張淑華 劉秋玲 吳志婷 王云霞 溫明華 葛郁芝

(江西省人民醫(yī)院 江西省心血管病研究所，江西 南昌 330006)

近年來發(fā)現(xiàn)，隨著心肌缺血、損傷、壞死和重構(gòu)，同一區(qū)域的心臟自主神經(jīng)，尤其是交感神經(jīng)也隨之發(fā)生一定程度的損傷、壞死和重構(gòu)〔1〕。對于心臟自主神經(jīng)的損傷壞死，目前還沒有找到有效的解決辦法。近年，利用RNAi研究干細(xì)胞的增殖與分化已有一些報(bào)道。Zeng等〔2〕使用miR-100靶向BMPR2調(diào)節(jié)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(ADMSCs)成骨分化。Yang等〔3〕發(fā)現(xiàn)miR-138能夠抑制 ADMSCs的脂肪分化。Uchida等〔4〕報(bào)道m(xù)iR-9調(diào)控神經(jīng)祖細(xì)胞的增殖與遷移。Doddapaneni等〔5〕過表達(dá)miR-122提高胎肝干細(xì)胞的肝細(xì)胞分化。為了探索人ADM-SCs(HADMSCs)向神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)分化的高效率誘導(dǎo)方法，又鑒于本實(shí)驗(yàn)室有shR-377誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向造血干細(xì)胞誘定分化的研究基礎(chǔ)，本文選擇了shR-377聯(lián)合細(xì)胞因子誘導(dǎo)HADMSCs向NSCs定向分化，以期提高HADMSCs向NSCs誘導(dǎo)分化的轉(zhuǎn)化率，縮短轉(zhuǎn)化時(shí)間，提高轉(zhuǎn)化質(zhì)量，為體外大量獲得NSCs提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 DMEM/F12，DMEM(Hyclone公司);胎牛血清(PAA公司);陽離子脂質(zhì)體lipofectamine2000及Opti-MEM(Invitrogen公司);胰酶、膠原酶、抗生素、DMSO(Gibco);成纖維母細(xì)胞生長因子(FGF)-b，表皮細(xì)胞生長因子(EGF)，胰島樣生長因子(IGF)-1，干細(xì)胞因子(SCF)均購自Miltenyi公司;骨形成蛋白(BMP)4購自invitrogen公司。shR-377載體(上海吉瑪生物制藥公司構(gòu)建);細(xì)胞培養(yǎng)箱(THERMOFORMA);實(shí)時(shí)定量PCR儀(ABI公司);流式細(xì)胞分析儀(BD公司)。

1.2 方法

1.2.1 HADMSCs分離培養(yǎng)及鑒定 成人脂肪取自吸脂手術(shù)患者(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院整形醫(yī)院)，與供者簽訂知情同意書，供者均為25～35歲的健康女性。吸脂術(shù)采集的脂肪組織用PBS(含100 U/ml青霉素與100μg/ml鏈霉素)反復(fù)清洗，洗去血細(xì)胞和麻醉藥，加入1∶1體積的0.2%Ⅰ型膠原酶37℃恒溫水浴鍋內(nèi)振蕩消化1 h，此時(shí)液面分為3層，上層為黃色油狀脂肪細(xì)胞層，中層為脂肪組織層，下層為含單個(gè)核細(xì)胞的膠原酶層，100目濾網(wǎng)過濾至50 ml離心管，離心1 400 r/min×10 min后棄上清，用PBS洗2遍以除去膠原酶，離心收集細(xì)胞。分離出的單個(gè)細(xì)胞以2×106/ml的密度接種于 HADMSCs培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。24 h首次換液，去除未貼壁細(xì)胞，以后每2～3 d換液一次。使用倒置顯微鏡觀察生長情況，對連續(xù)傳20代細(xì)胞的生長、增殖形態(tài)、有無分化進(jìn)行觀察、攝像。

1.2.2 HADMSCs的表型鑒定 胰酶消化HADMSCs并吹打?yàn)閱蝹€(gè)細(xì)胞，每個(gè)樣本的細(xì)胞數(shù)量至少為1×106/ml，分別與CD29-PE、CD45-FITC、CD44-PE、CD117-FITC 標(biāo)記的單克隆抗體室溫避光孵育30 min，流式緩沖液洗滌3次，F(xiàn)ACScalibur流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.3 shR-377聯(lián)合細(xì)胞因子誘導(dǎo)HADMSCs向NSCs定向分化 將已經(jīng)鋪好的6孔板中培養(yǎng)基換成Opti-MEM培養(yǎng)基，shR-377用Opti-MEM稀釋后，37℃孵育5 min加入6孔板，轉(zhuǎn)染6 h后換成誘導(dǎo)培養(yǎng)基。并設(shè)定熒光標(biāo)記shR-377的對照組，熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率。實(shí)驗(yàn)分為空白對照組、單轉(zhuǎn)shR-377組、單用細(xì)胞因子組，shR377+細(xì)胞因子組。轉(zhuǎn)染前培養(yǎng)基均為HADMSCs培養(yǎng)基，單轉(zhuǎn)shR-377組及shR377+細(xì)胞因子組轉(zhuǎn)染shR377，其余兩組未轉(zhuǎn)染;第一次轉(zhuǎn)染shR-377 8 h后，空白對照組、單轉(zhuǎn)shR-377組加入HADMSCs培養(yǎng)基，另外兩組加入誘導(dǎo)培養(yǎng)基A;第二次轉(zhuǎn)染shR-377 8 h后，空白對照組、單轉(zhuǎn)shR-377組仍加入HADMSCs培養(yǎng)基，另外兩組加入誘導(dǎo)培養(yǎng)基B。

誘導(dǎo)培養(yǎng)基 A:FGF-b、BMP4、B27、activinA;誘導(dǎo)培養(yǎng)基 B:IGF-1、EGF、SCF、FGF-b，于 37℃、5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)。從次日起在倒置顯微鏡下對HADMSC向NSCs誘導(dǎo)過程的細(xì)胞形態(tài)變化進(jìn)行觀察、攝像。

1.2.4 流式細(xì)胞檢測誘導(dǎo)后細(xì)胞nestin及轉(zhuǎn)化率 0.25%胰蛋白酶消化誘導(dǎo)后第1日細(xì)胞，用PBS反復(fù)洗滌后計(jì)數(shù)，制成單細(xì)胞懸液，每個(gè)樣本的細(xì)胞數(shù)量至少為1×106/ml，與nestin/FITC標(biāo)記的單克隆抗體室溫避光孵育30 min，流式緩沖液洗滌3次，流式細(xì)胞儀檢測。按流式分析所得nestin的陽性率為誘導(dǎo)分化的轉(zhuǎn)化率。

1.2.5 RT-qPCR檢測誘導(dǎo)后細(xì)胞nestin和musashi表達(dá) 收集誘導(dǎo)后24 h細(xì)胞，提取總RNA，按照試劑說明書，后續(xù)RT-qPCR。反應(yīng)參數(shù):第一步:95.0℃，30 s;第二步:95.0℃，5 s;60.0℃，34 s;第 3 步:95.0℃，15 s;60.0℃，1 min;95.0℃，15 s。

PCR引物使用primer5.0軟件設(shè)計(jì)，由上海生工生物工程有限公司合成，并經(jīng)HPLC純化。引物序列:GAPDH正義CCACCCATGGCAAATTCCATGGCA，反義 TCTAGACGGCAGGTCAGGTCCACC，長度598 bp;CD29正義 TCCAAGCAACCTGAGCAAC，反義 GATCTGAGTTCGCACCACTG，長度 238 bp;Nestin正義 AACAGCGACGGAGGTCTCTA，反義 TTCTCTTGTCCCGCAGACTT，長度220 bp;musashi正義 CCCACTACGAAACGCTCCAG，反義 TCGCAGATAACCCGCCTACA，長度193 bp。

1.2.6 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測誘導(dǎo)后細(xì)胞nestin 轉(zhuǎn)染后第3日細(xì)胞，添加4%的多聚甲醛(用 PBS溶液稀釋)，室溫固定15 min，漂洗三次，每次10 min，加入0.5%的Triton X-100室溫下浸泡10 min，37℃下用PBS溶液漂洗三次，每次10 min;用含1%BSA(牛血清白蛋白)的 PBS溶液(blocking buffer)封閉細(xì)胞，37℃下1.5 h(或者4℃過夜)。加帶熒光的一抗anti-nestin/FITC(用1%BSA稀釋)，4℃孵育2 h，熒光顯微鏡下觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件，計(jì)量資料用以x±s表示，多組間比較用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 HADMSCs形態(tài)學(xué)特征 倒置顯微鏡下觀察，細(xì)胞接種時(shí)，培養(yǎng)物中混有部分紅細(xì)胞，這些紅細(xì)胞隨換液次數(shù)的增多而被清除。培養(yǎng)的HADMSCs大部分于24 h內(nèi)即貼壁，貼壁細(xì)胞呈圓形，有小的胞質(zhì)突起。1 w后以梭形細(xì)胞為主，胞質(zhì)豐富，核大，核染色質(zhì)細(xì)，核仁明顯，可見細(xì)胞呈克隆樣生長。傳代細(xì)胞在12～24 h內(nèi)完全貼壁，并開始伸展、分裂。經(jīng)首次傳代以后，細(xì)胞生長速度增快，約3～4 d即可達(dá)80%融合。傳代后細(xì)胞呈長梭形，呈纖維樣細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞呈平行排列生長或漩渦狀生長，核居中，多數(shù)為1個(gè)核仁，以一點(diǎn)為中心向四周放射狀分布，圓形或卵圓形混雜生長細(xì)胞隨傳代次數(shù)減少。

2.2 HADMSCs細(xì)胞的表型鑒定 流式細(xì)胞儀測定了HADMSCs的表面標(biāo)志 CD29、CD44、CD45和 CD117，其中 CD45和CD117為陰性。而CD29和CD44為陽性。

2.3 shR-377轉(zhuǎn)染HADMSCs的轉(zhuǎn)染效果 倒置熒光顯微鏡下觀察，開啟熒光的暗視野下約95%的細(xì)胞都有熒光(圖1B)，與沒有開啟熒光的明視野(圖1A)對比鮮明。說明轉(zhuǎn)染率達(dá)到95%左右，可見所用的轉(zhuǎn)染試劑和轉(zhuǎn)染濃度是合適的。

圖1 shR-377轉(zhuǎn)染效果圖(×100)

2.4 HADMSCs向NSCs定向分化的形態(tài)變化 誘導(dǎo)后第1、3、7日在倒置顯微鏡下觀察、攝像:空白對照組(A)及單轉(zhuǎn)shR-377組(B)細(xì)胞形態(tài)未見明顯變化，只是細(xì)胞生長密度增大;單用細(xì)胞因子組(C)細(xì)胞形態(tài)未見明顯變化，可見部分細(xì)胞粘連聚集，少數(shù)細(xì)胞由原來的菱形、三角形變成長條形;shR-377+細(xì)胞因子組(D1):細(xì)胞轉(zhuǎn)染后第1天，細(xì)胞核見隆起;shR-377+細(xì)胞因子組(D3):轉(zhuǎn)染后第3天，細(xì)胞偽足變細(xì)成單極、雙極或多極，單極類似蝌蚪形，折光性增強(qiáng);shR-377+細(xì)胞因子組(D7):轉(zhuǎn)染后第7天，可見細(xì)胞聚集成細(xì)胞球，其余細(xì)胞也見聚集趨向。

圖2 HADMSCs向NSCs定向分化的形態(tài)變化

2.5 RT-qPCR檢測nestin和musashi的mRNA表達(dá) 空白對照組高表達(dá)CD29，幾乎不表達(dá)nesti和 musashi;單轉(zhuǎn)shR-377組較高表達(dá)CD29，低表達(dá)nestin和musashi;單用細(xì)胞因子組較高表達(dá)CD29，低表達(dá)nestin和musashi;shR-377+細(xì)胞因子組:中等表達(dá)CD29，高表達(dá)nestin和musashi。見圖3。

圖3 各組誘導(dǎo)后細(xì)胞的CD29、nestin、musashi表達(dá)水平

2.6 流式細(xì)胞儀檢測誘導(dǎo)后細(xì)胞nestin及轉(zhuǎn)化率 以HADMSCs為對照，誘導(dǎo)后NSCs的nestin陽性率為(64.6%±3.2%)，對照組為(0.6%±0.05%)。兩組nestin陽性率比較有顯著性差異(P＜0.01)。初步判斷誘導(dǎo)后細(xì)胞是神經(jīng)干細(xì)胞，其轉(zhuǎn)化率為64.6%±3.2%。

2.7 誘導(dǎo)后NSCs進(jìn)一步向神經(jīng)細(xì)胞分化形態(tài)觀察 把誘導(dǎo)后第7天神經(jīng)干樣球細(xì)胞進(jìn)一步分化，次日細(xì)胞明顯有細(xì)長突觸長出，向雙極或多極延伸，類似神經(jīng)元形態(tài)，見圖4。

圖4 由NSCs分化的NCs形態(tài)圖(×100)

3 討論

本實(shí)驗(yàn)分離培養(yǎng)HADMSCs有幾點(diǎn)改進(jìn):(1)分離中，消化細(xì)胞采用膠原酶沒有用胰酶。膠原酶比胰酶對細(xì)胞的損傷小很多，這樣使分離得到的HADMSCs具有更好的活性和增殖能力。(2)沒有使用NH4Cl裂解脂肪中摻雜的紅細(xì)胞，而利用紅細(xì)胞不貼壁的特性，通過換液去除紅細(xì)胞，這樣也避免了對HADMSCs的損傷。(3)我們使用含5%FBS、2 ng/ml FGF-b的DMEMF12培養(yǎng)基培養(yǎng)HADMSCs。與大多采用的10%FBS的方法或不加FGF-b的方法比較，細(xì)胞活力更好，也更不易分化。

目前對HADMSCs鑒定還沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，但普遍認(rèn)為，HADMSCs最主要的兩個(gè)表面標(biāo)志是CD29和CD44，我們使用流式細(xì)胞儀檢測HADMSCs表面標(biāo)志物，結(jié)果顯示表達(dá)CD29和CD44，不表達(dá) CD45和 CD117，HADMSCs分離培養(yǎng)成功與否，主要看細(xì)胞分離獲得率、細(xì)胞活力、細(xì)胞增殖能力和有無分化〔6〕。本實(shí)驗(yàn)改進(jìn)的分離培養(yǎng)方法，在這幾項(xiàng)上都有進(jìn)步，為體外無分化擴(kuò)增ADmSCs建立了一個(gè)很好的基礎(chǔ)。

ADMSCs在不同誘導(dǎo)條件下可以向軟骨、脂肪、心肌、平滑肌、肝、內(nèi)皮和造血細(xì)胞分化〔6，7〕。目前ADmSCs向神經(jīng)細(xì)胞的誘導(dǎo)均是在DMEM培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，應(yīng)用EGF或FGF-b等生長因子〔8〕，在高(20%)或低(2%)濃度的胎牛血清條件下，加入一些誘導(dǎo)的藥物，如β－巰基乙醇等誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞，無論是誘導(dǎo)效率還是存活時(shí)間都不能令人滿意。這就需要尋找新的誘導(dǎo)方法提高轉(zhuǎn)化效率，我們運(yùn)用shR-377聯(lián)合IGF-1、EGF、FGF-b、SCF、BMP4及activinA等細(xì)胞因子進(jìn)行篩選，重復(fù)性很好;從形態(tài)學(xué)來看，效果非常明顯，2次轉(zhuǎn)染后次日鏡下觀察，原來菱形、三角形等不規(guī)則形狀70%以上都發(fā)生明顯變化，細(xì)胞核隆起膨脹呈球形，細(xì)胞偽足收縮變細(xì)，向雙極或多極延伸。收集誘導(dǎo)后第一日的細(xì)胞使用流式細(xì)胞儀檢測nestin的表達(dá)與形態(tài)學(xué)變化基本吻合，而單轉(zhuǎn)shR-377和單用細(xì)胞因子的誘導(dǎo)效果都不明顯，可見shR-377和細(xì)胞因子的聯(lián)合是高效率誘導(dǎo)HADMSCs向NSCs分化的一個(gè)好的選擇。

本實(shí)驗(yàn)所用shR-377是一種短發(fā)夾結(jié)構(gòu)的核酸，源于人體蛋白編碼基因SH3PXD2B第一個(gè)內(nèi)含子部位，與外源短發(fā)夾核酸類似。該短發(fā)夾核酸的莖部兩條鏈完全互補(bǔ)，促進(jìn)干細(xì)胞分化的原理為shR-377抑制EIA樣的分化抑制因子(EID1)的表達(dá)，從而活化組蛋白乙?；窩BP/P300的表達(dá)。

1 Ji S，Gupta N，Weiss JN.The heart and its nerves:a nervous bond〔J〕．Heart Rhythm，2010;7(4):504-5.

2 Zeng Y，Qu X，Li H，et al.MicroRNA-100 regulates osteogenic differentiation of human adipose-derived mesenchymal stem cells by targeting BMPR2〔J〕．FEBSLett，2012;586(16):2375-81.

3 Yang Z，Bian C，Zhou H，et al.MicroRNA hsa-miR-138 inhibits adipogenic differentiation of human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells through adenovirus EID-1〔J〕．Stem Cells Dev，2011;20(2):259-67.

4 Uchida N.MicroRNA-9 controls a migratory mechanism in human neural progenitor cells〔J〕．Cell Stem Cell，2010;6(4):294-6.

5 Doddapaneni R，Chawla YK，Das A，et al.Overexpression of microRNA-122 enhances in vitro hepatic differentiation of fetal liver-derived stem/progenitor cells〔J〕．JCell Biochem，2013;114(7):1575-83.

6 Zhang HT，Liu ZL，Yao XQ，et al.Neural differentiation ability of mesenchymal stromal cells from bone marrow and adipose tissue:a comparative study〔J〕．Cytotherapy，2012;14(10):1203-14.

7 Zavan B，Vindigni V，Gardin C，et al.Neural potential of adipose stem cells〔J〕．Discov Med，2011;10(50):37-43.

8 Ferroni L，Gardin C，Tocco I，et al.Potential for neural differentiation of mesenchymal stem cells〔J〕．Adv Biochem Eng Biotechnol，2013;129:89-115.