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        因傳染性胃腸炎死亡的轉(zhuǎn)基因克隆仔豬的臨床病理分析和初步分子鑒定

        2015-05-28 07:40:28趙雪艷趙科偉王小鵬王成斌何小芳邱青松程玉柱崔磊磊幸宇云

        趙雪艷,洪 淵,趙科偉,王小鵬,楊 強,王成斌,何小芳,邱青松,程玉柱,崔磊磊,任 軍,幸宇云

        (江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物生物技術(shù)國家重點實驗室培育基地,江西 南昌 330045)

        1997年,世界上第一頭體細(xì)胞克隆動物——“多莉”羊誕生[1],同年,首次通過體細(xì)胞克隆獲得的轉(zhuǎn)基因動物——轉(zhuǎn)人凝血因子IX基因的轉(zhuǎn)基因山羊問世[2]。此后以體細(xì)胞克隆介導(dǎo)的動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得了迅猛的發(fā)展[3],其中轉(zhuǎn)基因克隆豬的研究也收獲了諸多成果[4]。然而,克隆動物被認(rèn)為存在一定的缺陷,如臟器大小異常、健康狀況不良等[5];而針對轉(zhuǎn)基因生物安全性的爭論在全世界廣泛存在。

        動物臟器系數(shù)是指動物某臟器的質(zhì)量與其體質(zhì)量之比值,該指標(biāo)常用于毒理學(xué)實驗中,對評估動物組織形態(tài)學(xué)、臟器質(zhì)量、動物功能和健康狀況具有重要的參考價值[6-7]。因此研究轉(zhuǎn)基因克隆豬的臟器系數(shù)水平對評估其功能狀態(tài)及生物安全性具有重要的意義。迄今為止,有關(guān)轉(zhuǎn)基因或克隆動物臟器系數(shù)的研究報道有限。SüVEGOVá等的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因兔與非轉(zhuǎn)基因兔相比除肺外其余6個臟器系數(shù)均無顯著差異[8]。田小蕓的研究表明轉(zhuǎn)EGFP基因雄性和雌性小鼠的肺、腦、腎上腺系數(shù)差異極顯著(P<0.01),而心、肝、脾、腎臟系數(shù)間差異不顯著(P>0.05)[9]。Piedrahita 等報道克隆豬與非克隆豬相比其部分器官的重量存在更大的表型變異,并認(rèn)為這很可能是源于表觀遺傳的異常[10]。目前未見有關(guān)轉(zhuǎn)基因克隆豬臟器系數(shù)的報道。

        此外,在獲得轉(zhuǎn)基因動物之后,對其進(jìn)行系統(tǒng)的分子鑒定是首當(dāng)其沖的任務(wù),這些鑒定包括DNA水平的PCR鑒定和外源基因拷貝數(shù)檢測、RNA和蛋白質(zhì)水平的外源基因表達(dá)水平鑒定等。而在DNA水平上對轉(zhuǎn)基因動物的分子檢測是最基本、最初步的檢測,也是后續(xù)表型研究和基因功能探討的前提。

        骨形態(tài)發(fā)生蛋白IB(BMPR-IB)基因是在羊中首次被鑒定的影響多羔性狀的主效基因,其A746G突變位點被發(fā)現(xiàn)會顯著影響布魯拉美利奴綿羊的排卵率[11]。然而到目前為止,在哺乳動物中,該突變位點僅在綿羊和山羊中被發(fā)現(xiàn)[12-13]。在前期研究中,我們先構(gòu)建了pEF-BMPRIB(CDS)-Neo載體(圖1),其中的CDS區(qū)人為地導(dǎo)入了羊BMPR-IB基因的A746G多羔突變位點;之后通過脂質(zhì)體法將pEFBMPRIB(CDS)-Neo載體轉(zhuǎn)染入大白豬胎兒成纖維細(xì)胞中、經(jīng)G418篩選后挑選單克隆細(xì)胞系、利用傳統(tǒng)體細(xì)胞克隆方法制備轉(zhuǎn)基因克隆豬[14],最終成功獲得了一批轉(zhuǎn)基因克隆豬,其中6頭仔公豬因傳染性胃腸炎在出生后9 d左右死亡。本研究記錄了這些仔豬的臨床癥狀,進(jìn)行了解剖病理分析,測定了其多個部位的臟器系數(shù),并開展了陽性鑒定、外源載體的完整性和拷貝數(shù)檢測,以期對該批轉(zhuǎn)基因克隆小豬的生物安全性和外源基因整合情況進(jìn)行一個初步的評估。

        1 材料與方法

        1.1 實驗材料

        6頭因病死亡的轉(zhuǎn)BMPR-IB基因克隆仔公豬,供體為美系大白豬,死亡原因經(jīng)實驗室檢測診斷為傳染性胃腸炎,均為斷奶前死亡,平均死亡日齡為9 d;純種大白仔豬6頭均為美系大白公豬,為分娩過程中因窒息或疫苗應(yīng)激導(dǎo)致死亡的0~5日齡小豬。

        1.2 實驗方法

        1.2.1 因腹瀉死亡仔豬的病理觀察和臟器系數(shù)分析 體細(xì)胞克隆轉(zhuǎn)基因小豬出生后由專人24 h輪流護(hù)理,詳細(xì)記錄發(fā)病個體的發(fā)病癥狀。死亡后的小豬即刻進(jìn)行體質(zhì)量稱量、解剖、臟器取樣和稱質(zhì)量,如若未及時解剖先放入-20℃冰箱保存。解剖時先固定取背臥位,用手術(shù)刀打開胸腔和腹腔,分別取出心臟、肺、胃、肝臟、脾、左腎、右腎器官,將胃里的內(nèi)容物清理干凈,對心臟、肺、肝臟、脾、腎臟等器官剔除筋膜和脂肪并將表面的血液或其它液體成分用濾紙吸干;用手術(shù)剪和手術(shù)刀配合打開頭部以取得大腦。用電子秤分別稱量這些器官的質(zhì)量。對于死亡的轉(zhuǎn)基因克隆仔豬,解剖后觀察其臟器病理特癥并對典型癥狀拍照。

        普通純種大白仔豬也以同樣的方法解剖,稱取器官質(zhì)量。

        臟器系數(shù)的計算方法為:臟器系數(shù)=實驗動物某臟器的質(zhì)量(kg)/實驗動物的體質(zhì)量(kg),臟器系數(shù)結(jié)果均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SE)的形式表示,采用SAS軟件的T-Test進(jìn)行統(tǒng)計分析。

        1.2.2 PCR鑒定 采集轉(zhuǎn)基因仔豬耳組織樣品,用酚氯仿法提取豬基因組 DNA,用 Nanodrop 1000測量DNA濃度后,將其調(diào)成40~60 ng/μL的工作液。利用Primer 3在線軟件(http://frodo.wi.mit.edu/),跨外源載體序列的不同區(qū)域設(shè)計5對引物,引物位置見圖1,引物序列和PCR擴(kuò)增退火溫度見表1。

        圖1 外源載體pEF-BMPRIB(CDS)-Neo結(jié)構(gòu)圖及PCR鑒定引物設(shè)計Fig.1 The diagram of exogenous pEF-BMPRIB(CDS)-Neo vector and primers design for PCR detection

        表1 轉(zhuǎn)基因仔豬PCR鑒定引物Tab.1 Primers used for PCR detection of tansgenic piglets

        1.2.3 構(gòu)建GAPDH-NEO雙基因同質(zhì)粒載體 利用Primer 3軟件,根據(jù)GAPDH、NEO的基因序列,設(shè)計特異性引物NEO-FP/RP和GAPDH-FP/RP進(jìn)行PCR反應(yīng)。然后以2種基因PCR產(chǎn)物1∶1混合物為模板,以擴(kuò)增GAPDH基因的前引GAPDH-FP和擴(kuò)增NEO基因的后引NEO-RP分別為前后引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,從而將GAPDH基因和NEO基因橋連。PCR擴(kuò)增均采用25μL體系,10×buffer(含20μmol/Lmg2+)2.5 μL,10 mmol/L dNTP 0.5 μL,10 μmol/L 上、下游引物各1 μL,模板 DNA(40 ~60 ng/μL)2 μL,用超純水補齊體系。PCR擴(kuò)增均利用Touchdown程序:94℃ 5 min;94℃ 30 s,68℃ 30 s每個循環(huán)降低0.5 ℃,72℃ 1min,循環(huán)26次;94℃ 30 s,55℃ 30 s,72℃ 1min,循環(huán)14次;72℃ 10min;4℃保存。

        表2 構(gòu)建GAPDH-NEO雙基因同質(zhì)粒載體及檢測拷貝數(shù)所用的引物和探針Tab.2 Primers and probes used for producing a p lasm id vector containing GAPDH-NEO gene and detecting copy numbers

        PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳,將片段大小在907 bp的PCR產(chǎn)物割膠,使用PCR clean-up Gel extraction試劑盒(MACHEREY-NAGEL)進(jìn)行DNA的回收純化?;厥蘸蟮漠a(chǎn)物與pGEM-T載體(Promega)進(jìn)行TA連接,反應(yīng)條件為16℃,2 h。將連接后的重組子轉(zhuǎn)入Trans-5α感受態(tài)細(xì)胞,而后加入LB培養(yǎng)基擴(kuò)繁感受態(tài),將擴(kuò)繁后的菌液均勻涂布于已加入IPTG、X-Gal和氨芐的固體培養(yǎng)基上進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。挑選白斑菌落,移種在LA液體培養(yǎng)基中,經(jīng)擴(kuò)繁后取少量菌液,再以GAPDH-FP和NEO-RP為擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR反應(yīng)以證明菌落中含有目的片段GAPDH-NEO,反應(yīng)體系和反應(yīng)條件同1.2.3。另將PCR產(chǎn)物測序,以確定雙基因質(zhì)粒中GAPDH和NEO基因皆為單拷貝。經(jīng)測序驗證后,菌液用高純度質(zhì)粒小提中量試劑盒(TIANGEN)提取質(zhì)粒。

        1.2.4 Real Time PCR鑒定NEO基因拷貝數(shù) NEO基因拷貝數(shù)的鑒定采用絕對定量的方法。先將得到的GAPDH-NEO雙基因同質(zhì)粒載體用Nanodrop 1000測其濃度,并稀釋其濃度至0.08 ng/μL。以此濃度為起始濃度,以10倍間距依次級聯(lián)稀釋5個梯度作為標(biāo)曲樣品。以稀釋后的標(biāo)曲樣品和待測轉(zhuǎn)基因豬基因組DNA樣品為模板擴(kuò)增目的基因NEO和內(nèi)參基因GAPDH,每個基因均做3次重復(fù)。利用premix EX TaqTM試劑盒(Takara)配制熒光定量PCR反應(yīng)體系,反應(yīng)采用20μL體系:DNA 1μL,Premix Ex TaqTM10 μL,10 μmol/L 正、反向引物各0.4 μL,探針 0.2 μL(表2),ROX II 0.4 μL,ddH2O 7.6 μL。上樣于ABI 7500 fast定量PCR儀。反應(yīng)程序為:50℃ 2 min;95℃ 10 min;94℃ 15 s,60℃ 1 min,循環(huán)40次。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 死亡的轉(zhuǎn)基因克隆仔豬臨床癥狀及病理特征分析

        該批仔豬發(fā)病時表現(xiàn)出集中爆發(fā)、死亡快等特點,發(fā)病仔豬均在表現(xiàn)腹瀉后的1~3 d內(nèi)死亡,其臨床癥狀及病理解剖特征見表3。所有發(fā)病死亡的小豬均表現(xiàn)出腹瀉及大便異常(糞便為乳白色、灰色或黃綠色),其中3頭除此外還伴有發(fā)燒和咳嗽中的1~2個癥狀。病理解剖后發(fā)現(xiàn),所有因腹瀉死亡的仔豬均表現(xiàn)出小腸腫脹和胃部充有凝乳(圖2),另有1頭表現(xiàn)出小腸充血,除此外無其它明顯眼觀病變。

        表3 轉(zhuǎn)基因克隆死亡仔豬的臨床癥狀和病理解剖特征Tab.3 Clinic and pathological anatom y sym ptom s of cloned transgenic died piglets

        2.2 臟器系數(shù)分析

        轉(zhuǎn)基因克隆大白仔公豬和非轉(zhuǎn)基因大白仔公豬之間臟器系數(shù)的比較結(jié)果見表4,除左腎和右腎系數(shù)存在顯著差異(P<0.05)外,其它臟器系數(shù)均沒有差異(P>0.05)。但是轉(zhuǎn)基因克隆仔豬的臟器系數(shù)表現(xiàn)出了較高的變異系數(shù)。

        2.3 轉(zhuǎn)基因克隆仔豬的PCR鑒定

        為全面分析外源基因?qū)胨拗髦械那闆r,本試驗設(shè)計了5對跨載體序列不同區(qū)域的引物用于PCR擴(kuò)增(圖1,表1)。其中跨載體起始端到終止子區(qū)以及跨起始端到啟動子區(qū)的兩個長距離 PCR(Long-PCR),針對該6頭轉(zhuǎn)基因小豬均無任何擴(kuò)增條帶,說明外源基因序列部分或全部丟失(3A,3B);跨載體序列起始端到啟動子區(qū)域前的PCR針對2、4、5個體有擴(kuò)增結(jié)果,且片段大小與質(zhì)粒的擴(kuò)增片段一致(3C);擴(kuò)增包含報告基因NEO的PCR顯示所有的個體都有擴(kuò)增結(jié)果且片段大小與陽性對照一致(3D);而跨外源載體關(guān)鍵區(qū)域—啟動子和CDS區(qū)的PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示只有1和5號個體有擴(kuò)增結(jié)果(3E)。PCR鑒定結(jié)果表明雖然所有的6頭克隆小豬均為轉(zhuǎn)基因陽性個體,但沒有1頭小豬導(dǎo)入了完整的外源基因,其中4頭個體部分或完整缺失了關(guān)鍵的啟動子和CDS區(qū)。

        圖2 因腹瀉死亡的轉(zhuǎn)基因克隆仔豬的腸道Fig.2 Intestine of cloned transgenic piglets died of diarrhea

        表4 轉(zhuǎn)基因克隆豬與非轉(zhuǎn)基因豬臟器系數(shù)的比較Tab.4 Com parison of organ coefficients between cloned transgenic and non-transgenic piglets

        圖3 死亡的轉(zhuǎn)基因克隆仔豬陽性鑒定Fig.3 PCR detection of dead cloned trasgenic piglets

        2.4 轉(zhuǎn)基因仔豬拷貝數(shù)鑒定

        以構(gòu)建的GAPDH-NEO雙基因同質(zhì)粒載體做為標(biāo)曲擴(kuò)增模板分別擴(kuò)增NEO和GAPDH基因,獲得了GAPDH和NEO基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖4A),2條曲線的R2值分別為1和0.999,均符合實驗要求。由于在豬基因組中GAPDH基因為單拷貝基因,基因組中存在同源染色體。而NEO基因作為外源基因,在其導(dǎo)入基因組的過程中,只能隨機(jī)插入同源染色體其中的一條染色體上,所以2倍的Quantity(NEO)與Quantity(GAPDH)的比值為NEO基因的拷貝數(shù)。最終得到的6頭死亡轉(zhuǎn)基因仔豬NEO基因的拷貝數(shù)分別為 3、1、2、2、4、5(圖 4B)。

        圖4 6頭死亡轉(zhuǎn)基因仔豬NEO基因拷貝數(shù)Fig.4 Copy number of NEO gene in 6 dead transgenic piglets

        3 討論與結(jié)論

        本研究的轉(zhuǎn)基因克隆豬均因傳染性胃腸炎而在斷奶前死亡,對照組為分娩后因窒息或疫苗應(yīng)激而死亡的大白仔豬。這6頭轉(zhuǎn)基因克隆小豬發(fā)病時表現(xiàn)出集中爆發(fā)、死亡快的特點(表現(xiàn)腹瀉后的1~3 d內(nèi)死亡),所有個體均表現(xiàn)出腹瀉和大便異常的臨床癥狀,另外部分個體還伴有發(fā)燒和咳嗽癥狀中的1個或2個;病理解剖特征均顯示出胃內(nèi)有凝乳和小腸腫脹,少量個體伴有小腸充血(表3,圖2)。這些臨床癥狀和病理解剖癥狀完全符合傳染性胃腸炎的特點[15-16],并未發(fā)現(xiàn)其它非典型癥狀。6頭轉(zhuǎn)基因仔公豬與非轉(zhuǎn)基因大白仔公豬的臟器系數(shù)比較發(fā)現(xiàn),除腎臟系數(shù)(P<0.05)外其余臟器系數(shù)均差異不顯著(P>0.05);且所有類別仔豬臟器系數(shù)均具有較高的變異系數(shù)均值(表4),這與部分有關(guān)豬臟器系數(shù)的研究報道所表現(xiàn)的情況一致[17-18]。轉(zhuǎn)基因或克隆動物的生物安全性備受社會各界的關(guān)注,早期有報道顯示克隆動物中會出現(xiàn)身體器官或機(jī)能異常的現(xiàn)象[19-20];不過在本研究中,沒有證據(jù)表明單純的轉(zhuǎn)基因和(或)克隆技術(shù)對受體豬產(chǎn)生了顯著性的不利影響,這可能也得益于轉(zhuǎn)基因和克隆技術(shù)的快速發(fā)展和進(jìn)步。

        本研究中6頭轉(zhuǎn)基因克隆仔公豬經(jīng)PCR鑒定均含有外源基因序列,可判定為轉(zhuǎn)基因陽性個體,但在外源載體不同位置設(shè)計引物經(jīng)過長片段PCR和常規(guī)PCR擴(kuò)增發(fā)現(xiàn),6頭轉(zhuǎn)基因克隆豬中外源載體序列均不完整,其中4頭小豬在關(guān)鍵的啟動子和CDS區(qū)上發(fā)生了斷裂或缺失,推測外源基因無法獲得正常表達(dá)。這種通過體細(xì)胞克隆法獲得的轉(zhuǎn)基因動物在外源載體插入基因組的過程中發(fā)生斷裂和缺失的現(xiàn)象鮮見報道。當(dāng)前已有的報道顯示,通過顯微注射法獲得轉(zhuǎn)基因動物中易發(fā)生缺失、重復(fù)、重排等轉(zhuǎn)基因異?,F(xiàn)象,而通過體細(xì)胞克隆技術(shù)獲得的轉(zhuǎn)基因動物不會出現(xiàn)外源基因缺失和重排的現(xiàn)象[21]。本研究所獲得的轉(zhuǎn)基因克隆小豬中存在高頻率的外源基因缺失現(xiàn)象,其異常具體是在細(xì)胞轉(zhuǎn)染或(和)體細(xì)胞克隆階段造成的,有待進(jìn)一步的研究。由于轉(zhuǎn)基因豬的外源載體序列發(fā)生了不同程度的斷裂和缺失,本研究針對未出現(xiàn)缺失的NEO區(qū)域利用絕對定量PCR進(jìn)行拷貝數(shù)檢測,結(jié)果顯示6頭小豬的外源基因拷貝數(shù)分別為3、1、2、2、4、5,說明外源基因以隨機(jī)拷貝的形式插入了宿主基因組中,這與眾多的轉(zhuǎn)基因研究中出現(xiàn)的結(jié)果相類似[22]。

        本研究所涉及的轉(zhuǎn)基因事件因外源基因缺失或重排而未獲得最終的成功,也又一次地驗證了傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因和克隆工作的難度和低效性。最近幾年,最新的基因組編輯技術(shù)—轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)蛋白核酸酶(transcription activator-like effector nuclease,TALENs)和聚合定期空間短復(fù)發(fā)重復(fù)相關(guān)系統(tǒng)(CRISPR/Cas9)的出現(xiàn),使得科研工作者對于基因組的任意位點進(jìn)行高效修飾或改變成為可能。特別是CRISPR/Cas9技術(shù),因其方便、快捷、高效和低價的特點而備受科學(xué)工作者的青睞,這類技術(shù)的出現(xiàn)也為我們今后開展類似的工作提供了有力的工具[23]。

        本研究中因傳染性胃腸炎死亡的轉(zhuǎn)基因克隆在發(fā)病時表現(xiàn)出傳染性胃腸炎典型的臨床和病理特征;臟器系數(shù)比較發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)基因克隆豬與普通豬之間只存在微小的差異;經(jīng)PCR鑒定該批豬均為轉(zhuǎn)基因陽性,但所導(dǎo)入的外源載體發(fā)生了不同程度的斷裂或缺失;拷貝數(shù)檢測結(jié)果顯示這批轉(zhuǎn)基因豬中外源基因以不同拷貝數(shù)的形式導(dǎo)入內(nèi)源基因組中。

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