雜交，其cDNA文庫是小麥授粉后5～30 d的種子cDNA文庫，發(fā)現(xiàn)了一類新的小麥胚乳特異性表達基因，然后BLAST對比分析，證明該小麥胚乳特異性表達的基因與燕麥Avenin儲藏蛋白基因相似度最高。

2004年，Li等[13]分別以小麥的胚、胚乳以及未授粉子房的RNA反轉(zhuǎn)錄的DNA為探針，與小麥授粉后12 d的種子cDNA文庫進行差異雜交，結(jié)果證明4個基因類似于燕麥Avenin蛋白編碼基因，并研究了這類小麥Avenin-like蛋白編碼基因在各個組織中的表達模式，進一步證明了該類基因只在胚乳中特異性表達。

2005年，Vensel等[14]通過質(zhì)譜技術以及雙向電泳技術，將小麥開花后10～36 d的胚乳中分離出的蛋白質(zhì)經(jīng)序列比較分析后發(fā)現(xiàn)了5個類似于燕麥的蛋白質(zhì)，通過研究證明該類蛋白質(zhì)是小麥新型種子儲藏蛋白。

2005年，Drea等[15]應用高通量原位雜交技術，檢測小麥胚乳發(fā)育早期基因表達模式，將檢測到種子發(fā)育期間有多個Avenin-like蛋白編碼基因在胚乳中特異性表達，這些表達產(chǎn)物被證明類似于小麥儲藏蛋白。

2005年Dupont等[16]從小麥種子胚乳中分離得到一個新型蛋白質(zhì)，然后通過試驗表明小麥胚乳中這類蛋白與燕麥Avenin蛋白相似度很高。

1.2 類燕麥儲藏蛋白Avenin-like蛋白的研究 2006年，Kan等[17]利用構(gòu)建的小麥和山羊草開花后14 d的種子cDNA文庫與小麥胚乳特異性表達的EST芯片雜交，結(jié)果顯示為陽性克隆，將陽性克隆的基因序列和推導的蛋白質(zhì)序列經(jīng)BLAST比較分析后，因這種基因與小麥儲藏蛋白基因Avenin同源性較高，故將這種基因命名為Avenin-like基因，將其相應的蛋白命名為Avenin-like蛋白。

依據(jù)Avenin-like蛋白的結(jié)構(gòu)差異，可以分為Avenin-like type a和Avenin-like type b 2種蛋白，分別含有約148和265個氨基酸殘基，分子量分別約為16 kDa和30 kDa[17]。已分離的小麥Avenin-like type a基因Avenin-like type b基因長度分別為450和855 bp。

2008年，陳鵬等[18-19]利用小麥及其近緣物種各種山羊草為研究材料，克隆得到了23個ALP type-b同源基因，然后利用半定量PCR技術及Western-blot雜交分析驗證，結(jié)果表明，該基因在胚乳中特異性表達。并證明這些Avenin-like蛋白存在典型的“半胱氨酸-半胱氨酸”，即“Cys-Cys”結(jié)構(gòu)域。陳鵬等[20-21]利用實時熒光定量即RT-PCR技術證明Avenin-like基因的時空表達模式，Avenin-like基因在根、莖、葉、花等其他組織中均無表達，但在胚乳中特異性表達。

2 類燕麥儲藏蛋白Avenin-like基因的啟動子研究

2.1 類燕麥儲藏蛋白Avenin-like基因啟動子的克隆和元件分析 基于類燕麥儲藏蛋白Avenin-like基因在胚乳中特異性表達的特性，2012年，宋斐等[22]對ALP type-B基因啟動子的克隆及其功能進行了研究。

采用實時熒光定量PCR即RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，ALP type-B基因在小麥胚乳中表達，但在根、莖、葉和花等其他組織中均無表達，表明ALP type-B基因的表達具有胚乳特異性。運用反向PCR技術，從小麥鄂恩1號中克隆得到ALP type-B基因的上游1.664 bp啟動子序列。應用PLACE和plantCARE等數(shù)據(jù)庫分析了該1.664 bp啟動子元件，發(fā)現(xiàn)該啟動子除具備啟動子的基本元件TATA-box、CAAT-box外，還含有胚乳特異性表達的元件，如GCN4元件、TGTAAAG元件、Skn-motif元件、AACA元件等[23]（圖1）。

基于對啟動子順式作用元件序列的生物信息學分析，為了進一步分析鑒定上述啟動子元件的作用，以載體pBI121為基本框架，構(gòu)建了包括ALP type-B基因上游1，664 bp序列及4個分別含有不同序列長度的5′端缺失啟動子序列999、785、550和290 bp在內(nèi)的5個雙元表達載體，并以其長度為基礎分別命名為載體pALP-17、pALP-10、pALP-8、pALP-6和pALP-3，表達載體的報告基因均是GUS基因（圖2）。

2.2 類燕麥儲藏蛋白Avenin-like基因啟動子的特異性表達分析 將上述5個pALP-17、pALP-10、pALP-8、pALP-6和pALP-3雙元表達載體轉(zhuǎn)化于煙草中，獲得了轉(zhuǎn)基因植株，其中轉(zhuǎn)化pALP-3、pALP-8和pALP-10表達載體的轉(zhuǎn)基因煙草陽性植株各5株，轉(zhuǎn)化pALP-6表達載體的轉(zhuǎn)基因煙草陽性植株4株，轉(zhuǎn)化pALP-17表達載體的轉(zhuǎn)基因煙草陽性植株19株。

對獲得的T0代陽性轉(zhuǎn)基因煙草植株進行GUS組織化學檢測，進行定性研究，其原理是報告基因GUS（β-葡聚糖苷酶）可將X-Gluc水解成藍色物質(zhì)，因此具有GUS活性的部位或位點呈現(xiàn)藍色或藍色斑點，可用肉眼或顯微鏡觀察到。證實ALP type-B基因啟動子可驅(qū)動報告基因在煙草胚乳中表達，但在煙草其他組織如根、莖、葉和花中并未檢測到報告基因GUS基因的表達。然后對轉(zhuǎn)基因煙草進行GUS熒光定量分析，其中轉(zhuǎn)化有pALP-3的種子GUS活性達到273.06 nmol/（mg蛋白·hr），這個值是陰性對照種子[14.25 nmol/（mg蛋白·hr）]的近20倍，說明prolamin-box元件可以保持啟動子驅(qū)動報告基因在胚乳中本底水平的表達；同時研究證明隨著啟動子序列長度的增加，至-785 bp啟動子驅(qū)動報告基因達到最高GUS活性即447.86 nmol/（mg蛋白·hr），推測ESP-like元件與RY motif元件可能共同作用構(gòu)成一個強胚乳特異性上調(diào)元件；而后則逐漸降低直至173.68 nmol/（mg蛋白·hr），由此推測在-785 bp啟動子上游和下游，分別有較強的下調(diào)和上調(diào)順式作用元件，而G-box并未發(fā)揮其遠端上調(diào)作用[22]。

3 需要進一步研究的工作

對各顯著啟動子元件進行缺失突變分析和點突變分析，并對含有潛在的顯著上調(diào)、下調(diào)順式作用元件的區(qū)段進行更加精細地截取并進行轉(zhuǎn)基因研究。

以轉(zhuǎn)基因小麥為材料，通過凝膠組織分析鑒定具有顯著上調(diào)、下調(diào)作用順式作用元件的特異結(jié)合蛋白，以期找到新的反式作用因子，為深入研究小麥胚乳特異性表達調(diào)控機制提供新方向。

通過基因槍法將pALP-17載體轉(zhuǎn)入小麥，進一步明確該小麥ALP type-B基因啟動子在禾本科植物中的表達特性，為該啟動子在基因工程中的應用奠定基礎。

參考文獻

[1] 何中虎，晏月明，莊巧生，等.中國小麥品種品質(zhì)評價體系建立與分子改良技術研究[J].中國農(nóng)業(yè)科學，2006，39（6）：1091-1101.

[2] 楊春玲，關立，侯軍紅，等.小麥品質(zhì)遺傳研究進展與品種選育[J].麥類作物學報，2007，11（3）：12-17.

[3] BELTON P S.On the elasticity of wheat gluten[J].Journal of Cereal Science，1999，29（2）：103-107.

[4] DOBRASZCZYK B J，MORGENSTERN M P.Rheology and the breadmaking process[J].Journal of Cereal Science，2003，38（3）：229-245.

[5] HEY R L.Effect of flour quality characteristics on puff pastry baking performance[J].Cereal Chem，1993，70：392-396.

[6] SHEWRY P R，NAPIER J A，TATHAM A S.Seed Storage Proteins：Structures and Biosunthesis[J].Plant Cell，1995，7（7）：945-956.

[7] PAYNE P I，CORFIELD K G，HOLT L M，et al.Correlations between the inheritance of certain high-molecular-weight subumits of glutenin and bread-making quality in progenies of six crosses of bread wheat[J].J Sci Food Agric，1981，32（1）：51-60.

[8] PAYNE P I.genetics of Wheat Storage Proteins and the Effect of Allelic Variation on Bread-Making Quality[J].Annual Reviews in Plant Physiology，1987，38（1）：141-153.

[9] SHEWRY P R，TATHAM A S.Disulphide Bonds in Wheat Gluten Proteins[J].Journal of Cereal Science，1997，25（3）：207-227.

[10] OSBORNE T B.The vegetable proteins[M].London：Longmans，Green and Company，1924：667-674.

[11] SHEWRY P R，HALFORD N G.Cereal seed storage proteins：structures，properties and role in grain utilization[J].Soc Experiment Biol，2002，53：947-958.

[12] ANDERSON O D，HSIA C C，ADALSTEINS A E，et al.Identification of several new classes of low-molecular-weight wheat gliadin-related proteins and genes[J].TAG Theoretical and Applied Genetics，2001，103（2）：307-315.

[13] LI J R，WANG F，ZHAO X Y，et al.Analysis of Seed-expressed Sequence Tags in Triticum aestivum[J].Acta Botanica Sinica，2004，46（3）：363-370.

[14] VENSEL W H，TANAKA C K，CAI N，et al.Developmental changes in the metabolic protein profiles of wheat endosperm[J].PROTEOMICS，2005，5（6）：1594-1611

[15] DREA S，LEADER D J，ARNOLD B C，et al.Systematic Spatial Analysis of Gene Expression during Wheat Caryopsis Development[J].The Plant Cell，2005，17（8）：2172-2178.

[16] DUPONT F M，CHAN R，LOPEZ R，et al.Sequential extraction and quantitative recovery of gliadins，glutenins，and other proteins from small samples of wheat flour[J].J Agric Food Chem，2005，53（5）：1575-1584.

[17] KAN Y，WAN Y，BEAUDOIN F，et al.Transciptome analysis reveals differentially expressed storage protein transcripts in seeds of Aegilops and wheat[J].Journal of Cereal Science，2006，44（1）：75-85.

[18] CHEN P，WANG C D，LI K X，et al.Cloning expression and characterization of novel avenin-like genes in wheat and related species[J].Journal of Cereal Science，2008，48（3）：734-740.

[19] 陳鵬.小麥及其近緣物種中新型儲藏蛋白基因avenin-like的克隆和功能研究[D].武漢：華中科技大學，2008.

[20] 陳鵬，汪長東，黃阜峰，等.擬斯卑爾脫山羊草基因的克隆與表達研究[J].生物技術通報，2008（5）：122-125.

[21] 陳鵬，李茹，金剛，等.三芒山羊草中新型儲藏蛋白基因avenin-like的克隆及分析[J].生物技術，2009，19（4）：1-3.

[22] 宋斐.胚乳特異性ALP type-B基因啟動子的克隆及其功能分析[D].武漢：華中科技大學，2012.

[23] 孫楊柳.小麥儲藏蛋白基因avenin-like b啟動子的表達特性研究[D].武漢：華中科技大學，2011.