劉雪紅，張秀芹，侯 穎，喬 穎，宋 平，馬曉建，季 磊，戚 驥

(1.大連市獸藥飼料監(jiān)察所，遼寧大連116037;2.遼寧省獸藥飼料監(jiān)察所，沈陽110000)

氨基糖苷類抗生素(aminoglycosides，AGs)，是由鏈霉菌或小單孢菌培養(yǎng)液中提取或以天然品為原料半合成制取而得的一類水溶性較強(qiáng)的堿性抗生素。具有靜止期殺菌作用，對(duì)革蘭氏陰性和陽性菌均有很好的抑殺作用，屬于廣譜抗生素［1］。由于高效和低價(jià)，其廣泛應(yīng)用于養(yǎng)殖業(yè)中，常被用在奶牛養(yǎng)殖過程中，用來治療奶牛的多種疾?。?］。氨基糖苷類抗生素在動(dòng)物性食品中的殘留對(duì)人體具有潛在危害，可引起聽力減退、耳鳴或耳部飽滿感等耳毒性反應(yīng)以及腎毒性反應(yīng)等。農(nóng)業(yè)部公告第235號(hào)［3］規(guī)定了氨基糖苷類抗生素在動(dòng)物源性食品中的限量要求。

目前，AGs藥物殘留的檢測(cè)方法主要有微生物法［4］、免疫分析法［5］、液相色譜法［6］及液相色譜 －串聯(lián)質(zhì)譜法［7－8］。微生物法檢測(cè)周期長，專屬性差;免疫分析法樣品前處理簡(jiǎn)單、檢測(cè)速度快，但容易產(chǎn)生假陽性或假陰性的結(jié)果;液相色譜法需要衍生化，操作較為繁瑣，穩(wěn)定性差。液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜法是應(yīng)用較廣泛的檢測(cè)此類抗生素的方法。AGs易溶于水，極性強(qiáng)，在C18柱上保留弱，文獻(xiàn)報(bào)道較多的是在流動(dòng)性中加入離子對(duì)試劑——七氟丁酸、五氟丙酸等［9］，增強(qiáng)其在柱上的保留。本文采用CORTECS HILIC色譜柱，甲酸銨溶液作流動(dòng)相，避免了離子對(duì)試劑、儀器的污染。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備 電子天平RD－200，德國 Sartorius公司;高速冷凍離心機(jī)Sigwa2K15，sigma公司;強(qiáng)力漩渦混和器REAX top，德國Heidolph;臺(tái)式酸度計(jì)FE 20，瑞士梅特勒;XEVO TQ－S ACQUITY UPLC超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜儀，配置電噴霧離子源，美國Waters公司;色譜柱ACQUITY CORTECS HILIC 100 mm×2.1 mm ×1.6 μm，Waters公司;固相萃取柱:WP CBX(500 mg/6mL)，J.T.Baker公司。

1.2 藥品與試劑

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品 鏈霉素批號(hào) CA16974900、含量99.0%，雙氫鏈霉素批號(hào)C12635300、含量99.0%，慶大霉素批號(hào)C14000200、含量94.4%，卡那霉素批號(hào)C14505520、含量90.0%，丁胺卡那霉素批號(hào)C10164000、含 量 90.0%，安 普 霉 素 批 號(hào)C10293000、含 量 81.5%，大 觀 霉 素 批 號(hào)C16972700、含量90.0%，均為德國 Dr.Ehrenstorfer公司產(chǎn)品。

1.2.2 試劑 乙腈、甲酸、甲醇為色譜純;水為符合GB/T 6682規(guī)定的一級(jí)水;乙酸、甲酸銨為優(yōu)級(jí)純;乙酸銨、鹽酸、乙二胺四乙酸二鈉、氯化鈉、三氯乙酸、氫氧化鈉為分析純。

乙酸銨緩沖液的濃度C乙酸銨=10 mmol/L:稱取0.77 g乙酸銨，加入900 mL水，用1 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH 為4.0，再加入0.15 g乙二胺四乙酸二鈉、5 g氯化鈉和20 g三氯乙酸，混勻，加水至刻度即得。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)貯備液的配制 準(zhǔn)確稱取鏈霉素、雙氫鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、丁胺卡那霉素、安普霉素、大觀霉素標(biāo)準(zhǔn)品各25 mg，以水定容至25 mL，混勻，即為1000 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)貯備液;4℃避光保存于塑料試管中，有效期為3個(gè)月 (AGs易與玻璃制品發(fā)生吸附，實(shí)驗(yàn)過程中盡量都使用塑料制品)。然后用70%乙腈溶液逐步稀釋成適當(dāng)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，保存于塑料試管中。

1.3 測(cè)定方法

1.3.1 樣品處理 稱取2 g(精確到0.01 g)均質(zhì)樣品，置于50 mL離心管中，加入10 mL乙酸銨緩沖液，渦旋振蕩提取，10000 r/min離心5 min，倒出上清液，5 mol/L 氫氧化鈉調(diào) pH 至7.5±0.5，混勻。用5 mL甲醇和5 mL水活化CBX柱(500 mg/6mL)，將提取液過柱，5 mL水淋洗，用3 mL 10%乙酸甲醇溶液洗脫，40℃氮?dú)獯蹈桑?0］。加入0.4 mL 70%乙腈溶液，充分渦旋混勻，過0.22 μm微孔濾膜，上機(jī)待測(cè)。

1.3.2 液相色譜條件 柱溫30℃，進(jìn)樣量5 μL，流動(dòng)相:A為200 mmol/L甲酸銨水溶液(pH 2.5)，B為150 mmol/L甲酸銨(乙腈∶甲醇∶水=60∶10∶30)溶液(pH 4.0);梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序表

1.3.3 質(zhì)譜條件 離子掃描方式:正離子，檢測(cè)方式:多反應(yīng)監(jiān)測(cè)，霧化器壓力0.7 MPa，干燥氣流量1000 L/h，干燥氣溫度550℃，毛細(xì)管電壓3000 V，定性、定量離子對(duì)和錐孔電壓及碰撞能量見表2所示。

表2 7種AGs藥物定性、定量離子對(duì)和錐孔電壓及碰撞能量表

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 精密量取2 μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)工作液 0.02、0.04、0.10、0.40、1.00 mL，分別添加到2 g空白牛奶中，按1.3.1項(xiàng)處理，得到濃度分別為0.1、0.2、0.5、2、5 μg/mL 的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 以特征離子質(zhì)量色譜峰面積為縱坐標(biāo)，基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(表3)。7種AGs藥物在0.1～5 μg/mL的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均在0.996以上(表3)。

2.2 檢測(cè)限和定量限 添加適量混合標(biāo)準(zhǔn)工作液于空白牛奶中，經(jīng)提取后測(cè)定。根據(jù)特征質(zhì)量色譜峰的信躁比S/N＞3為檢測(cè)限，信躁比S/N＞10為定量限，檢測(cè)到7種AGs藥物的檢測(cè)限為10 μg/kg，定量限為 20 μg/kg?？瞻着Ｄ讨刑砑?20 μg/kg的7種AGs藥物特征離子質(zhì)量色譜圖見圖1。

2.3 回收率及重復(fù)性試驗(yàn) 在空白牛奶中添加3個(gè)不同濃度(20、50、200 μg/kg)7 種 AGs藥物，進(jìn)行回收率試驗(yàn)，每個(gè)添加濃度做5個(gè)平行，連續(xù)測(cè)定3批，其平均回收率、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差見表4。從表中試驗(yàn)結(jié)果可以看出7種藥物的添加回收率在80%～117.5%之間，批內(nèi)批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于15%。

表3 7種AGs藥物的標(biāo)準(zhǔn)曲線及相關(guān)系數(shù)表

圖1 空白牛奶中添加20 μg/kg的7種AGs藥物特征離子質(zhì)量色譜圖

表4 7種AGs藥物回收率及重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果表 (n=5)

3 討論與小結(jié)

3.1 樣品處理?xiàng)l件的選擇 該類藥物溶于水，采用低pH緩沖液可有效提取，同時(shí)加入三氯乙酸除蛋白質(zhì)。已報(bào)道的固相萃取柱有羧基柱(CBX)、C18柱、親水親脂平衡柱(HLB)等，本方法采用CBX柱，達(dá)到了滿意的效果。

3.2 色譜條件的選擇 流動(dòng)相中添加改性劑，增加藥物在柱上的保留。甲酸銨水溶液－乙腈是HILIC常用的流動(dòng)相［11］，因此考察不同濃度甲酸銨溶液對(duì)色譜峰形的影響。最終確定200 mmol/L甲酸銨水溶液(pH 2.5)、150 mmol/L甲酸銨(乙腈∶甲醇∶水=60∶10∶30)溶液(pH 4.0)作為流動(dòng)相，同時(shí)優(yōu)化了梯度洗脫程序，得到了分離度以及對(duì)稱因子均較好的峰形。AGs藥物極性強(qiáng)，在C18柱上保留弱;親水作用色譜柱，可以有效的延長保留時(shí)間，同時(shí)HILIC色譜柱使用的高比例揮發(fā)性有機(jī)相亦有助于質(zhì)譜響應(yīng)值的提高。選擇ACQUITY UPLC BEH HILIC和ACQUITY CORTECS HILIC兩種色譜柱進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用 ACQUITY CORTECS HILIC色譜柱時(shí)，待測(cè)物的靈敏度和峰型都比較好。

3.3 基質(zhì)效應(yīng)研究 由于液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜存在基質(zhì)效應(yīng)［12－13］，而且乳品樣品基質(zhì)復(fù)雜，含有大量的內(nèi)源性化合物，因此對(duì)樣品基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行研究。比較3個(gè)不同條件下的信號(hào)峰面積:純的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，樣品基質(zhì)提取后添加，樣品基質(zhì)提取前添加。在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下，用空白樣品按1.3.1項(xiàng)方法制作空白基質(zhì)吹干后，加入一定量標(biāo)準(zhǔn)溶液，制成基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液;在空白樣品中加入一定量標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.3.1項(xiàng)方法制成基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液;與相應(yīng)濃度的純標(biāo)準(zhǔn)溶液比較。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，基質(zhì)效應(yīng)明顯，因此定量時(shí)采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3.4 進(jìn)樣溶液的選擇 選擇水、150 mmol/L甲酸銨70%乙腈溶液、70%乙腈為進(jìn)樣溶液。采用水為進(jìn)樣溶液時(shí)，卡那霉素、丁胺卡那霉素、大觀霉素峰展寬且峰形不對(duì)稱;采用150 mmol/L甲酸銨70%乙腈溶液時(shí)，上述藥物峰形對(duì)稱，但峰展寬;70%乙腈為進(jìn)樣溶液，峰形對(duì)稱而尖銳。最終確定70%乙腈作為進(jìn)樣溶液。

本方法確立的用超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，可同時(shí)檢測(cè)牛奶中7種AGs藥物殘留，滿足其限量要求。樣品處理簡(jiǎn)單，快速，檢測(cè)方法準(zhǔn)確、可靠。

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