張永勝

急性心肌梗死是臨床常見的心腦血管疾病之一，其發(fā)病率、致死率和致殘率高，已經(jīng)成為嚴(yán)重影響人類健康的公共疾病之一［1，2］。目前研究顯示心肌梗死產(chǎn)生的氧化應(yīng)激、負(fù)荷過重、缺血、缺氧、再灌損傷等可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，因此如何有效地抑制心肌細(xì)胞凋亡，對(duì)緩解和治療急性心肌梗死具有重要的意義［3］。Bax是Bcl－2家族中研究最為廣泛的促凋亡蛋白，其主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中，可形成同源二聚體或者與Bcl－2 形成異源二聚體而介導(dǎo)細(xì)胞凋亡［4，5］。近年來研究顯示在急性梗死心肌組織中Bax 蛋白的表達(dá)量明顯升高，提示其可能參與了急性心肌梗死心肌細(xì)胞的凋亡，加重了心肌功能的損傷［6］。RNA 干擾技術(shù)是近年來發(fā)展起來的基因操作技術(shù)，其可特異性的沉默相關(guān)基因的表達(dá)，對(duì)調(diào)節(jié)細(xì)胞生物學(xué)功能具有重要的意義［7］。本研究探討了RNA 干擾技術(shù)沉默Bax 基因?qū)毙孕募」Ｋ来笫笮募〗M織的保護(hù)作用，旨在為臨床治療急性心肌梗死提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 SD 大鼠（180g～200g）購(gòu)自上海萊斯克動(dòng)物有限公司；Bax一抗購(gòu)自美國(guó)Abcam 公司；HRP－羊抗鼠二抗購(gòu)自santa cruz公司；脂質(zhì)體和Triozol購(gòu)自Invitrogen公司；SYBR Green通用型qPCR Master Mix 購(gòu) 自 羅 氏 生 物；Real－time PCR 擴(kuò) 增 儀 購(gòu)自Applied Biosystems；逆轉(zhuǎn)率試劑盒購(gòu)自TAKARA公司；經(jīng)修飾的Bax－siRNA 由吉瑪生物合成；；TUNNEL試劑盒購(gòu)自羅氏生物；TTC 染液購(gòu)自南京森貝伽生物科技有限公司。

1.2 急性心肌梗死大鼠模型構(gòu)建及治療 45只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、心梗組和Bax干擾組。所有大鼠采用10%的水合氯醛麻醉，固定大鼠并打開胸腔，假手術(shù)組不做左冠狀動(dòng)脈前降支結(jié)扎。心梗組和Bax干擾組大鼠開胸后行左冠狀動(dòng)脈前降支結(jié)扎術(shù)。模型構(gòu)建成功標(biāo)志為：大鼠左心室前壁蒼白，多導(dǎo)生理記錄儀顯示大鼠心電標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián)，ST 段抬高和（或）T 波抬高。手術(shù)結(jié)束后所有大鼠關(guān)閉胸腔，手術(shù)切口注射青霉素抗感染。假手術(shù)組和心梗組在術(shù)前12h心肌組織內(nèi)注射100μL脂質(zhì)體，Bax干擾組大鼠術(shù)前心肌注射脂質(zhì)體與Bax siRNA 的混合物100μL。術(shù)后72h處死大鼠，取心肌組織進(jìn)行指標(biāo)分析。

1.3 大鼠心肌組織Bax mRNA 表達(dá)水平變化 大鼠心肌組織0.1g 加入1 mL riozol中勻漿，然后加入2 0 0μL三氯甲烷振蕩混勻，冰上靜置分層，1 2 0 0 0 r／min離心15min，上清加入等體積的異丙醇中，冰上放置30min使RNA 沉淀，然后12 000r／min離心15 min，棄上清，沉淀部分用預(yù)冷的75%乙醇溶液洗滌2次，8 000r／min離心10min，沉淀用DEPC 水處理的雙蒸水溶液中。分光光度儀測(cè)量RNA 濃度采用TAKARA 逆轉(zhuǎn)錄試劑轉(zhuǎn)錄成cDNA。

設(shè)計(jì)大鼠Bax的PCR 引物，引物序列如下：Bax－F：5′－GGCGATGAACTGGACAAC－3′；Bax－R：5′－CCGAAGTAGGAAAGGAGGC－3′。引物由上海英俊生物公司合成。對(duì)引物特異性和退火溫度進(jìn)行優(yōu)化。然后按照下述反應(yīng)體系制備反應(yīng)混合物：2×SYBR Green通用型qPCR Master Mix 10μL，上游／下游引物各（10μmmol／L）各1μL，cDNA 1μL，補(bǔ)雙蒸水至終體積為20μL。根據(jù)檢測(cè)樣本的數(shù)量配制相應(yīng)的體積，對(duì)應(yīng)加入PCR 板中，每孔20μL。1 500r／min離心將反應(yīng)混合物甩至管底，根據(jù)下列反應(yīng)條件進(jìn)行PCR：預(yù)變性：95 ℃，30s；變性：95 ℃，3s；退火延伸：60 ℃，30s；構(gòu)建溶解曲線。最后從實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀上直接讀取數(shù)據(jù)。

1.4 大鼠心肌組織Bax蛋白質(zhì)表達(dá)水平變化 大鼠心肌組織取出后用10%甲醛固定，石蠟包埋，切片，經(jīng)抗原修復(fù)后，切片用3%過氧化氫－甲醇液室溫處理20 min，清除內(nèi)源性的過氧化氫酶，PBST 洗滌3次，每次5min。用10%山羊血清37℃封閉30min，然后滴加一抗工作液4 ℃孵育過夜；次日37 ℃回溫30min后用PBST 洗滌3次，每次5min；在切片上滴加二抗工作液37℃孵育30 min，然后PBST 洗滌3 次，每次5 min；DAB 顯色，蘇木精復(fù)染，鹽酸酒精返藍(lán)。然后梯度脫水，中性膠封片。評(píng)定方法：每張切片隨機(jī)選取10個(gè)視野，放大400 倍，采用Motic Med 6.0 數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)對(duì)免疫組化進(jìn)行半定量分析。

1.5 大鼠心肌組織梗死范圍分析 大鼠心肌組織切成厚度2mm 的薄片，置于1%的TTC 磷酸緩沖液中37 ℃染色20min。理論上正常組織應(yīng)該為紅色，梗死組織為白色。然后再顯微鏡下將梗死組織與正常心肌組織分開，用分析天平稱取正常組織和梗死組織的濕重，梗死范圍為梗死組織重量占左心室總質(zhì)量的百分?jǐn)?shù)。

1.6 大鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù) 心肌組織切片經(jīng)抗原修復(fù)脫蠟后，PBST 洗滌3次，每次5min。此后步驟嚴(yán)格按照TUNEL試劑盒操作說明進(jìn)行操作。觀察時(shí)標(biāo)本放大400倍，隨機(jī)選取梗死區(qū)和周邊區(qū)域10個(gè)視野，計(jì)算凋亡細(xì)胞占總細(xì)胞的比例作為心肌細(xì)胞的凋亡指數(shù)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組計(jì)量資料采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD 法。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠心肌組織Bax mRNA 和蛋白質(zhì)水平變化（見圖1） 與假手術(shù)組比較，心梗組和Bax干擾組大鼠心肌組織中Bax mRNA和蛋白質(zhì)水平明顯升高（P＜0.05）。Bax干擾組大鼠心肌組織中Bax mRNA和蛋白質(zhì)水平較心梗組明顯下降（P＜0.05）。

圖1 各組大鼠心肌組織中Bax mRNA 和蛋白質(zhì)水平

2.2 大鼠心肌組織梗死范圍比較（見圖2） 采用TTC染色法分析了大鼠心肌梗死模型不同處理后大鼠心肌組織梗死范圍變化，心梗組和Bax干擾組大鼠心肌組織梗死范圍較假手術(shù)組明顯增加（P＜0.05）。而Bax干擾組大鼠心肌組織梗死范圍較心梗組明顯下降（P＜0.05）。

圖2 各組大鼠心肌組織梗死范圍比較

2.3 大鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)比較 大鼠心肌細(xì)胞的凋亡主要存在于梗死邊緣，而遠(yuǎn)離梗死區(qū)細(xì)胞凋亡水平較低。假手術(shù)組大鼠心肌凋亡指數(shù)僅為（3.54±1.02）%，而心梗組和Bax干擾組大鼠心肌細(xì)胞的凋亡指數(shù)分別為（51.32±7.02）%和（20.45±6.77）%。心梗組和Bax干擾組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯高于假手術(shù)組（P＜0.05）。Bax干擾組大鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯低于心梗阻（P＜0.05）。

3 討 論

急性心肌梗死發(fā)生后除了心肌壞死外，心肌細(xì)胞凋亡也是急性心肌梗死后心肌發(fā)生的另一重要的生物學(xué)過程，急性心肌梗死后心肌細(xì)胞凋亡主要位于缺血壞死邊緣，而遠(yuǎn)離梗死區(qū)心肌細(xì)胞凋亡較少［8］。這一結(jié)果與本研究相一致。心肌細(xì)胞凋亡可導(dǎo)致心肌細(xì)胞的大量丟失，進(jìn)一步增加心肌損傷，促進(jìn)了疾病的發(fā)展。因此有效的降低心肌細(xì)胞凋亡對(duì)降低急性心肌梗死患者疾病進(jìn)展，爭(zhēng)取更多的治療時(shí)間有著重要的意義。細(xì)胞凋亡是一個(gè)高度調(diào)控的過程，此過程受到諸多的細(xì)胞因子和調(diào)節(jié)蛋白的參與，其中Bax蛋白是細(xì)胞凋亡途徑中重要的分子。Bax蛋白是Bcl－2家族成員之一，其與Bcl－2 的比例直接決定著細(xì)胞的命運(yùn)。近年來，臨床研究顯示在急性心肌梗死后數(shù)小時(shí)內(nèi)，心肌組織中的Bcl－2表達(dá)量會(huì)有一定程度的增加，其可抑制心肌細(xì)胞的凋亡，起到保護(hù)心臟的作用，但是這種高表達(dá)只能短暫的，在疾病進(jìn)展數(shù)小時(shí)后，心肌細(xì)胞中Bcl－2蛋白很快消失，繼而出現(xiàn)Bax 蛋白的高表達(dá)，Bax蛋白高表達(dá)使細(xì)胞命運(yùn)趨于凋亡，其可通過與Bcl－2形成異源二聚體或者自身形成同源二聚體，介導(dǎo)細(xì)胞的凋亡，在急性心肌梗死組織中則而表現(xiàn)出心肌細(xì)胞大范圍凋亡［9，10］。因此有效的預(yù)防急性心肌梗死患者心肌組織中Bax蛋白的高水平表達(dá)可能對(duì)急性心肌梗死患者心肌組織具有一定的保護(hù)作用。RNA 干擾技術(shù)是利用雙鏈RNA 高效、特異性降解細(xì)胞內(nèi)同源信使RNA，從而阻斷特定基因表達(dá)，使細(xì)胞出現(xiàn)靶基因缺失的表型方法［11，12］。

本研究采用RNA 干擾技術(shù)沉默了急性心肌梗死大鼠心肌組織中的Bax，分析其在急性心肌梗死大鼠心肌保護(hù)中的作用。

本研究設(shè)計(jì)的并經(jīng)特殊修飾的Bax siRNA 可在體內(nèi)起到抑制Bax表達(dá)的作用，結(jié)果顯示，在經(jīng)Bax siRNA 處理后大鼠心肌組織中Bax mRNA 和蛋白質(zhì)水平較心梗組明顯下降。實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步分析了Bax沉默對(duì)急性心肌梗死大鼠心肌梗死范圍的影響，顯示經(jīng)Bax siRNA 處理的大鼠心肌梗死范圍較心梗組大鼠明顯下降，但是仍然高于假手術(shù)組，提示Bax沉默可降低急性心肌梗死大鼠心肌梗死范圍，起到保護(hù)心肌功能的作用。在心肌細(xì)胞凋亡方面，Bax siRNA 明顯降低了急性心肌梗死大鼠心肌細(xì)胞的凋亡，與心梗組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Bax基因沉默可顯著降低急性心肌梗死大鼠心肌組織的梗死范圍，同時(shí)降低心肌細(xì)胞的凋亡指數(shù)，對(duì)心臟功能具有一定的保護(hù)作用。

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